巨噬細胞在血管生成中的作用①

王梓權(quán) 樊 平 周 杰 翁 杰 馮 波

（西南交通大學材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，材料科學與工程學院，成都610031）

1 引言

血管生成是組織修復的必要條件，其核心在于炎癥反應。理想的組織修復過程是炎癥初期破壞病原體、促使血管萌芽，隨后組織再生，炎癥消退，最后恢復正常組織結(jié)構(gòu)。但實際上，急性炎癥在破壞有害物質(zhì)同時也可能破壞正常細胞，導致組織或器官損傷；而慢性炎癥會引起組織破壞和纖維化。巨噬細胞是炎癥過程中極其重要的參與者，除機體免疫外，巨噬細胞在人體發(fā)育、動態(tài)平衡、血管生成、組織再生和植入體整合等方面也具有重要意義［1-2］。因此，基于巨噬細胞的組織修復治療策略逐漸受到重視。

未受到極化刺激的巨噬細胞常被稱為M0，而受到極化刺激的巨噬細胞通常被分為2 種表型：巨噬細胞受脂多糖（LPS）、IFN-γ 等炎癥介質(zhì)激活時表現(xiàn)為M1 型，又稱經(jīng)典活化型，在炎癥反應中清除侵入病原體和異物，促進炎癥發(fā)展；而巨噬細胞受IL-4、IL-10等因子刺激時表現(xiàn)為M2型，又稱交替活化型，在機體中起抑制炎癥反應、穩(wěn)定血管生成和組織修復作用。

2 M0型巨噬細胞在血管生成中的作用

組織內(nèi)常駐的巨噬細胞多為未極化的M0 型，是組織發(fā)育的關(guān)鍵參與者，對病原體的免疫反應、監(jiān)測組織變化，尤其是維持組織穩(wěn)態(tài)均具有重要作用［3］。

OLKOWSKI 等［4］采用3D 納米纖維聚苯乙烯支架（NPSs）與M0 型巨噬細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，巨噬細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平上調(diào)，可通過募集內(nèi)皮細胞發(fā)揮促血管化作用［5］。MOORE 等［6］將不同表型巨噬細胞與主動脈內(nèi)皮細胞（AECs）包被在具有生物活性的聚乙二醇的水凝膠內(nèi)，與單獨的AECs 相比，M0 型巨噬細胞與AECs共同包被組的小管體積提高了2 倍，原因可能為水凝膠中AECs 與M0 型巨噬細胞直接接觸。研究證明，巨噬細胞具有在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞或內(nèi)皮樣細胞的能力［7］。

總之，M0型巨噬細胞有助于血管生成和組織再生，但其促血管生成能力大多還是由極化后的表型實現(xiàn)。

3 M1型巨噬細胞在血管生成中的作用

M1 型巨噬細胞在血管生成中的作用具有一定爭議。部分研究認為M1 型巨噬細胞在血管生成中具有不可或缺的作用。

GUREVICH 等［8］將原代人M1 或M2a 型巨噬細胞與人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）共培養(yǎng)于一層成纖維細胞上，與其他組相比，M1型巨噬細胞誘導最長的總血管長度，原因為M1 型巨噬細胞分泌的VEGF水平顯著上調(diào)。HSIEH等［9］采用外源注入M1型巨噬細胞的方法治療小鼠缺血性肌肉損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在損傷早期（1～3 d）進行M1 治療能改善血管生成，促進骨骼肌再生。

BEYER 等［10］設計了一種體外模型，將內(nèi)皮細胞和周細胞以15∶1 摻入膠原蛋白Ⅰ凝膠球中并誘導發(fā)芽，將上述凝膠球暴露于不同表型巨噬細胞培養(yǎng)基，結(jié)果表明，M1 型巨噬細胞誘導內(nèi)皮細胞和周細胞的遷移。結(jié)合相關(guān)研究，可能與VEGF 和IL-1b 共同作用有關(guān)［5，11］。KANG 等［12］研究表明，M1 型巨噬細胞分泌的TNF-α 既具有促血管生成又有抗血管生成作用，取決于劑量以及是否存在周細胞。無周細胞存在時，TNF-α 濃度越高，抗血管生成作用越強；有周細胞存在時，可改善高濃度TNF-α 引起的抗血管生成作用。

相反，也有研究認為M1 型巨噬細胞不會促進血管生成，甚至抑制血管生成。LIU 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，M1型巨噬細胞釋放出大量促炎外泌體（M1-Exos），抗血管生成并加速心肌細胞損傷。M1型巨噬細胞還表達高水平的促炎miRNA，如miR-155。miR-155 通過抑制內(nèi)皮細胞遷移和增殖抑制血管形成。XU 等［14］采用褪黑激素將激光誘導的小鼠脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中的巨噬細胞從M2 型極化為M1 型，這種表型轉(zhuǎn)變顯著降低CNV病變體積和血管增殖能力。

因此，M1型巨噬細胞在血管生成中的作用存在爭議，可能有以下原因：①研究者選擇不同種屬細胞作為研究對象，已有研究表明不同來源巨噬細胞差異顯著［15］；②不同損傷部位炎癥環(huán)境存在差異，如糖尿病大鼠傷口潰瘍往往較為嚴重，M1型巨噬細胞階段持續(xù)時間過長，抑制血管生成，因此需盡快將炎癥環(huán)境轉(zhuǎn)為M2 階段，促進血管生成和組織再生［16］，相反，小鼠缺血性肌肉損傷修復中需要豐富的新生血管，也就需要M1 型巨噬細胞激發(fā)血管萌芽［9］；③促炎因子存在時間，如SAINSON 等［17］采用含TNF-α（10 ng/ml）的培養(yǎng)基預處理包被有內(nèi)皮細胞的纖維蛋白凝膠微球，2 d后將含TNF-α的培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，結(jié)果顯示經(jīng)TNF-α 預處理組萌發(fā)的芽數(shù)顯著多于僅使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的對照組，但如先使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理樣品2 d后再換成含TNF-α的培養(yǎng)基，該組萌發(fā)芽數(shù)反而明顯少于對照組；④M1型巨噬細胞與內(nèi)皮細胞的接觸方式。

4 M2型巨噬細胞在血管生成中的作用

M2型巨噬細胞可穩(wěn)定血管生成，促進成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積［18-19］。M2 型巨噬細胞因不同刺激物還可分為以下幾種亞型：由IL-4或IL-13誘導的M2a；由免疫復合物（immune complex，IC）和Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）或IL-1R 激動劑誘導產(chǎn)生的M2b；由IL-10 和糖皮質(zhì)激素誘導的M2c［20］。3種亞型在血管生成過程中起不同作用。

SPILLER 等［21］研究顯示，M2a 型巨噬細胞表達高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-3 組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-3，TIMP-3），可阻斷VEGF 信號傳導和TNF-α 釋放。因此，M2a 型巨噬細胞可通過募集周細胞和調(diào)節(jié)M1 型巨噬細胞信號傳導促進血管生成。另外，M2a 型巨噬細胞表達并分泌高水平血小板衍生生長因子-BB（PDGFBB）和堿性成纖維細胞生長因子-2（FGF-2），PDGFBB具有募集周細胞和間充質(zhì)干細胞，穩(wěn)定新生血管作用［22］。如果沒有PDGF-BB，僅在VEGF 刺激下形成的血管是滲漏的，不成熟易于降解；而FGF-2 是一種非常有效的促血管生成有絲分裂原和生長因子。M2c 型巨噬細胞表達高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和胎盤長因子（placental growth factor，PGF），MMP-9 具有刺激血管生成、重塑細胞外基質(zhì)和趨化內(nèi)皮細胞作用；PGF 則在M2c 誘導的血管生成中起驅(qū)動作用［21-22］。

YUE 等［23］將 心 臟 成 纖 維 細 胞（cardiac fibroblasts，CF）與不同亞型巨噬細胞共培養(yǎng)或與其條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，M2b 巨噬細胞顯著抑制CF 增殖和遷移，以及纖維化相關(guān)蛋白表達。而M2a的作用與之相反。體內(nèi)實驗中M2b 也顯示出抗纖維化作用。研究顯示，M2b 與M2a 和M2c 的區(qū)別還在于其保留了高水平炎癥細胞因子，并伴有高水平IL-10和低水平IL-12表達［24］。盡管M2b型巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥細胞因子和有毒分子，但其可減少脊髓損傷和心肌缺血/再灌注損傷，有助于損傷部位組織修復［25］。此外，M2b 型巨噬細胞可促進Th2 分化和體液抗體產(chǎn)生。

M2型巨噬細胞不同亞型間作用機制不盡相同，需要在今后研究中更加細化其亞型分類及功能。另外，M2型巨噬細胞促血管生成能力并不適用于所有情況，研究發(fā)現(xiàn)，將M2 型巨噬細胞注射至糖尿病db/db 小鼠全層切除皮膚傷口，與空白對照組（注射生理鹽水）相比，M2 型巨噬細胞并不能改善小鼠血管再生和傷口閉合［26］。提示M1 型巨噬細胞在促血管生長中的重要地位，即新血管生長需要經(jīng)歷炎癥初期M1 階段再轉(zhuǎn)變到M2 階段。過長的M2 階段會導致過度纖維化從而損傷機體，在未來研究中應當關(guān)注如何使M2階段適時結(jié)束。

5 由M1 到M2 的順序激活在血管生成中的必要性

自然發(fā)生的炎癥過程就是由促炎型M1 階段適時轉(zhuǎn)入愈合型M2 階段，體外研究也證明順序激活M1和M2的必要性。

SPILLER等［21］采用不同表型巨噬細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC，觀察血管化情況，結(jié)果表明，HUVEC 在M1 條件培養(yǎng)基中形成松散互連的血管簇，但在由其他表型（M0、M2a 或M2c）或所有3 種表型組合（M1、M2a 和M2c）的條件培養(yǎng)基中并沒有這種現(xiàn)象。當條件培養(yǎng)基在24 h 從M1 型轉(zhuǎn)換為M2a時，血管化類似于體內(nèi)自然轉(zhuǎn)變，成管行為明顯增強。當條件培養(yǎng)基在24 h 由M1 轉(zhuǎn)變成M2c 或基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，未觀察到這種現(xiàn)象。因此，僅當初期存在M1型巨噬細胞及其釋放的炎癥信號時，M2a型巨噬細胞才能分泌一些引起發(fā)芽血管融合的信號（如PDGF-BB等），從而增強成管行為。

CHEN 等［27］對純鈦表面進行納米化表面改性，得到二氧化鈦納米管（TNTs）陣列，將抑炎因子IL-4吸附到TNTs后，在其上制備京尼平交聯(lián)的羧甲基殼聚糖凝膠，再加載促炎因子IFN-γ，最后覆蓋一層β-甘油磷酸鈉交聯(lián)的殼聚糖凝膠。這種攜載雙重炎癥因子的材料體系被用于研究材料引發(fā)的初期炎癥響應和后期調(diào)控。結(jié)果表明，隨著凝膠層降解，首先是IFN-γ 明顯釋放，形成的炎癥環(huán)境將巨噬細胞極化為M1 表型；隨后以IL-4 釋放為主，導致M1型巨噬細胞大量極化為M2 型，將促炎階段轉(zhuǎn)變?yōu)榇儆想A段。YIN 等［28］在裝載IL-4 的TNTs 上組裝海藻酸鈉/殼聚糖的聚電解質(zhì)多層膜（PEM），再結(jié)合京尼平/氯化鈣交聯(lián)劑以調(diào)節(jié)IL-4 釋放。該材料體系在仿生條件下前3 d 緩慢釋放少量IL-4，3 d 后釋放量快速增加。當材料與巨噬細胞共培養(yǎng)時，采用促炎因子刺激的巨噬細胞在前3 d 保持M1 型，高表達促血管出芽的TNF-α、IL-1β 和VEGF；而7 d 時已轉(zhuǎn)化為以M2 表型為主，并高表達促血管網(wǎng)絡化的PDGF-BB。

以上植入材料設計表明，可通過階段性控釋炎癥因子，調(diào)節(jié)巨噬細胞表型由M1 到M2 的順序激活，促進新血管生長，進而實現(xiàn)組織再生。

6 巨噬細胞與其他細胞相互作用

血管生成和組織再生是通過巨噬細胞與其他細胞相互作用實現(xiàn)的。內(nèi)皮細胞是血管生成過程中的必需細胞，因為血管生成是通過內(nèi)皮細胞遷移、增殖、排列、分支和吻合等行為實現(xiàn)的。巨噬細胞可通過作用于內(nèi)皮細胞實現(xiàn)促進血管生成的作用。反之，內(nèi)皮細胞對巨噬細胞也有所影響。

HE 等［29］研究中，肝竇內(nèi)皮細胞（IMEC）與造血細胞（hematopoietic cells，HCs）直接共培養(yǎng)可使HCs分化為巨噬細胞并產(chǎn)生集落，集落外圍的巨噬細胞向M2型極化。當2種細胞間接共培養(yǎng)時，集落消失且無極化現(xiàn)象。體內(nèi)實驗表明，被IMEC 極化的巨噬細胞促進小鼠體內(nèi)腫瘤血管生長。JETTEN 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，盡管M1 型巨噬細胞的條件培養(yǎng)基具有血管生成潛力，但當其與內(nèi)皮細胞直接共培養(yǎng)時，血管形成受到抑制。表明內(nèi)皮細胞和這些巨噬細胞直接接觸抑制血管形成并抑制巨噬細胞產(chǎn)生促血管生成因子。MOORE 等［30］采用聚乙二醇水凝膠包被內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞可改變巨噬細胞形態(tài)。內(nèi)皮細胞與巨噬細胞有2種直接接觸模式，分別為：巨噬細胞與內(nèi)皮細胞小管外壁緊密結(jié)合；巨噬細胞橋接內(nèi)皮尖細胞并作為支持細胞。但有關(guān)巨噬細胞與內(nèi)皮細胞的膜結(jié)合因子及其對血管生長的影響機制尚未闡明。

血管生成過程中，巨噬細胞除與內(nèi)皮細胞相互作用外，還與間充質(zhì)干細胞、成纖維細胞等相互作用。JUKKA 等［31］研究表明，間充質(zhì)干細胞可募集巨噬細胞，并使其向M2 表型極化；巨噬細胞對間充質(zhì)干細胞具有募集、增殖和分化作用。JULIE 等［19］和MIKLOS 等［32］研究顯示，M2 型巨噬細胞可促進成纖維細胞趨化、增殖和分化；反之，成纖維細胞也會募集巨噬細胞。

LI 等［11］設計了一種將IFN-γ 加載于5%硅酸鈣/β-磷酸三鈣（CaSiO3-β-TCP）的支架。早期釋放IFN-γ 以刺激巨噬細胞向M1 型極化，隨后釋放Si 誘導巨噬細胞向M2 型極化。將原代人骨髓源性單核細胞（hBMMs）與幾種支架共培養(yǎng)，包括β-TCP、IFN-γβ-TCP、CaSiO3-β-TCP 或IFN-γ-CaSiO3-β-TCP。分別收集其上清作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC，用作體外血管形成試驗。另以CaSiO3-β-TCP 浸提液用于血管形成實驗，以區(qū)別硅酸鹽對HUVEC 的直接作用，結(jié)果表明IFN-γ-CaSiO3-β-TCP 與hBMMs 條件培養(yǎng)基用于HUVEC 培養(yǎng)時，具有最好的血管生成效果。同時僅材料本身的浸提液也可促進HUVEC 血管生成。

CHEN等［33］將聚己內(nèi)酯（PCL）/F-127通過3D打印技術(shù)制備成納米纖維網(wǎng)，該納米纖維網(wǎng)和骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）組成一種新型支架。 載有BMSCs的3D支架可促進肉芽組織形成，促進血管生成并促進膠原蛋白沉積。且該支架抑制巨噬細胞向M1 型極化并促進其向M2 型極化。間充質(zhì)干細胞因其可分化性多用于骨修復。

血管生成和組織再生過程是一個多細胞參與的復雜生理過程，進行組織修復時，如果僅考慮巨噬細胞或巨噬細胞對其他細胞的單向作用，可能不易起到良好的治療效果，需綜合考察此過程中巨噬細胞與其他細胞的相互作用，有望更好地解決組織再生與修復中的難題。

7 結(jié)論和展望

綜上所述，巨噬細胞無論是以何種表型存在（包括M0、M1 和M2），均對血管生成和組織再生起重要作用，且3種表型的作用并不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。組織修復過程中，巨噬細胞是極為重要的角色，但其他細胞，如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞，也是不可或缺的，其與巨噬細胞相互作用，共同達到促血管生成，進而促組織再生的目的。雖然目前對巨噬細胞在血管生成中的作用有了一定認識，但無論在理論上還是臨床應用中均還存在亟待解決的問題，如炎癥微環(huán)境變化與巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換的聯(lián)系及其對血管生成的作用，巨噬細胞不同表型存在時長對血管生成的影響，巨噬細胞與其他細胞相互作用過程的生化反應、信號通路及其傳遞機制，內(nèi)源巨噬細胞募集效率，外源巨噬細胞遞送方式和時間點，生物植入材料設計方案，老年患者組織修復中的血管生成，血管生成中的性別差異等。

巨噬細胞在血管生成中的作用是涉及多細胞、多蛋白、多生物因子及可變生理微環(huán)境的多因素協(xié)同過程。通過組織學、細胞學和分子生物學等多層面實驗與理論研究才能充分認識其作用機制的科學基礎(chǔ)，并指導臨床實踐，更好服務于患者，造福社會。