靶向老化細(xì)胞的延衰新策略

祁均梅 楊凱業(yè) 林豪杰 許諾 丁明 胡振林

(1溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2無(wú)限極(中國(guó))有限公司；3溫州大學(xué)生命科學(xué)研究院)

衰老是許多常見(jiàn)疾病包括癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等的主要危險(xiǎn)因素。了解衰老的機(jī)制并加以針對(duì)性的干預(yù)，有助于衰老相關(guān)疾病的防治，但衰老的生物學(xué)機(jī)制極其復(fù)雜，迄今尚未闡明。較早的抗衰老策略主要基于抗氧化應(yīng)激，但膳食補(bǔ)充抗氧化劑臨床試驗(yàn)并沒(méi)有給出明確的結(jié)論。其他的抗衰老策略如熱量限制(CR)，雖然實(shí)驗(yàn)依據(jù)充分，但只能在動(dòng)物身上有效地實(shí)施，難以在人體中有效進(jìn)行。近年來(lái)隨著對(duì)衰老機(jī)制研究的不斷深入，出現(xiàn)了多種新的抗衰老策略，包括靶向調(diào)控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、去乙?；?Sirtuin)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等控制衰老進(jìn)程的信號(hào)通路、誘導(dǎo)自噬、激活端粒酶、激活質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)、表觀遺傳學(xué)調(diào)控、干細(xì)胞療法等。本文對(duì)細(xì)胞老化導(dǎo)致機(jī)體衰老的機(jī)制及針對(duì)老化細(xì)胞延衰策略的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 老化細(xì)胞在體內(nèi)的堆積是機(jī)體衰老的重要因素

機(jī)體衰老通常伴隨著皮膚衰老、行動(dòng)變得遲緩、聽(tīng)覺(jué)嗅覺(jué)的消退等特征。在分子及細(xì)胞水平上，衰老的特征包括基因組的不穩(wěn)定性增加、端粒損耗、線粒體功能失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)狀況感應(yīng)失調(diào)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失、細(xì)胞間通訊改變、細(xì)胞老化和組織再生能力減弱等〔1〕。細(xì)胞老化與機(jī)體衰老有著十分密切的聯(lián)系〔2〕。

細(xì)胞老化可由端?？s短、DNA損傷、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及其他衰老相關(guān)因素誘發(fā)。長(zhǎng)期的細(xì)胞周期阻滯是老化細(xì)胞的最基本特征〔3〕，主要表現(xiàn)為G1 期阻滯，在個(gè)別情況下也可伴隨著G2/M期周期阻滯，或由G2/M期阻滯誘發(fā)形成〔4，5〕。除增殖停滯外，老化細(xì)胞會(huì)持續(xù)表達(dá)一系列促炎細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，稱為老化相關(guān)的分泌表型(SASP)。介導(dǎo)細(xì)胞老化的信號(hào)通路主要是p53/p21CIP1和p16INK4A/Rb通路〔6〕。p53和p16INK4A作為細(xì)胞老化過(guò)程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，能感受細(xì)胞內(nèi)眾多應(yīng)激壓力的改變而被激活，如原癌基因的異常表達(dá)、端粒功能異常、DNA損傷和活性氧(ROS)的累積等〔7〕。在p53所調(diào)控的眾多下游基因中，p21CIP1在細(xì)胞老化中的作用最為突出，它不但可抑制周期蛋白依賴性激酶(CDK)1進(jìn)而誘使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，還可以抑制CDK2和CDK4的活性，降低Rb磷酸化水平，使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入S期〔8〕。在老化細(xì)胞中，非磷酸化的Rb聚集在E2啟動(dòng)結(jié)合因子(E2F)1上，阻止E2F1下游促增殖靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞老化過(guò)程中另一重要的信號(hào)節(jié)點(diǎn)〔9〕。p16INK4A則通過(guò)與CDK4 和CDK6結(jié)合，阻滯其與CyclinD結(jié)合，抑制CyclinD-CDK復(fù)合物的活性，抑制有絲分裂原刺激誘導(dǎo)的Rb蛋白磷酸化，使細(xì)胞阻滯在G1期，從而維持衰老細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)〔10〕。

細(xì)胞老化對(duì)機(jī)體具有正反兩方面的作用。在年輕的生物體內(nèi)，細(xì)胞老化可阻止受損細(xì)胞的增殖，從而防止其進(jìn)一步癌變。同時(shí)，年輕生物體內(nèi)強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)可識(shí)別并及時(shí)地清除掉老化細(xì)胞，防止老化細(xì)胞的積累。另一方面，隨著機(jī)體衰老，端粒不斷縮短，DNA暴露于各種誘變劑的機(jī)會(huì)增多，病毒DNA整合進(jìn)入基因組的概率也增加，造成越來(lái)越多的細(xì)胞進(jìn)入老化狀態(tài)，同時(shí)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能也逐漸衰退，導(dǎo)致大量的老化細(xì)胞不能被及時(shí)清除而在體內(nèi)聚集積累，從而對(duì)組織穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生毒性效應(yīng)，進(jìn)而促使衰老。如在對(duì)小鼠進(jìn)行基因突變誘導(dǎo)早衰時(shí)，發(fā)現(xiàn)其老化細(xì)胞數(shù)量迅速增加，而若敲除其體內(nèi)p16INK4a或p53基因，則早衰表型有所減輕，說(shuō)明兩者通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞老化以促進(jìn)病理性衰老〔11，12〕。

老化細(xì)胞對(duì)機(jī)體的正反兩方面的影響在很大程度上是由于其老化相關(guān)的分泌表型(SASPs)。老化細(xì)胞所分泌的SASP因子由一百多種不同的分泌蛋白組成。一方面，SASP因子可募集自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，有助于清除老化細(xì)胞和鄰近的腫瘤細(xì)胞，即所謂的老化細(xì)胞免疫監(jiān)督功能〔13〕，而且在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，SASP因子可促進(jìn)修復(fù)或限制修復(fù)所致的過(guò)度纖維化，促進(jìn)傷口愈合〔14〕。另一方面，持續(xù)釋放的SASP因子會(huì)導(dǎo)致低水平的炎癥反應(yīng)，引起組織結(jié)構(gòu)的改變和功能的喪失，并引發(fā)一些跟衰老相關(guān)的慢性疾病，如SASP因子中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是直接促成黃斑變性的病理性原因〔15〕；MMP-3和白細(xì)胞介素(IL)-6與骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)〔16〕。老化皮膚細(xì)胞所分泌的 SASP因子的重要組成成分MMPs能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性纖維、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和板層素膠原纖維等，這些變化使得皮膚的支撐結(jié)構(gòu)喪失，皮膚彈性下降，導(dǎo)致老化皮膚松弛和皺紋形成〔17〕。

2 靶向清除老化細(xì)胞或抑制其SASP表型具有顯著的延衰作用

在不同的組織器官中，老化細(xì)胞會(huì)隨著年齡的增加而積聚，且由于老化細(xì)胞持續(xù)釋放的SASP因子會(huì)影響到周?chē)M織的結(jié)構(gòu)和功能，因此老化細(xì)胞的積累是衰老及相關(guān)疾病的重要病理基礎(chǔ)，而靶向清除老化細(xì)胞能有效地改善老年機(jī)體的衰老癥狀〔18，19〕。

2.1選擇性老化細(xì)胞溶解劑-Senolytics的延衰作用 老化細(xì)胞之所以能夠在增殖停滯狀況下持續(xù)存活而不發(fā)生死亡或凋亡，主要是由于其細(xì)胞內(nèi)的促存活或者抗凋亡信號(hào)通路過(guò)度活化所致，包括Ephrin(EFN)B 、B細(xì)胞淋巴瘤超大蛋白(Bcl)-xl、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、p21WAF1、纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)-2等信號(hào)通路〔20〕，因此這些信號(hào)通路的抑制劑有可能選擇性地誘導(dǎo)老化細(xì)胞凋亡，進(jìn)而溶解老化細(xì)胞〔21〕，而這些能夠選擇性誘導(dǎo)老化細(xì)胞溶解的藥物就被稱為Senolytics。Ephrin B抗凋亡通路的抑制劑達(dá)沙替尼是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Senolytics，Zhu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼與槲皮素(PI3K通路抑制劑)聯(lián)合使用可選擇性地誘導(dǎo)老化細(xì)胞凋亡，有效減緩衰老小鼠模型的衰老進(jìn)程，延長(zhǎng)治療小鼠的壽命。隨后，多種Senolytics被發(fā)現(xiàn)，如Zhu等〔22〕發(fā)現(xiàn)Navitoclax能抑制Bcl-2、Bcl-w及Bcl-xl活性，進(jìn)而阻止老化細(xì)胞繼續(xù)存活。Baker等〔18〕發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因INK-ATTAC快速衰老小鼠模型中，使用小分子AP20187通過(guò)膜結(jié)合的肉豆蔻?；疐K506結(jié)合蛋白(fkbp)-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)8二聚反應(yīng)誘導(dǎo)老化細(xì)胞凋亡，清除p16陽(yáng)性的老化細(xì)胞，可使小鼠年輕6個(gè)月，相當(dāng)于人類(lèi)年輕數(shù)十年。Baar等〔19〕用小干擾RNA(siRNA)敲減p53的抑制蛋白叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FOX)O4或者以小肽阻斷FOXO4與p53的結(jié)合從而激活p53的促凋亡活性，發(fā)現(xiàn)能選擇性地誘導(dǎo)老化細(xì)胞凋亡，體內(nèi)給予這種老化細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)肽能顯著改善快速衰老轉(zhuǎn)基因小鼠和自然老化小鼠的衰老癥狀，包括腎功能和毛發(fā)密度等，并且沒(méi)有產(chǎn)生任何不良反應(yīng)。迄今，已經(jīng)報(bào)道的Senolytics已累計(jì)十幾種，包括小分子、抗體和多肽等。這些新的研究表明機(jī)體組織器官的衰老與老化細(xì)胞的堆積直接相關(guān)，而靶向清除這些老化細(xì)胞具有顯著的延衰作用，甚至可使機(jī)體年輕化。值得注意的是，每種Senolytics只對(duì)特定組織來(lái)源的老化細(xì)胞有效，因此針對(duì)不同的老年疾病，可能需要不同類(lèi)型的Senolytics。與其他的延衰策略相比，直接靶向清除老化細(xì)胞存在以下優(yōu)勢(shì)：理論上只需定期應(yīng)用Senolytics清除衰老細(xì)胞即可起到延衰作用，可減輕或避免不良反應(yīng)的產(chǎn)生；與癌癥治療不同，衰老相關(guān)疾病防治無(wú)需清除組織中所有的老化細(xì)胞，動(dòng)物研究表明〔23〕，清除部分老化細(xì)胞就足以產(chǎn)生顯著的抗衰老效應(yīng)；Senolytics只影響已存在的老化細(xì)胞，而不會(huì)影響這類(lèi)細(xì)胞的形成，這意味著老化細(xì)胞本身所具有的腫瘤抑制功能仍可保留。

2.2抑制SASP表型也可產(chǎn)生延衰作用 由于老化細(xì)胞對(duì)機(jī)體的不良作用主要由其分泌的SASP因子所介導(dǎo)，因此抑制老化細(xì)胞的SASP表型也可能產(chǎn)生延衰效應(yīng)。有研究表明，老化細(xì)胞的SASP表型與多條信號(hào)通路的過(guò)度活化有關(guān)，包括p38 MAPK、MK2〔24〕激酶、核因子(NF)-κB〔25〕、IL-1A〔26〕、CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)β〔27〕、Sirt1〔28〕及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化還原平衡〔29〕等。已經(jīng)報(bào)道一些植物天然化合物能通過(guò)抑制上述信號(hào)通路來(lái)抑制老化細(xì)胞的SASP表型，如NF-κB通路抑制劑包括芹菜素(apigenin)、漢黃芩素(wogonin)等〔25〕，IL-1A信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素(rapamycin)〔26〕及Sirt1激活劑白藜蘆醇(resveratrol)〔30〕均能通過(guò)抑制老化細(xì)胞的SASP表型來(lái)發(fā)揮一定的延衰作用。

3 增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)督功能是靶向清除老化細(xì)胞的潛在途徑

老年機(jī)體內(nèi)的老化細(xì)胞之所以能持續(xù)存在，一定程度上是由于老年機(jī)體的免疫系統(tǒng)機(jī)能降低，不能及時(shí)清除不斷形成的老化細(xì)胞所致。其實(shí)，在年輕機(jī)體組織中老化細(xì)胞也會(huì)不斷產(chǎn)生，但可被免疫細(xì)胞及時(shí)清除，因此老化細(xì)胞不會(huì)堆積。但老年機(jī)體免疫力下降，不能及時(shí)清除老化細(xì)胞，致使老化細(xì)胞不斷堆積。

正常生理情況下，機(jī)體的免疫細(xì)胞能夠識(shí)別并及時(shí)清除老化細(xì)胞，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，免疫系統(tǒng)的該項(xiàng)功能被稱為老化細(xì)胞免疫監(jiān)督功能〔31〕。執(zhí)行該功能的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等特異性免疫細(xì)胞〔31〕。NK細(xì)胞是目前最為明確的執(zhí)行老化細(xì)胞免疫監(jiān)督功能的非特異性免疫細(xì)胞，在NK細(xì)胞和誘導(dǎo)老化的肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，可直接觀測(cè)到NK細(xì)胞對(duì)老化細(xì)胞的選擇性殺傷作用〔32〕。NK細(xì)胞最早被發(fā)現(xiàn)能以不依賴主要組織相容性抗原的方式殺傷腫瘤細(xì)胞和感染了病毒的細(xì)胞，因此一直被認(rèn)為是機(jī)體免疫防御的第一道重要防線。隨后研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞在應(yīng)激狀況下都會(huì)上調(diào)一些應(yīng)激蛋白如主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類(lèi)相關(guān)鏈(MIC)A和UL16結(jié)合蛋白(ULBP)2的表達(dá)，而這些應(yīng)激蛋白可被NK細(xì)胞表面的NK細(xì)胞活化性受體2群成員(NKG2D)受體識(shí)別，進(jìn)而介導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)應(yīng)激細(xì)胞的清除。最近的研究發(fā)現(xiàn)老化細(xì)胞也會(huì)高表達(dá)這些應(yīng)激蛋白并被NK細(xì)胞的NKG2D受體識(shí)別，進(jìn)而以顆粒胞吐作用的方式殺滅老化細(xì)胞〔33〕。在小鼠肝纖維化模型的實(shí)驗(yàn)研究中，NK細(xì)胞顆粒胞吐作用的缺陷和NKG2D的基因敲除均會(huì)導(dǎo)致老化的星狀細(xì)胞在肝臟的堆積和肝纖維化的加劇〔33〕。

除NK細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞在老化細(xì)胞免疫監(jiān)督中的作用也引起了越來(lái)越多的關(guān)注〔31〕。巨噬細(xì)胞是功能強(qiáng)大的吞噬細(xì)胞，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞一樣能夠被募集至老化細(xì)胞周?chē)?，并介?dǎo)對(duì)老化細(xì)胞的清除。耗竭小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致老化細(xì)胞免疫監(jiān)督功能極大地削弱，致使老化細(xì)胞的堆積，在老化細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，老化細(xì)胞能夠影響巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)其靶向殺傷老化細(xì)胞〔34〕。巨噬細(xì)胞識(shí)別老化細(xì)胞的機(jī)制可能與其識(shí)別凋亡細(xì)胞的機(jī)制類(lèi)似，凋亡細(xì)胞會(huì)表達(dá)一些特定的細(xì)胞表面抗原作為“eat me”信號(hào)，被巨噬細(xì)胞的清除劑受體識(shí)別，介導(dǎo)其對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬清除。與之類(lèi)似，老化細(xì)胞也會(huì)特異表達(dá)某些表面抗原，包括氧化修飾的膜蛋白vimentin和氧化修飾的脂質(zhì)等，其可作為模式識(shí)別配體被巨噬細(xì)胞的清除劑受體CD36和晚基糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)等識(shí)別，介導(dǎo)其對(duì)老化細(xì)胞的吞噬清除〔31〕。隨著年齡的增加，上述免疫細(xì)胞的遷移能力和殺傷靶細(xì)胞的功能會(huì)逐漸減弱，因此不可避免地導(dǎo)致老化細(xì)胞在體內(nèi)堆積，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官的功能衰退。鑒于免疫細(xì)胞在靶向清除老化細(xì)胞中的重要作用，免疫增強(qiáng)策略將有利于靶向清除老化細(xì)胞以延緩衰老和緩解老年相關(guān)的疾病。這一概念近年來(lái)已經(jīng)取得了一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持，如在肝纖維化小鼠實(shí)驗(yàn)中，給予免疫激活劑能夠加強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的老化星狀細(xì)胞的清除，緩解模型小鼠的肝纖維化〔35〕。

綜上，與延長(zhǎng)壽命相比，發(fā)展病理性衰老的防治方法更加有益。細(xì)胞老化與機(jī)體衰老的關(guān)系非常密切，而靶向老化細(xì)胞的抗衰老策略有望成為安全高效的延衰新策略，該策略主要包括應(yīng)用Senolytics直接清除老化細(xì)胞、抑制老化細(xì)胞的SASP表型和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的老化細(xì)胞免疫監(jiān)督功能促進(jìn)其間接清除老化細(xì)胞等方法。盡管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了很好的延衰效果，該策略在應(yīng)用于人類(lèi)之前還需要大量長(zhǎng)期的臨床研究。