基于骨細(xì)胞的骨穩(wěn)態(tài)維持與骨缺損修復(fù)*

洪 樂， 李 鑫

（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川成都610041）

1 骨細(xì)胞概述

骨細(xì)胞是骨骼系統(tǒng)中含量最豐富、分布最廣泛的細(xì)胞，由成骨細(xì)胞分化而來，包埋于礦化的骨基質(zhì)中，占成年人骨骼細(xì)胞的90%～95%，壽命可長達(dá)25年［1］。多年來研究者對骨細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)與功能知之甚少。隨著骨細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)，人們對骨細(xì)胞的認(rèn)知有了極大的拓展。從最早認(rèn)為骨細(xì)胞是埋藏在礦化骨基質(zhì)中靜止的、不活躍的細(xì)胞［2］，到發(fā)現(xiàn)其機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持功能［3］，再到近幾年研究發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞的骨代謝調(diào)控作用［4］，骨細(xì)胞目前已成為骨生理和骨病理研究的熱點(diǎn)。

骨組織的生理代謝過程大致可分為骨形成和骨改建兩個(gè)階段，個(gè)體生長發(fā)育期中以骨形成為主導(dǎo)，骨改建則貫穿整個(gè)生命周期。這兩個(gè)階段中均伴隨生理性成骨過程［5］。成骨細(xì)胞經(jīng)歷膠原基質(zhì)分泌、細(xì)胞嵌入、細(xì)胞突生成3 個(gè)階段分化為骨細(xì)胞，所在位置被基質(zhì)包埋而成為骨陷窩［6］；成熟骨細(xì)胞通過細(xì)胞突與其他骨細(xì)胞互相連接，形成最基本的骨細(xì)胞網(wǎng)格；隨著基質(zhì)分泌、礦化與包埋，細(xì)胞突周圍形成骨小管，從而最終形成骨陷窩-骨小管網(wǎng)格系統(tǒng)（lacuno-canaliculi system，LCN）。據(jù)估計(jì)成人體內(nèi)LCN 總面積可達(dá)到 201 m2［7］，每個(gè)組成 LCN 的骨細(xì)胞可伸出多達(dá)40～100 個(gè)細(xì)胞突。在皮質(zhì)骨解剖中，骨細(xì)胞層疊環(huán)繞哈弗氏管而形成骨單位。LCN 及骨單位的存在令各類信號分子得以進(jìn)行跨細(xì)胞移動，是骨細(xì)胞發(fā)揮功能的形態(tài)學(xué)與組織學(xué)基礎(chǔ)［8］。雖然組織學(xué)上骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞同源，二者基因選擇性表達(dá)幾近相同，但在表達(dá)水平上卻呈現(xiàn)明顯差異。例如，骨細(xì)胞中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和I 型膠原蛋白（collagen type I，Col I）表達(dá)水平較低，而磷酸代謝和骨組織礦化相關(guān)基因如X 染色體內(nèi)肽酶同源磷酸調(diào)節(jié)基因（phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome，PHEX）、細(xì)胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白（matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）、特定成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等的表達(dá)較高［6］。這也導(dǎo)致了骨細(xì)胞特有的功能機(jī)制。

2 骨細(xì)胞參與骨穩(wěn)態(tài)維持

骨組織的動態(tài)代謝過程是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同協(xié)調(diào)的［4］，而骨細(xì)胞可與骨微環(huán)境中多種細(xì)胞發(fā)生交互作用，進(jìn)而影響骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡。骨細(xì)胞的數(shù)量和活性對骨組織正常生理功能的維持十分重要，其凋亡則與骨組織病理情況密切相關(guān)［6］。靶向消除骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出成骨細(xì)胞功能障礙、骨小梁缺失、皮質(zhì)空隙增加等脆性骨特征［9］。在新生小鼠體內(nèi)利用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記DNA 片段分析發(fā)現(xiàn)，骨細(xì)胞凋亡小體的核因子κB 配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達(dá)與釋放增加，進(jìn)而作為破骨細(xì)胞招募與分化的信號［10］，影響局部骨改建從而參與骨發(fā)育進(jìn)程。衰老小鼠中骨細(xì)胞的數(shù)目明顯降低，且骨細(xì)胞凋亡通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成與招募從而調(diào)控衰老相關(guān)骨病理進(jìn)程［11］。

在骨形成方面，骨細(xì)胞可以通過參與類骨基質(zhì)的合成和礦化、合成骨形成與礦化相關(guān)蛋白質(zhì)，如Col I、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）及ALP 等［4］，參與骨生成。骨細(xì)胞也可通過分泌骨橋蛋白（osteopontin，OPN）及OPN/CD4 介導(dǎo)通路，招募骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），啟動成骨分化與骨形成［4］；還可分泌骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）。作為骨細(xì)胞特異性表達(dá)的分泌蛋白，SOST 在骨小管中廣泛分布，主要通過拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及競爭性結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）兩種調(diào)控方式［12］，阻斷 Wnt 通路對成骨分化和骨形成的促進(jìn)作用［13］。同時(shí)，骨細(xì)胞特異性高表達(dá)FGF2及FGF18［4］。當(dāng)FGF2缺失時(shí)，成骨細(xì)胞數(shù)目顯著減少、骨量下降；敲除FGF18則表現(xiàn)出骨骼延遲形成。FGF 通路與Wnt 通路的協(xié)同作用可解除Wnt 抑制從而促進(jìn)成骨分化與骨形成［14］。

在骨吸收方面，骨細(xì)胞可分泌RANKL。RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是破骨細(xì)胞分化過程的關(guān)鍵因子［15］。M-CSF基因敲除小鼠表現(xiàn)出骨細(xì)胞缺陷與骨質(zhì)疏松表型，這可能是由于M-CSF 對骨細(xì)胞存活和（或）分化的直接影響，或是破骨細(xì)胞和（或）巨噬細(xì)胞依賴性信號缺失的間接作用［15］。而RANKL可阻止破骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化并增強(qiáng)成熟破骨細(xì)胞活性，從而調(diào)控破骨細(xì)胞的活化與功能［16］。骨細(xì)胞源性RANKL對骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，有證據(jù)顯示，純化的骨細(xì)胞比成骨細(xì)胞或BMSCs更能通過釋放RANKL刺激破骨細(xì)胞分化成熟［17］。在特定條件下，骨細(xì)胞也可模仿破骨細(xì)胞的功能，通過清除周圍骨基質(zhì)從而作為骨組織的一種保護(hù)機(jī)制［18］。值得注意的是，骨細(xì)胞可通過RANKL/OPG 軸調(diào)控骨吸收過程［19］。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）可與 RANKL 相互拮抗［19］，阻止RANKL-RANK 間結(jié)合，因而RANKL/OPG 比值是決定破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收在特定部位發(fā)生程度的關(guān)鍵因素。同時(shí)，骨細(xì)胞可通過分泌BMP 等與甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、雌激素等其他外源性因子共同作用調(diào)節(jié) RANKL/OPG 比例［20］，從而控制成骨-破骨的動態(tài)平衡。此外，在應(yīng)力作用下，成熟骨細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度隨之發(fā)生改變進(jìn)而通過信號通路調(diào)控引起相關(guān)生物學(xué)作用，提示骨細(xì)胞可通過機(jī)械感受機(jī)制直接參與調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)［21］。

3 骨細(xì)胞參與骨缺損進(jìn)程

骨缺損泛指一整類由感染、創(chuàng)傷、腫瘤、骨髓炎清創(chuàng)及先天性疾病造成骨質(zhì)缺失、間隙形成的疾病［22］。因診斷標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣，學(xué)術(shù)上一般使用“臨界骨缺損”（critical-sized bone defects，CSBD）或“大段骨缺損”（large/massive bone defects）描述長度超過2 cm或深度超過骨周徑50%的骨體缺損［23-24］。有報(bào)道指出，外傷骨折患者中有0.4%（主要是粉碎性、開放性骨折）伴發(fā)臨界骨缺損［25］，全球每年因顱面部臨界骨缺損進(jìn)行的骨移植術(shù)可超過100 萬例［26］。此外，臨界骨缺損還可繼發(fā)休克、感染、各型骨不連及損傷性骨化等并發(fā)癥［23-24，27-34］，嚴(yán)重影響患者健康及生存，為社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨缺損后骨細(xì)胞的病理變化主要包括3 個(gè)方面：首先，骨細(xì)胞網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生細(xì)胞突的萎縮斷裂、陷窩中細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核染色性狀改變等退行性變化，單個(gè)骨細(xì)胞的平均骨細(xì)胞小管數(shù)也明顯減少［35-36］；其次，骨缺損后病灶區(qū)骨細(xì)胞內(nèi)分泌功能減弱，而鄰近健康骨細(xì)胞分泌功能增強(qiáng)［35］，提示骨缺損阻斷了骨細(xì)胞間通訊［37］；此后，骨陷窩及骨小管中液體流速及成分發(fā)生變化，溶解氧減少，從而引起骨細(xì)胞凋亡并釋放炎性細(xì)胞因子招募破骨細(xì)胞［36］；后期，病灶區(qū)骨細(xì)胞加速血管新生并進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞募集及骨重建［35］。在炎性骨缺損中，促炎性細(xì)胞因子的釋放將加速骨細(xì)胞凋亡，從而加速上述進(jìn)程［38］。成熟骨組織出現(xiàn)微小骨缺損后，骨細(xì)胞可通過旁分泌信號通路抑制破骨細(xì)胞活性［39］，并分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等炎癥因子以加速骨修復(fù)［35］。

在不同的病理狀態(tài)下，骨細(xì)胞可能參與骨折、炎性骨損傷和腫瘤骨轉(zhuǎn)移的疾病進(jìn)程。在骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折率增加與骨折愈合延遲中，骨細(xì)胞中縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠骨折韌性降低且骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，提示骨細(xì)胞對維持骨組織正常結(jié)構(gòu)和機(jī)械完整性的重要作用［40］。在重度牙周炎引發(fā)的牙槽骨缺損中，牙周致病菌毒性產(chǎn)物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可穿透牙槽骨直接刺激包埋其中的骨細(xì)胞，引起RANKL 陽性的骨細(xì)胞比例及RANKL 整體水平顯著上調(diào)，從而引起牙槽骨炎性骨丟失。抑制骨細(xì)胞SOST的表達(dá)可誘導(dǎo)牙槽骨中牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化產(chǎn)生類骨細(xì)胞并最終轉(zhuǎn)化為骨，進(jìn)而導(dǎo)致牙槽骨體積增加甚至逆轉(zhuǎn)牙槽骨退化。腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞與靶骨組織骨微環(huán)境之間相互作用可引起骨組織的溶骨性或成骨性病變［13］。研究已表明，腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中，在包括原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移性腫瘤休眠、轉(zhuǎn)移性腫瘤生長、腫瘤誘導(dǎo)成骨/溶骨的多個(gè)進(jìn)程中，Wnt信號通路都起到重要作用［13］。例如，在間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化過程中βcatenin 等的高參與度決定了其在原發(fā)性腫瘤擴(kuò)散的重要地位［41］；同時(shí)，Wnt 通路可通過β-catenin 介導(dǎo)的經(jīng)典途徑或非經(jīng)典途徑直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的休眠行為［42］；轉(zhuǎn)移性腫瘤生長時(shí)，Wnt3a 等分子可通過下游通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與骨微環(huán)境的交流從而支持腫瘤細(xì)胞生長［43］；而在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)成骨/溶骨過程中，腫瘤細(xì)胞分泌的Wnt7b 等分子可破壞骨穩(wěn)態(tài)從而引起骨組織損傷［44-45］。在腫瘤轉(zhuǎn)移骨組織中，骨細(xì)胞的SOST 表達(dá)與分泌水平也可發(fā)現(xiàn)明顯升高，表明骨細(xì)胞可能通過分泌SOST調(diào)控腫瘤細(xì)胞對骨組織的浸潤與損傷［46］。研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程中骨細(xì)胞中表達(dá)的Cx43還可與乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的Cx43形成異質(zhì)細(xì)胞間隙來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和入侵［47］。此外，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移晚期，骨細(xì)胞凋亡將加劇骨吸收與骨沉積失衡從而加速骨破壞［17］，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。

4 靶向骨細(xì)胞調(diào)控骨代謝

骨細(xì)胞參與的 Wnt 通路［48］可與 BMP 通路［49］和Hedgehog 通路［50］交互作用，進(jìn)而調(diào)控骨與軟骨生成。在成骨調(diào)控中，Wnt 經(jīng)典通路通過激活β 連環(huán)蛋白（β-catenin）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動RUNX2基因活化，以此調(diào)節(jié)ALP、OCN、Col I 等的表達(dá)促進(jìn)成骨分化。值得注意的是，在發(fā)育不同階段，Wnt 通路對骨形成的調(diào)控有賴于不同的細(xì)胞類型。在發(fā)育早期［5，13］，Wnt/β-catenin 通路在BMSCs、成骨祖細(xì)胞及早期成骨細(xì)胞等高表達(dá)，敲除CTNNB1基因（編碼β-catenin 的基因）將導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量缺失，骨形成進(jìn)程終止；而在成骨發(fā)育晚期，Wnt 對上述細(xì)胞的作用相對減弱，轉(zhuǎn)而通過骨細(xì)胞對骨形成施加影響。將小鼠原代BMSCs 與原代骨細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在成骨發(fā)育晚期激活骨細(xì)胞β-catenin可顯著增強(qiáng)BMSCs的成骨向分化；體內(nèi)激活骨細(xì)胞的Wnt 信號也可顯著增加成骨細(xì)胞數(shù)量及骨量［5］，提示骨細(xì)胞的Wnt/βcatenin 通路對骨形成代謝有重要調(diào)控作用。近期研究也發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 通路在血管生成和免疫監(jiān)視方面的調(diào)節(jié)作用［51］，針對性調(diào)控骨細(xì)胞Wnt 通路可能對骨穩(wěn)態(tài)維持及骨缺損修復(fù)有重要意義。

骨細(xì)胞也可通過Wnt通路調(diào)節(jié)自身Notch配體的表達(dá)進(jìn)而激活靶細(xì)胞如BMSCs的Notch通路［5］。典型的Notch 通路由受體、配體及DNA 結(jié)合因子組成，是進(jìn)化上高度保守的信號通路。在卵巢去勢的成年小鼠中，過表達(dá)Notch通路可促進(jìn)包埋在基質(zhì)中的骨細(xì)胞繼續(xù)增殖分化，從而顯著促進(jìn)成骨［52］。Notch 通路也可通過下調(diào)SOST與Dickkopf-1（DKK1）的表達(dá)，正向調(diào)控 Wnt 通路［52］，也可通過 Smad 依賴的 BMP 信號通路協(xié)同上調(diào)OPG 表達(dá)水平，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與骨形成，間接抑制破骨細(xì)胞分化與骨吸收?；赗osa 轉(zhuǎn)基因小鼠條件性誘導(dǎo)骨形成不同階段Notch表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段對Notch通路在骨組織中的作用有重要影響。在未成熟的成骨細(xì)胞中抑制Notch 表達(dá)時(shí)，成骨分化進(jìn)程將被阻止，導(dǎo)致骨質(zhì)減少；而在骨細(xì)胞中抑制Notch 表達(dá)則可抑制骨吸收，增加骨體積［53］。因此，對骨細(xì)胞相關(guān)Notch通路的調(diào)控應(yīng)注意骨組織所處環(huán)境對調(diào)控手段的影響。

靶向Wnt 通路抑制劑SOST 的骨損傷修復(fù)療法近年來已頗有成效。2010 年SOST 單抗羅莫佐單抗（romosozumab/AMG785）率先在美國完成人體內(nèi)臨床試驗(yàn)［54］，并于 2019 年獲 FDA 批準(zhǔn)作為一種骨折高危絕經(jīng)后女性的骨質(zhì)疏松癥治療藥物上市。骨細(xì)胞SOST的表達(dá)受機(jī)械應(yīng)力刺激、失重、PTH、雌激素、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等的影響［12，55］，這可能為未來針對性調(diào)控骨細(xì)胞中 SOST表達(dá)與分泌的骨修復(fù)與再生策略提供一定參考。

5 結(jié)語

骨細(xì)胞雖然在骨骼系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣，但研究進(jìn)展卻長期落后于同在骨組織中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。近年來，骨細(xì)胞偶聯(lián)成骨與破骨活動調(diào)控骨代謝的作用成為骨生理和骨病理研究的熱點(diǎn)。骨細(xì)胞的獨(dú)特形態(tài)學(xué)與生物學(xué)特性使其在生命進(jìn)程早期的發(fā)育階段乃至成年期生理與病理狀態(tài)下的骨代謝中都發(fā)揮著重要作用。本文淺談了骨細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)維持與骨缺損修復(fù)中的科研進(jìn)展。值得注意的是，雖然當(dāng)前靶向骨細(xì)胞的骨代謝調(diào)控策略的研究已取得一定進(jìn)展，但基于此的實(shí)際臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍十分匱乏。一些關(guān)鍵問題，如骨細(xì)胞的脫分化潛能、直接或間接的骨細(xì)胞功能調(diào)控方式、新型骨代謝調(diào)節(jié)因子或分子靶點(diǎn)的鑒別等，均需進(jìn)一步的研究，以便為基于骨細(xì)胞的骨組織修復(fù)與再生策略提供科學(xué)依據(jù)。因此，對骨細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)和骨損傷中的調(diào)控作用及其機(jī)制的深入研究將有助于我們認(rèn)識骨發(fā)育、損傷、修復(fù)和再生過程，為代謝性骨病的防治方法提供參考。