艾滋病疫苗研究面臨的挑戰(zhàn)和進(jìn)展*

張 喬，陳國兵，牛海濤，羅鈞洪，梁曉峰，高 峰△

（暨南大學(xué)1分子醫(yī)學(xué)病毒研究所，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院微生物與免疫學(xué)系老年免疫學(xué)研究所，3實(shí)驗(yàn)動物管理中心，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)系，5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東廣州510632）

艾 滋 ?。╝cquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人免疫缺陷病毒（human immunodeficien‐cy virus，HIV）攻擊機(jī)體免疫系統(tǒng)所引發(fā)的一類傳染性疾病。HIV-1通過特異性感染CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)而摧毀機(jī)體的免疫功能，最終誘導(dǎo)多種并發(fā)癥的出現(xiàn)，例如結(jié)核、肺炎、細(xì)菌感染以及血液系統(tǒng)腫瘤等［1］。最新WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截止2019底，全球約有3 800萬HIV-1感染者，其中包括180萬兒童；2019年新發(fā)感染者170萬，死于艾滋導(dǎo)致的并發(fā)癥人數(shù)達(dá)到69萬人［2］。更為嚴(yán)峻的是，聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署制定的2020年90/90/90目標(biāo)（90%HIV-1感染者得到確診，90%確診病人得到治療，90%治療病人的病毒血癥得到控制）也宣告失敗，預(yù)示攻克艾滋病仍任重道遠(yuǎn)。

盡管與艾滋病大流行的斗爭即將邁入第40個(gè)年頭，但是目前人類仍無法完全治愈艾滋病。在抗HIV病毒藥物領(lǐng)域，科學(xué)家們?nèi)〉昧司薮蟪删?，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒雞尾酒療法（combination antiretroviral ther‐apy，cART）的出現(xiàn)成功將艾滋病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N長期可控性疾病，顯著提高了患者的生存率［3］。然而患者需終身服藥所伴隨一系列的副作用如神經(jīng)性病變、胰腺炎或骨質(zhì)疏松等顯著影響了患者生活質(zhì)量和壽命［4-6］。此外，經(jīng)濟(jì)發(fā)展不平衡也增加了艾滋病治療的困難。在重災(zāi)區(qū)南非，死于艾滋病的人數(shù)占全國總死亡人數(shù)的28%，而歐洲則低于0.1%［7］。面對艾滋病大流行，國際已形成廣泛共識：有效的預(yù)防性艾滋病疫苗是終結(jié)艾滋病流行的最有效手段。

2009年，艾滋病疫苗III期臨床試驗(yàn)（RV144）結(jié)果顯示該疫苗具有一定程度的預(yù)防效果，這是科學(xué)家第一次在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)可檢測到的保護(hù)效果［8］。盡管保護(hù)效率只有31%，但是也給艾滋病疫苗研究領(lǐng)域帶來了鼓舞和希望。然而遺憾的是，研究人員最近在南非開展的III期臨床重復(fù)試驗(yàn)（HVTN 702）數(shù)據(jù)顯示，相較于對照組，疫苗接種組沒有保護(hù)效果［9］。盡管前期的I、II期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示疫苗誘導(dǎo)了細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，但是III期試驗(yàn)失敗提示疫苗誘導(dǎo)廣譜中和抗體（broadly neutralizing anti‐body，bnAb）的重要性。多次III期臨床試驗(yàn)的相繼失敗促使疫苗學(xué)家逐步加強(qiáng)疫苗與免疫學(xué)的理論研究并在研究bnAb以及抗體進(jìn)化機(jī)制中取得了重大進(jìn)展。bnAb能有效中和多種異源性HIV-1毒株，具有高效的抗病毒效果，目前誘導(dǎo)bnAb已成為下一代HIV-1疫苗設(shè)計(jì)的核心問題。但是，現(xiàn)階段在所有實(shí)驗(yàn)動物和人類中尚沒有任何一種疫苗能夠成功誘導(dǎo)針對難以中和的多種異源性HIV-1 tier-2毒株的bnAb。因此，通過免疫原來誘導(dǎo)bnAb已成為目前艾滋病疫苗研發(fā)的核心科學(xué)問題與挑戰(zhàn)。本文總結(jié)了現(xiàn)今HIV-1疫苗研究面臨的困境以及新的研究進(jìn)展，期望為HIV疫苗的后續(xù)研究提供新的思路。

1 缺乏理想的動物模型

臨床前動物模型評價(jià)是疫苗研究重要環(huán)節(jié)之一。目前，HIV-1病毒無法在動物內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致HIV-1候選疫苗缺乏理想的動物評價(jià)模型。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）在感染、傳播和潛伏期方面與HIV-1病毒非常相似，通過將HIV-1膜蛋白基因（env）取代SIV基因組中的相應(yīng)env，研究人員成功建立了嵌合病毒（simian/human immunodeficiency virus，SHIV）感染非人靈長類（nonhuman primates，NHP）動物模型。SHIV感染模型在HIV-1疫苗保護(hù)評價(jià)、誘導(dǎo)bnAb及其進(jìn)化研究中得到了廣泛應(yīng)用。然而，SHIV感染方式、劑量以及時(shí)間參數(shù)都可顯著影響疫苗評價(jià)結(jié)果［10］。

HIV-1在自然傳播過程中主要通過性接觸暴露黏膜表面進(jìn)而發(fā)生感染。但由于血液中存在大量具有感染性的病毒顆粒，經(jīng)血傳播具有更高的傳染性。目前，臨床前動物評價(jià)主要采用黏膜和靜脈注射方式，而前者應(yīng)用更加廣泛。單次高劑量（single highdose，SHD）感染在研究早期得到了廣泛應(yīng)用，但是其存在明顯缺陷。盡管SHD能達(dá)到接近100%感染率，但是過高的病毒滴度減弱了疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用，進(jìn)而顯著低估候選疫苗的保護(hù)效價(jià)［11-12］。另外，SHD與HIV-1正常感染過程也相差甚遠(yuǎn)。正常情況下，性接觸導(dǎo)致的HIV-1感染率較低，陽性男性患者精液的病毒平均數(shù)約為每毫升11 000個(gè)拷貝，而在動物模型中，即使低劑量病毒（TCID50小于250），其每毫升拷貝數(shù)也超過1百萬，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常感染過程中的病毒滴度［13-14］。因此SHD不能很好地模擬HIV-1病毒正常傳播過程。低劑量重復(fù)（re‐peated low-dose，RLD）感染由于能較好模擬HIV-1病毒自然感染過程已經(jīng)成為臨床前動物評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法。RLD通過低劑量重復(fù)感染使未免疫對照組所有或大部分猴建立感染，可更好地再現(xiàn)人類HIV-1粘膜感染的過程與特征。因而在有限的動物數(shù)量情況下，RLD模型能較敏感地評價(jià)疫苗的保護(hù)效果。模擬研究顯示，RLD模型只需要50只猴（每組25只）就可以達(dá)到足夠的統(tǒng)計(jì)能力檢測到候選疫苗的50%保護(hù)效果，這大大增加后續(xù)臨床試驗(yàn)成功的可能性［15］。

病毒感染滴度和頻率是影響RLD模型評價(jià)的關(guān)鍵因素。不同研究團(tuán)隊(duì)使用的病毒感染滴度存在很大偏差，有效TCID50值可能相差10倍以上，可能的解釋是不同的傳代次數(shù)和體外擴(kuò)增方法影響了病毒的感染力［14，16］。因此，在試驗(yàn)前確定準(zhǔn)確的病毒感染滴度對試驗(yàn)成敗至關(guān)重要。目前大部分研究采用每周一次的感染頻率來建立感染模型，未免疫猴的初次感染率一般在20%～40%范圍內(nèi)，采用該感染方式可以較好地評價(jià)候選疫苗的保護(hù)效價(jià)。研究顯示單劑量接種導(dǎo)致的SIV感染一般發(fā)生在5～14 d內(nèi)［17］。如果采用兩周一次的感染頻率感染猴，分別在第6、10和14天檢測動物的血清轉(zhuǎn)化指標(biāo)，結(jié)果顯示74%的陽性轉(zhuǎn)化發(fā)生在10 d之后［17］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明每周1次的感染頻率可能會過高估計(jì)免疫的保護(hù)作用，采用兩周1次的感染頻率以及更頻繁的指標(biāo)檢測可取得更準(zhǔn)確的評價(jià)效果。盡管RLD模型可較好地評價(jià)疫苗保護(hù)效果，但是仍存在一些限制性因素導(dǎo)致其評價(jià)效果很難在人類臨床試驗(yàn)中完全再現(xiàn)：（1）模型采用的SHIV不能完全模擬HIV-1病毒感染過程；（2）不同SHIV毒株間的感染和致病能力差別很大，因此選用不同的SHIV毒株可對疫苗評價(jià)產(chǎn)生非常大的影響；（3）該模型的初次感染率仍顯著高于HIV-1的自然感染率，接種采用的低劑量病毒滴度也遠(yuǎn)高于感染者陰道分泌物或精液中的病毒含量。然而，如果通過進(jìn)一步減小病毒滴度來降低感染率的話，將會顯著延長研究時(shí)間，大大增加研究費(fèi)用。眾多影響因素導(dǎo)致的不確定性迫使人們通過提高動物樣本數(shù)來獲得具有顯著差異的統(tǒng)計(jì)能力，期望能更有效地評價(jià)疫苗的保護(hù)效果。

2 HIV-1包膜蛋白自身不足以誘導(dǎo)廣譜中和抗體

HIV-1具有高度的基因序列多樣性，導(dǎo)致其預(yù)防性疫苗必須具有廣譜的免疫保護(hù)能力。在慢性HIV-1感染者中，約有10%左右的感染者會自然產(chǎn)生bnAb，通常在感染2～4年后才會出現(xiàn)，僅在兒童體內(nèi)偶有感染1年內(nèi)即產(chǎn)生bnAb的報(bào)道［18-19］。新的研究證據(jù)也表明，感染者體內(nèi)的中和抗體需要經(jīng)過長期的體細(xì)胞高頻突變（somatic hypermutation，SHM）積累，才能獲得廣譜性和中和強(qiáng)度。分析進(jìn)化過程中抗體序列顯示抗體中和強(qiáng)度和廣度與SHM的積累成正相關(guān)，表明長期的SHM積累對HIV-1中和抗體廣譜性的獲得是必要的［20-21］。由于HIV-1包膜蛋白（Env）固有的弱免疫原性以及抗體進(jìn)化等限制性因素，現(xiàn)有免疫策略仍無法誘導(dǎo)針對HIV-1的bnAb的產(chǎn)生。

HIV-1的Env由gp120和gp41兩部分構(gòu)成，存在于病毒表面的包膜蛋白由3個(gè)單體通過非共價(jià)鍵形成三聚體結(jié)構(gòu)；gp120位于包膜外側(cè)主要負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞受體，而gp41負(fù)責(zé)將整個(gè)膜結(jié)構(gòu)錨定在病毒膜表面，負(fù)責(zé)病毒和細(xì)胞融合。目前的Env三聚體免疫原尚無法有效誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)，主要原因在于其固有的弱免疫原性無法誘導(dǎo)較高的抗體中和免疫反應(yīng)。采用相同條件免疫HIV-1 gp120與狂犬病病毒G蛋白時(shí)，HIV-1 gp120誘導(dǎo)的IgG和IgA水平低于G蛋白［22］。對比乙肝表面抗原疫苗，盡管gp120在狒狒體內(nèi)誘導(dǎo)了相似水平的抗體反應(yīng)，但是其抗體濃度下降率明顯快于乙肝抗原，原因可能是gp120誘導(dǎo)了較少數(shù)量的長效漿細(xì)胞［23］。以上數(shù)據(jù)表明，相較于其它病毒性抗原，gp120具有較弱的免疫原性從而無法誘導(dǎo)持續(xù)的抗體反應(yīng)。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，高分辨率Env空間結(jié)構(gòu)的解析促進(jìn)了HIV-1免疫原的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過結(jié)構(gòu)修飾，人們制備了更加穩(wěn)定的類似天然Env的三聚體（例如SOSIP和UFO）［24-25］。冷凍電鏡分析顯示SOSIP.664具有和病毒顆粒Env高度類似的空間構(gòu)象，目前已作為HIV-1免疫原設(shè)計(jì)的主要結(jié)構(gòu)前體被廣泛使用。由于提高了三聚體在體內(nèi)的穩(wěn)定性以及抗原表位展示，SOSIP.664具有更好的免疫原性。在多種動物如兔子、豚鼠以及猴模型中，SOSIP.664三聚體結(jié)構(gòu)首次誘導(dǎo)了同源Tier 2病毒中和反應(yīng)，但是對異源病毒的中和反應(yīng)仍在很少的情況下被觀察到［24，26-27］。

導(dǎo)致HIV-1 Env弱免疫原性的原因目前仍不清楚。大量證據(jù)顯示Env的高度糖基化修飾是一個(gè)重要因素。對比來看，流感病毒血凝素單體大約含有3個(gè)聚糖分子，呼吸道合胞病毒融合蛋白有5～6個(gè)聚糖分子，而HIV-1 Env單體含有近30個(gè)聚糖分子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于許多其它病原膜蛋白［28］。由于糖基不能有效地被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，具有免疫耐受性，因此高度糖基化的Env無法有效激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。中和抗體的進(jìn)化成熟需要經(jīng)過抗體基因高變區(qū)（V）的高頻突變積累產(chǎn)生各種B細(xì)胞克隆，這個(gè)過程需要輔助性T細(xì)胞Th2激活體液免疫來實(shí)現(xiàn)。輔助性T細(xì)胞通過受體特異性識別抗原呈遞細(xì)胞上的輔助性T細(xì)胞表位（Thelper cell epitope，THCE）從而促進(jìn)Th1或Th2的激活，而位于抗原水解位點(diǎn)附近的聚糖分子通過形成空間位阻阻止蛋白酶的水解，影響抗原表位的釋放，最終抑制體液免疫的激活［29-30］。細(xì)胞內(nèi)廣泛分布各種糖分子結(jié)合蛋白凝集素，研究發(fā)現(xiàn)甘露糖結(jié)合凝集素高親和性結(jié)合SOSIP膜蛋白聚糖表位，減弱Env的免疫原性，抑制了中和抗體的產(chǎn)生［31］。

HIV-1膜蛋白分子gp120介導(dǎo)的免疫逃逸也影響Env免疫原性，gp120基因的高頻突變可逃逸免疫壓力。即便當(dāng)氨基酸的改變不顯著影響gp120的正常生理功能時(shí)，也可促進(jìn)HIV-1對中和抗體產(chǎn)生逃逸［32］。機(jī)體通過激活天然免疫促進(jìn)適應(yīng)性免疫保護(hù)，疫苗佐劑的增強(qiáng)效應(yīng)主要利用該過程來實(shí)現(xiàn)。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞胞內(nèi)的TLR9受體識別寡聚脫氧核苷酸CpG，促進(jìn)了I型干擾素和促炎癥因子的表達(dá)，最終導(dǎo)致B細(xì)胞的活化。該過程中，gp120通過與樹突狀細(xì)胞表面的CD4以及甘露糖凝集素受體結(jié)合下調(diào)相關(guān)促炎癥因子的表達(dá)，抑制B細(xì)胞的激活，可影響TLR9受體激動劑類佐劑在HIV-1疫苗中的應(yīng)用［33］。值得注意的是，在免疫初期，疫苗注射位點(diǎn)的gp120局部濃度很高，與CD4受體相互作用的增強(qiáng)可能進(jìn)一步加劇對B細(xì)胞活化的抑制。研究顯示，抑制gp120與CD4受體的親和力可提高DS-SOS‐IP.4mut抗原的免疫原性［34］。Gp120的W427S突變體可抑制gp120與CD4受體的結(jié)合，采用野生型和W427S突變體分別免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，野生型免疫原誘導(dǎo)了更高水平的非特異性輔助性濾泡T細(xì)胞、漿細(xì)胞以及血清IgG抗體，相較之下，突變體免疫原可誘導(dǎo)更高水平的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［35］。

增強(qiáng)抗原免疫原性將有助于誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗體反應(yīng)。將破傷風(fēng)疫苗的T細(xì)胞表位肽段整合到含有HIV-1 Env免疫原的類病毒顆粒中，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，含有THCE的類病毒顆粒激活了更強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)，顯著提高了針對Env的IgG1抗體表達(dá)水平［36］。由于破傷風(fēng)疫苗在人群中廣泛接種，相應(yīng)的記憶性T細(xì)胞可能會進(jìn)一步加強(qiáng)該類病毒顆粒的免疫反應(yīng)。利用納米顆粒的多價(jià)結(jié)合也可有效提高抗原在體內(nèi)的呈遞效率，進(jìn)而激活更強(qiáng)的B細(xì)胞反應(yīng)，因此該材料在疫苗領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［37-39］。呼吸道合胞病毒的納米抗原將中和抗體水平提高了10倍以上［37］。將不同流感病毒株來源的HA受體結(jié)合位點(diǎn)整合形成的馬賽克疫苗，顯著提高了抗體的中和廣度［38］。但是，HIV-1 Env制備的納米顆粒僅能將中和抗體滴度提高3倍左右，較其它病毒相差甚遠(yuǎn)，原因可能是Env聚糖分子的位阻效應(yīng)和與凝集素的廣泛結(jié)合［39］。疫苗佐劑可以顯著增加疫苗的免疫原性，但是目前應(yīng)用最廣泛的鋁佐劑可破壞HIV-1 Env的結(jié)構(gòu)完整性，可能是其不能誘導(dǎo)bnAb的主要原因之一［40］。盡管如此，在SHIV感染猴模型中，一種新型的脂質(zhì)體鋁佐劑ALFA的保護(hù)效價(jià)達(dá)到90%，而鋁佐劑對照組沒有保護(hù)效果［41］。目前多種不同形式的鋁佐劑和HIV-1疫苗組合正處于臨床評價(jià)階段，除此之外，突變型大腸桿菌耐熱毒素、AS01b、ALF43等多種佐劑也處于臨床評價(jià)階段［42-43］。

免疫原緩釋作為一種有吸引力的免疫方式在HIV疫苗研究中逐漸受到重視［44］。相較于傳統(tǒng)的間斷性免疫方式，它更接近于自然感染中的抗原提呈過程，可能引起更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，提高抗原的免疫原性。在小鼠體內(nèi)，采用非機(jī)械性滲透泵持續(xù)緩釋抗原兩周，重復(fù)3次后檢測發(fā)現(xiàn)，相較于少數(shù)間斷注射，緩釋免疫顯著提高了輔助性濾泡T細(xì)胞TFH和生發(fā)中心B細(xì)胞的數(shù)量，而IgG抗體水平提高15倍［45］。同一研究小組進(jìn)一步在猴模型中采用兩種緩釋模型驗(yàn)證了該免疫方式的增強(qiáng)效應(yīng)［46］。與小鼠模型類似，抗原緩釋顯著增強(qiáng)了生發(fā)中心TFH和B細(xì)胞響應(yīng)動力學(xué)，同源Tier 2病毒中和抗體水平提高20倍以上。更為重要的是，通過對Env特異性B細(xì)胞進(jìn)行二代測序發(fā)現(xiàn)，緩釋誘導(dǎo)了更多種類的Env特異性B細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致中和抗體的多樣性。然而出乎意料的是，與對照組相比，二者的體細(xì)胞SHM相似。通過抗原示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，緩釋顯著延長了抗原在淋巴系統(tǒng)的滯留時(shí)間，表明抗原的更多中和表位被有效呈遞，提高了中和抗體的多樣性［46］。

3 HIV-1包膜蛋白保守表位可促進(jìn)廣譜中和抗體的進(jìn)化成熟

HIV-1病毒序列的多樣性要求其疫苗具有廣譜免疫保護(hù)能力。近年來，研究人員相繼從感染者體內(nèi)分離到許多bnAb并鑒定了與之作用的抗原保守表位，主要包括CD4結(jié)合區(qū)（CD4 binding site，CD4bs），V1V2，V3C3，gp41膜近端外膜區(qū)和gp120-gp41結(jié)合區(qū)［47］。利用HIV-1重組gp120抗原RSC3，通過單個(gè)B細(xì)胞分選，研究人員從HIV-1患者體內(nèi)篩選出針對gp120 CD4bs的單抗VRC01，其廣譜中和能力高達(dá)91%［48］。目前來看，靶向CD4bs的bnAb分離頻率較高，原因可能是病毒需要充分暴露保守的CD4bs促進(jìn)與靶細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而有效地遞呈該表位，并誘導(dǎo)特異性bnAb的產(chǎn)生。比較來自于14名艾滋患者的16個(gè)CD4bs特異性bnAb發(fā)現(xiàn)，盡管這些抗體的堿基序列存在巨大差異，但是其空間結(jié)構(gòu)基本相似［49］，這也解釋了為什么它們都具有特異性識別CD4bs表位的能力。盡管它們之間具有高度的序列差異性，它們間的功能相似性表明它們通過不同的進(jìn)化途徑獲得結(jié)合CD4bs表位的能力，最終能夠廣譜地中和大多數(shù)病毒株。

近來研究發(fā)現(xiàn)抗HIV-1 bnAb的產(chǎn)生需要一個(gè)長期進(jìn)化成熟過程，生物信息學(xué)和單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展使得我們有機(jī)會探索它們的進(jìn)化成熟過程。通過測序比較艾滋患者不同時(shí)期來源的血清B細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，中和抗體廣譜性的獲得要求SHM的大量積累。當(dāng)遭遇抗原后，B細(xì)胞通過SHM極大提高B細(xì)胞種類的多樣性，理論上可以達(dá)到1012不同種類，而龐大的B細(xì)胞庫保證了與TFH的有效識別和bnAb克隆篩選。CH103在2.5年時(shí)間內(nèi)積累了17%的SHM從而獲得了中和55%病毒的能力［20］，而CH235則在6年時(shí)間內(nèi)積累了25.6%的SHM從而獲得了中和90%病毒的能力［21］。由此可見，SHM的積累對bnAb的產(chǎn)生至關(guān)重要。

由于SHM的產(chǎn)生是隨機(jī)事件，那么中和抗體是如何逐漸提高針對特定保守表位的中和能力呢？患者體內(nèi)的HIV-1病毒通過不斷突變來獲得逃逸機(jī)體免疫壓力的能力。事實(shí)上，從患者體內(nèi)分離的bnAb并不能有效地中和患者體內(nèi)當(dāng)時(shí)存在的病毒，也不能降低患者體內(nèi)的病毒滴度和緩解疾病進(jìn)展，這表明bnAb的突變并不是以提高中和抗體的廣譜性為目的［50］，但是病毒突變導(dǎo)致的多樣性在促進(jìn)中和抗體廣譜性中起著重要作用［20，51，52］。有研究還顯示，超級感染導(dǎo)致的病毒多樣性與病毒重組可顯著提高抗體的中和廣度［53-54］。為了獲得中和廣度，中和抗體需要攻擊Env結(jié)構(gòu)上的保守表位，那些靶向其它非保守表位的抗體盡管可以不斷進(jìn)化，但是并不會獲得廣譜的中和能力，這也解釋了為何從病人分離得到bnAb的概率偏低。不同時(shí)期的CH235抗體和Env共晶體結(jié)構(gòu)顯示，早期進(jìn)化的CH235可以識別CD4的核心以及外圍區(qū)域，但是隨著抗體的不斷進(jìn)化，抗體識別膜蛋白上的表位逐漸縮小，最終進(jìn)化的CH235僅主要識別高度保守的、所有HIV-1毒株共有的CD4bs而不再受CD4b s外圍變異區(qū)域的影響，從而能夠結(jié)合并中和大多數(shù)病毒，獲得中和HIV-1的廣譜性［21］。病毒通過刪除V2區(qū)在第160位點(diǎn)聚糖修飾位點(diǎn)進(jìn)一步暴露了CD4bs，從而促進(jìn)CD4bs中和抗體的成熟［55］。另外，延長抗原在淋巴系統(tǒng)的滯留時(shí)間，促使抗原保守表位被更有效呈遞，最終可增加中和抗體的多樣性［46］。以上數(shù)據(jù)表明，抗原表位的充分暴露對bnAb產(chǎn)生至關(guān)重要。但是目前機(jī)體免疫系統(tǒng)如何“存檔”已獲得的表位信息，并進(jìn)一步完善表位信息的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，例如存檔信息是否提高TFH與特異性B細(xì)胞的結(jié)合。綜上所述，盡管病毒突變與B細(xì)胞SHM屬于隨機(jī)事件，但是包膜蛋白上的高度保守表位仍然可在特定條件下誘導(dǎo)廣譜中和抗體的進(jìn)化成熟。

4 廣譜中和抗體的進(jìn)化機(jī)制及其在新型疫苗設(shè)計(jì)中的意義

盡管已從HIV-1感染者體內(nèi)分離到許多bnAb，但是目前所有的免疫原在動物模型以及人體內(nèi)尚不能誘導(dǎo)bnAb產(chǎn)生。為了探索誘導(dǎo)bnAb產(chǎn)生的進(jìn)化過程，研究者通過單細(xì)胞和高通量測序方法獲得bnAb成熟過程中產(chǎn)生的大量抗體基因序列，繪制抗體進(jìn)化譜系，最終演繹bnAb的進(jìn)化成熟過程。我們曾從一名非洲HIV-1 C亞型奠基病毒感染者（CH505）體內(nèi)分離到CD4bs靶向的bnAb（CH103），通過中和抗體譜系分析，病毒進(jìn)化分析和抗原-抗體共結(jié)晶等手段，首次描述了奠基病毒與bnAb共進(jìn)化及其成熟過程，并在后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明了不同譜系B細(xì)胞之間的協(xié)同作用以及抗體從胚系到bnAb的成熟機(jī)制［20，21，52］。識別相同或其它表位bnAb的進(jìn)化成熟機(jī)制也陸續(xù)得到闡釋，證實(shí)并擴(kuò)展了病毒與bnAb的共進(jìn)化機(jī)制［51，56］。分泌HIV-1廣譜中和抗體的B細(xì)胞在體內(nèi)完成抗體基因重排并形成胚系共同進(jìn)化祖先（unmutated common ancestor，UCA）后，需要在B細(xì)胞生發(fā)中心積累許多SHM來完成漫長的進(jìn)化成熟過程?；谏鲜鯾nAb進(jìn)化成熟機(jī)制的研究，目前提出了基于B細(xì)胞譜系的免疫原設(shè)計(jì)方案：首先從記憶B細(xì)胞中分離高效的bnAb；其次繪制其進(jìn)化譜系推斷胚系共同祖先和進(jìn)化中間抗體（interme‐diate antibodies，IA）；最后根據(jù)UCA和不同IA與相應(yīng)病毒包膜蛋白進(jìn)化過程中的突變體的親和力以及中和強(qiáng)度設(shè)計(jì)序貫免疫原，逐步誘導(dǎo)bnAb的產(chǎn)生。應(yīng)用上述思路，研究人員在人源化小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)出可以中和tier-2毒株的bnAb［57］。如同自然感染，以序貫免疫方法有可能定向引導(dǎo)bnAb的進(jìn)化成熟，縮短bnAb的產(chǎn)生時(shí)間。但是目前尚未在非人類靈長動物模型內(nèi)得到驗(yàn)證。采用靶向胚系B細(xì)胞抗原設(shè)計(jì)也取得了重要進(jìn)展，該方案主要目的是通過優(yōu)化設(shè)計(jì)免疫原誘導(dǎo)目的bnAb前體B細(xì)胞的激活。VRC01類型bnAb特異性結(jié)合CD4bs靶點(diǎn)，但是這類bnAb的UCA抗體并不能結(jié)合異源病毒的Env，因此異源病毒的Env無法激活相應(yīng)的胚系B細(xì)胞。通過蛋白互作設(shè)計(jì)、文庫篩選與多靶點(diǎn)優(yōu)化等手段，研究人員篩選得到優(yōu)化的eOD-GT6免疫原。與野生型Env比較，eOD-GT6增加了8個(gè)突變位點(diǎn)。eOD-GT6與VRC01及其UCA和IA具有非常高的親和力，這可能有助于相應(yīng)B細(xì)胞SHM朝向成熟的VRC01發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示eOD-GT6納米顆?？沙晒せ畋磉_(dá)VRC01及其前體的B細(xì)胞系［58］。最近，同一研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的N332-GT2免疫原在小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)了相對廣譜的結(jié)合抗體［59］。目前為止，由于具有一定中和程度的廣譜中和抗體尚未能在這類人源化小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出來，這一策略仍需進(jìn)一步改進(jìn)和完善。

5 結(jié)語

回顧艾滋病疫苗30多年的發(fā)展歷程，我們可以從中總結(jié)寶貴的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。艾滋病疫苗研究主要經(jīng)歷了應(yīng)用與理論指導(dǎo)應(yīng)用兩個(gè)重要時(shí)期。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)?zāi)５氖〈偈挂呙鐚W(xué)家開始關(guān)注疫苗誘導(dǎo)機(jī)體免疫保護(hù)的理論研究。美國國立衛(wèi)生研究院疫苗研究中心（Vaccine Research Center，VRC）和艾滋病疫苗免疫中心（Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology，CHAVI）的成立促進(jìn)了艾滋病疫苗研究從應(yīng)用到理論的重大轉(zhuǎn)向，許多資金投入到HIV-1病毒免疫學(xué)、病毒學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中來，取得了一系列重大的研究成果，極大地推動了疫苗研究的發(fā)展。RV144臨床III期試驗(yàn)得到的微弱保護(hù)結(jié)果和最近HVTN702臨床III期試驗(yàn)的失敗進(jìn)一步凸顯了誘導(dǎo)bnAb的重要性。近年來，一系列bnAb的分離以及抗體進(jìn)化機(jī)制的闡明使得通過設(shè)計(jì)新型免疫原來誘導(dǎo)bnAb成為可能?？墒悄壳盎诳贵w進(jìn)化機(jī)制設(shè)計(jì)的靶向胚系B細(xì)胞抗原仍未能在非人類靈長動物模型內(nèi)誘導(dǎo)bnAb，研發(fā)有效的艾滋病疫苗仍然任重路遠(yuǎn)。另外，動物模型的局限性以及HIV Env異常的免疫原性也進(jìn)一步增加了艾滋病疫苗挑戰(zhàn)。盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，希望不斷積累的病毒學(xué)、免疫學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)理論成果可以幫助人類成功地研制可以遏制HIV-1流行的艾滋病疫苗。