下調(diào)lncRNA MALAT1表達(dá)保護(hù)PC12細(xì)胞免于氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧所致的損傷*

譚曉丹， 顧 超， 彭 哲， 向 葡， 涂鈺均， 楊俊卿△

（1重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點實驗室，2重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶400016；3重慶市墊江縣人民醫(yī)院，重慶408300）

腦卒中，又稱中風(fēng)，臨床上主要分為出血性和缺血性兩種。目前臨床上治療缺血性腦卒中的主要手段是盡早實現(xiàn)堵塞血管再通，缺血區(qū)的血流再灌，減少腦細(xì)胞死亡。另一方面，由于腦組織的長時間缺血缺氧，再灌注后血氧水平恢復(fù)，活性氧的生成激增，使腦細(xì)胞產(chǎn)生一系列損傷性反應(yīng)，誘發(fā)腦細(xì)胞壞死和凋亡，加重缺血區(qū)細(xì)胞損傷，即腦缺血/再灌住損傷［1］。

炎癥/免疫反應(yīng)參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮著重要作用［2］。在損傷刺激下細(xì)胞壞死致細(xì)胞膜磷脂大量釋放，使花生四烯酸（arachidonic acid，AA）累積，環(huán)加氧酶（cyclooxygenase，COX）代謝途徑在此進(jìn)程中最為重要，COX催化AA向前列腺素（prostaglandins，PGs）等炎癥因子轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)循環(huán)。PGE2是COX-2的直接下游產(chǎn)物，是一種重要的炎癥介質(zhì)［3］。PGE2經(jīng)非酶脫水成PGA2，促進(jìn)神經(jīng)元死亡。白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）是抗炎細(xì)胞因子之一，它并不影響病毒持久性，而是限制損傷期間組織病變的擴(kuò)張［4］，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是免疫系統(tǒng)的主調(diào)節(jié)因子，通過激活和募集免疫細(xì)胞，在炎癥刺激下向NF-κB轉(zhuǎn)化，促進(jìn)氧化應(yīng)激以及COX-2向炎癥產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，在炎癥的傳播中發(fā)揮重要作用［5］。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是指長度達(dá)200個核苷酸以上的非編碼RNA序列，它們以RNA的形式參與機(jī)體的某些生物學(xué)過程：如競爭性結(jié)合miRNA［6］、同蛋白質(zhì)的相互作用、調(diào)控mRNA剪切染色質(zhì)及組蛋白重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等［7］。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在缺血性腦卒中扮演重要角色，具有作為腦卒中生物標(biāo)志物的潛力［8］。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associat‐ed lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是最早被發(fā)現(xiàn)和定義的lncRNA之一：在2003年，MALAT1被證實同早期非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)［9］。越來越多的證據(jù)證實MALAT1在許多實體腫瘤中上調(diào)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)［10］。MALAT1在卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)，通過PI3K-AKT通路促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［11］；MALAT1調(diào)控YAP1與TCF4/β-catenin的相互作用，海綿吸附miR-126-5p，調(diào)控結(jié)直腸癌血管生成和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，體外模擬缺血性卒中的血管內(nèi)皮細(xì)胞中MALAT1高表達(dá)［13］；沉默MALAT1通過與miR-206作用抑制COX-2的表達(dá)，減少IL-1β和IL-6的釋放減輕神經(jīng)性疼痛［14］。

PC12細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）損傷模型模仿了體內(nèi)中風(fēng)的部分原理［15］，它由2個階段組成：氧糖剝奪和再灌注［15］，能模仿缺血受損組織在血液再通條件下再灌注損傷的病理生理改變［16］。結(jié)合已有研究報道和本課題組的前期研究基礎(chǔ)，我們認(rèn)為MALAT1可能影響COX-2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因而在本研究中，擬采用OGD/R處理體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞以模擬腦缺血再灌注損傷，探究MALAT1在腦缺血再灌注損傷中的作用以及對COX-2相關(guān)炎癥反應(yīng)的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液（D6429）購自Sigma；DMEM無糖培養(yǎng)液（2177535）購自Gibco；胎牛血清購自Bio‐logical Industries；馬血清（abs989）購自上海愛必信生物科技有限公司；MTT、0.25%胰蛋白酶（BL512A）和雙抗（BL505A）購自Biosharp；D-PBS（1×；GP3302）購自GENVIEW；siRNA轉(zhuǎn)染試劑（EF-013-S）購于Gene‐Copoeia；Trizol購自Vazyme；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Bimake；COX-2抗體（GTX100656）購自GeneTex；Bax抗體（60267-1-lg）購自武漢三鷹生物公司；Bcl-2抗體（Ab-BF9103）購自Affinity；PGE2（MM-0068R1）、TNF-α（MM-0180R1）和IL-10（MM-0195R1）ELISA試劑盒均購于江蘇寶萊試劑公司；MALAT1siRNA三條干擾序列及si-NC均由Gene Pharma設(shè)計合成，序列見表1。

表1 siRNA序列Table 1.The siRNA sequences

3 主要儀器

酶標(biāo)儀、垂直流超凈臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱和三氣培養(yǎng)箱均購于Thermo；電泳儀、PCR儀和成像儀購自BIORAD。

4 實驗方法

4.1 模型的建立和實驗分組 PC12細(xì)胞具有神經(jīng)元樣功能，被廣泛用于模擬神經(jīng)元功能變化。培養(yǎng)PC12細(xì)胞至豐度為80%左右，除正常（normal）組，其余組更換工作體積的DMEM無糖培養(yǎng)液，并置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，再更換為DMEM高糖完全培養(yǎng)液于普通培養(yǎng)箱復(fù)糖復(fù)氧24 h。（1）為了觀察MALAT1在OGD/R處理PC12細(xì)胞的表達(dá)改變，將PC12細(xì)胞分為2組（n=3）：normal組和模型（OGD/R）組；（2）為了探討MALAT1對OGD/R所致PC12細(xì)胞損傷的作用，將PC12分為4組（n=3）：normal組、OGD/R組、OGD/R+si-NC組（si-NC組）和OGD/R+MALAT1siRNA組（siRNA組）。

4.2 細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)液：10%馬血清加5%胎牛血清，加DMEM高糖培養(yǎng)液，再加1%雙抗配制。傳代：PC12細(xì)胞于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至豐度為80%左右進(jìn)行傳代處理，0.25%胰蛋白酶培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞30 s，適量完全培養(yǎng)液終止消化吹打至均一懸液，1 000×g，離心5 min，重懸細(xì)胞沉淀接種到新的培養(yǎng)瓶中。

4.3 轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞于適宜細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至豐度為60%～70%，更換為無雙抗完全培養(yǎng)液，siRNA終濃度為100 nmol/L，感染細(xì)胞24 h。

4.4 RT-qPCR檢測MALAT1的表達(dá) 將細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)至豐度為70%左右加si-2感染24 h，再進(jìn)行OGD/R，用冰PBS潤洗細(xì)胞表面3次，吸干液體；每孔加1 mL Trizol提取總RNA并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA，引物序列見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for RT-qPCR

4.5 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)至適宜豐度加si-2處理24 h后OGD/R。收集細(xì)胞總蛋白，按PMSF∶RIPA=1∶100配制裂解液。取出6孔板置于冰上，棄去培養(yǎng)液用冰PBS潤洗細(xì)胞3次，吸出液體，加入適量裂解液充分裂解，12 000×g、4℃離心15 min，得上清液，采用BCA試劑盒測總蛋白濃度。按30μg總蛋白量上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)蛋白到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉含目的蛋白的PVDF膜2 h。以TBST洗膜3次，加入Ⅰ抗［COX-2（1∶1 000）、Bax（1∶10 000）、Bcl-2（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）］，4℃孵育過夜。次日回收Ⅰ抗加入Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。濾紙吸干PVDF膜上水分，與ECL發(fā)光液充分反應(yīng)后掃描顯影。β-actin為內(nèi)參照，Image Lab軟件分析條帶。

4.6 MTT檢測細(xì)胞活力 將PC12細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞豐度70%左右更換無雙抗培養(yǎng)液并加入si-2感染細(xì)胞24 h，進(jìn)行OGD/R后避光加MTT溶液，每孔20μL，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體以150μL DMSO溶解底部甲贊，避光震搖10 min充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度（A）值。

4.7 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率 將PC12細(xì)胞按每孔1×106萬個接種到6孔板中，貼壁后更換為無雙抗培養(yǎng)液，同時加入si-2處理24 h后OGD/R，收集上清，用PBS洗3次細(xì)胞，不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，吹打制成細(xì)胞懸液，收集。1 000×g離心5 min，棄上清，細(xì)胞團(tuán)塊用1 mL PBS重懸，重復(fù)三次，將得到的細(xì)胞沉淀用300μL PBS吹散，置于冰上送至重慶醫(yī)科大學(xué)流式檢測中心檢測細(xì)胞凋亡。

4.8 ELISA測炎癥因子 OGD/R后收集無細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，低溫離心3 500×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清，用雙蒸水1∶5比例稀釋，ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α、IL-10和PGE2。反應(yīng)停止15 min內(nèi)于450 nm波長處檢測各孔A值。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示所有實驗數(shù)據(jù)，SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。單因素方差分析（one-way ANOVA）用于多組間比較，兩組間比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OGD/R處理的PC12細(xì)胞MALAT1的表達(dá)變化

同normal相比，OGD/R處理的PC12細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）。見圖1。

Figure 1.The expression of MALAT1 in OGD/R-treated PC12 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs normal group.圖1 OGD/R處理PC12細(xì)胞MALAT1的表達(dá)變化

2 篩選MALAT1 siRNA有效干擾序列

由公司合成的3條siRNA干擾序列（si-1、si-2和si-3）的干擾效率進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖2。同si-NC相比，3條序列均能降低MALAT1的表達(dá)，其中si-1（P<0.05）和si-2（P<0.01）能顯著降低MALAT1的表達(dá)，根據(jù)篩選結(jié)果si-2的干擾效果最為顯著（降低約2倍），因此在進(jìn)一步實驗中我們采用的干擾序列是si-2。

Figure 2.The relative expression of MALAT1 in OGD/R-treated PC12 cells after transfected with siRNAs.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs normal group；*P<0.05，**P<0.01 vs si-NCgroup.圖2 MALAT1有效干擾序列的篩選

3下調(diào)MALAT1表達(dá)對PC12細(xì)胞凋亡的影響

如圖3A、B所示，相比normal組，OGD/R所致PC12細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.01）；同si-NC組相比，siRNA干擾MALAT1后OGD/R導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡顯著減少（P<0.05）。

4下調(diào)MALAT1表達(dá)對PC12細(xì)胞活力的影響

如圖3C所示，同normal組相比，OGD/R導(dǎo)致PC12細(xì)胞活力顯著下降（P<0.01）；同si-NC組相比，si-2干擾MALAT1后，細(xì)胞活力顯著提高（P<0.01）。

5下調(diào)MALAT1對PC12細(xì)胞COX2、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與normal組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞中COX-2和Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著減少（P<0.01）；si-2處理后PC12細(xì)胞COX-2和Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高（P<0.05），見圖4。

6 下調(diào)MALAT1對PC12細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

如圖5所示，同normal組相比，OGD/R組PC12細(xì)胞中PGE2和TNF-α含量顯著增加，IL-10含量顯著減少（P<0.01）；同si-NC組相比，下調(diào)MALAT1表達(dá)可顯著減少PGE2（P<0.05）和TNF-α（P<0.01）的含量，顯著增加IL-10的含量（P<0.05）。

討 論

大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，并且能夠傳代培養(yǎng)，被廣泛用來進(jìn)行神經(jīng)藥理學(xué)的研究［17］。在我們以往的研究中嘗試用原代神經(jīng)元來進(jìn)行實驗，但局限于siRNA難以轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率極低，故而在我們的研究中采用的是被廣泛認(rèn)可用來模擬神經(jīng)元功能的PC12細(xì)胞株。

病理條件下，COX-2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)。在短暫局灶性腦缺血大鼠模型中，缺血區(qū)神經(jīng)元壞死及退變明顯，而周圍半暗帶主要表現(xiàn)為炎癥浸潤和COX-2的高表達(dá)，表明對腦組織炎癥浸潤進(jìn)行有針對性調(diào)控可以減輕神經(jīng)元損傷［18］。我們的研究顯示，OGD/R處理后PC12細(xì)胞的COX-2上調(diào)，COX-2下游產(chǎn)物PGE2增加，炎癥因子TNF-α增加，IL-10降低，表明OGD/R可導(dǎo)致PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)加劇。而siRNA干擾組PC12細(xì)胞COX-2、PGE2和TNF-α水平顯著下降，IL-10水平顯著上升，表明下調(diào)MALAT1能夠顯著抑制COX-2的表達(dá)及相關(guān)炎癥因子的生成。COX-2在微粒體前列腺素E合成酶1（mi‐crosomal prostaglandin E synthase-1，mPGES-1）的作用下生成PGE2，PGE2破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)Ca2+過度累積［19］，加重神經(jīng)元損傷。OGD/R后PGE2大量表達(dá)，siRNA干擾MALAT1能夠減少COX-2和PGE2的過度累積，表明敲減MALAT1通過減少COX-2的表達(dá)、抑制PGE2的釋放而減輕細(xì)胞損傷。不足之處在于PGE2下游的4個受體EP1-EP4，在我們的研究中未進(jìn)行檢測，在進(jìn)一步研究中，有必要深入探討。

Figure 3.Effect of MALAT1 siRNA on PC12 cell injury induced by OGD/R.A and B：the apoptosis detected by flow cytometry；C：cell viability detected by MTTassay.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs normal group；*P<0.05，**P<0.01 vs si-NCgroup.圖3 MALAT1 siRNA對OGD/R所致PC12細(xì)胞損傷的作用

Figure 4.Effect of MALAT1 siRNA on protein expression of COX-2，Bcl-2 and Bax in OGD/R-treated PC12 cells.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs normal group；*P<0.05 vs si-NCgroup.圖4 siRNA干擾MALAT1對PC12細(xì)胞COX-2、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.Effect of MALAT1 siRNA on the levels of PGE2，TNFαand IL-10 in OGD/R-treated PC12 cells.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs normal group；*P<0.05，**P<0.01 vs si-NCgroup.圖5 siRNA干擾MALAT1對OGD/R處理PC12細(xì)胞PGE2、TNF-α和IL-10水平的影響

Bcl-2和Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡和Fas介導(dǎo)的caspase-3在炎癥中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OGD/R處理的PC12細(xì)胞凋亡率顯著上升，細(xì)胞活力顯著下降；siRNA干擾MALAT1使PC12細(xì)胞活力提高，凋亡率也顯著下降。有研究表明，敲減MALAT1表達(dá)可通過激活PI3K/AKT信號通路減輕缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡［21］。結(jié)合我們的研究結(jié)果表明，干擾MALAT1表達(dá)可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax凋亡蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)胞活力，保護(hù)PC12細(xì)胞免于OGD/R誘導(dǎo)的損傷，可能與通過影響PI3K/AKT信號通路而下調(diào)COX-2表達(dá)有關(guān)，但是需要進(jìn)一步的實驗加以證實。

本研究表明，OGD/R處理的PC12細(xì)胞MALAT1表達(dá)顯著上調(diào)；siRNA干擾MALAT1的表達(dá)顯著減輕OGD/R所致PC12細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與MALAT1調(diào)控COX-2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)。