樹突狀細(xì)胞交叉提呈的研究進(jìn)展①

廖曉艷 高豐光

（廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，廈門361102）

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是機(jī)體介導(dǎo)適應(yīng)性免疫的重要抗原提呈細(xì)胞，其所誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答對殺傷腫瘤、細(xì)胞內(nèi)病原微生物等具有重要意義［1-2］。根據(jù)抗原的來源及性質(zhì)，DCs 主要通過MHCⅠ類分子提呈途徑、MHCⅡ類分子提呈途徑和交叉提呈途徑對抗原進(jìn)行加工和提呈。MHCⅠ類分子提呈途徑是指內(nèi)源性的抗原被降解成抗原肽并裝載于MHCⅠ類分子，提呈給CD8+T 細(xì)胞的過程；MHCⅡ類分子提呈途徑是外源性抗原通過吞噬、胞飲、受體介導(dǎo)等內(nèi)吞作用攝取抗原，裝載到MHCⅡ類分子，提呈給CD4+T 細(xì)胞的過程；交叉提呈途徑則是DCs 對外源性抗原的一種抗原提呈方式，即外源性抗原經(jīng)DCs 作用后與MHCⅠ類分子形成復(fù)合體，提呈給CD8+T細(xì)胞的過程［3］。DCs可根據(jù)其功能及表面分子的不同，分為經(jīng)典DCs（classical DC，cDCs）、漿細(xì)胞樣DCs（plasmacytoid DC，pDCs）、朗格漢斯細(xì)胞（langerhans cells，LC）和單核來源的DCs（monocyte derived DCs，moDCs）等［4］。cDCs 又可根據(jù)其是否表達(dá)趨化因子XCR1 而進(jìn)一步細(xì)分為XCR1+DC（cDC1）和XCR1-DC（cDC2）2 個 亞 類［5］。cDC1 是抗原交叉提呈的主要DCs 群體，在小鼠DCs中，相較于其他亞類，CD8a+DCs 是抗原提呈效率最高的，而在人類中，CD141+DCs 發(fā)揮同樣的作用［6］。DCs 交叉提呈主要通過液泡途徑和內(nèi)體-細(xì)胞質(zhì)途徑完成［7-8］。在液泡途徑中，外源性抗原被DCs 攝取后，在溶酶體酶被加工處理成抗原肽，在內(nèi)體溶酶體器室中形成抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，最后提呈給CD8+T細(xì)胞。它不依賴于抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）及蛋白酶體［4］。在內(nèi)體-細(xì)胞質(zhì)途徑中，DCs 表面受體內(nèi)化的抗原先被從內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，繼而被蛋白酶體降解成分子量不等的抗原肽，再由TAP將抗原肽運(yùn)回內(nèi)體并與MHCⅠ類分子組裝［7，9］。由于外源性抗原的相對分子質(zhì)量較大，限制其通過內(nèi)源性途徑對抗原進(jìn)行處理，而通過交叉提呈途徑提呈抗原，可起到殺傷靶細(xì)胞的作用，因此，對DCs 交叉提呈的研究可對腫瘤免疫治療提供新的潛在靶點(diǎn)和思路［10-11］。

1 內(nèi)體環(huán)境對交叉提呈的影響

與巨噬細(xì)胞不同，DCs 的吞噬體pH 在7.5～8.0左右，以維持溶酶體酶的較低活性［12］。DINGJAN等［13］利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，以外源性細(xì)胞色素C 進(jìn)行實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)內(nèi)體膜可通過脂質(zhì)過氧化酶NOX2招募至吞噬體、誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS、介導(dǎo)偏高的pH環(huán)境導(dǎo)致較多抗原從內(nèi)體進(jìn)入胞質(zhì)，從而促進(jìn)交叉提呈的發(fā)生。調(diào)節(jié)NOX2招募至吞噬體的作用靶點(diǎn)有Rab27a、轉(zhuǎn) 錄 因 子EB（transcription factor EB，TFEB）、VAMP8等分子。ALLOATTI 等［14］發(fā)現(xiàn)，短時間 的 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）刺 激 引 起Rab34 介導(dǎo)的溶酶體聚集于細(xì)胞核周圍，進(jìn)而溶酶體和吞噬體融合減少，導(dǎo)致吞噬體抗原降解減少而促進(jìn)交叉提呈的進(jìn)行。SAMIE 等［15］也發(fā)現(xiàn)，TFEB作為分子開關(guān)，與其相互作用蛋白互作后，調(diào)控溶酶體酶活性和吞噬體內(nèi)pH 值而調(diào)節(jié)DCs 的交叉提呈過程。DINGJAN 等［16］對VAMP8 的類似操作也通過影響吞噬體和內(nèi)體的酸堿度調(diào)節(jié)DCs的交叉提呈過程。因此，吞噬體內(nèi)的酸堿度、吞噬體與溶酶體的融合速度是調(diào)控DCs交叉提呈的首要步驟。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與吞噬體相互聯(lián)系對交叉提呈的影響

DCs 的吞噬體中有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的駐留，如MHCⅠ、TAP、Sec61、鈣網(wǎng)蛋白、鈣連蛋白等，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與吞噬體間有廣泛緊密的相互聯(lián)系［7］。CEBRIAN等［17］研究發(fā)現(xiàn)，SNARE家族中Sec22b定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體中間器室（ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC），并負(fù)責(zé)招募內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白至吞噬體中，通過用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低Sec22b 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Sec22b 的沉默可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白轉(zhuǎn)位至吞噬體減少，繼而導(dǎo)致抗原由吞噬體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)減少，并伴隨滯留于吞噬體的抗原降解增加，而最終降低DCs 的交叉提呈。ALLOATTI 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Sec22b 敲除的小鼠個體，其體內(nèi)骨髓來源的DCs（bone marrow derived DCs，BMDC）及脾臟DCs 對抗原的交叉提呈減少并導(dǎo)致腫瘤易感性。WU 等［19］的實(shí)驗雖發(fā)現(xiàn)Sec22b敲除對小鼠的抗原交叉提呈能力沒有影響，但以shRNA 技術(shù)對DCs的敲減卻明顯影響交叉提呈。其后續(xù)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠與敲減細(xì)胞實(shí)驗截然不同的結(jié)論歸因于基因敲除的脫靶效應(yīng)。ALLOATTI 等［18］和WU 等［19］的研究也證明：介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與吞噬體交互運(yùn)輸?shù)腟ec22b 蛋白與DCs 的交叉提呈直接相關(guān)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白轉(zhuǎn)位于吞噬體是交叉提呈不可或缺的步驟。衣殼蛋白復(fù)合物Ⅱ（coat protein complex Ⅱ，COPⅡ）介導(dǎo)MHCⅠ類分子從ER 進(jìn)入ERGIC［20］。ABE 等［21］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)受體Bap31 與MHCⅠ類分子結(jié)合并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）出口，負(fù)載抗原后促進(jìn)Bap31 及MHCⅠ類分子通過COPⅡ介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸從ER 轉(zhuǎn)運(yùn)到ERGIC，從而增加表面MHCⅠ類分子，而伴侶蛋白Bap29 過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞表面MHCⅠ類分子減少，因此伴侶蛋白Bap29 調(diào)節(jié)Bap31，Bap31 能夠促進(jìn)MHCⅠ類分子的運(yùn)輸至ERGIC?？偟膩碚f，ERGIC 涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白移動至吞噬體及MHCⅠ類分子的運(yùn)輸，影響交叉提呈的發(fā)生。

3 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用對交叉提呈的影響

DCs 對外源性抗原的攝取主要有吞噬、胞飲和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞3種方式［22］。吞噬是指質(zhì)膜內(nèi)陷形成吞噬體（＞250 nm），吞噬體可與內(nèi)體相互作用，從而啟動交叉提呈。胞飲提呈液相的抗原，只有抗原濃度較高時，才能較好地發(fā)揮提呈作用［7］。而DCs經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞對可溶性抗原的提呈可在抗原濃度較低時發(fā)生，因此，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞是DCs高效提呈抗原的主要方式，這些受體主要包括甘露糖受體（mannose receptor，MR）、DEC-205、Clec9a（DNGR1）等。BURGDORF 等［23］發(fā)現(xiàn)，MR 介導(dǎo)的內(nèi)吞抗原主要靶向早期內(nèi)體，抗原經(jīng)蛋白酶體處理成抗原肽后，在內(nèi)體與MHCⅠ類分子形成復(fù)合物，再于細(xì)胞表面提呈給CD8+T 細(xì)胞；而清道夫受體介導(dǎo)的內(nèi)吞抗原則主要靶向溶酶體，抗原經(jīng)溶酶體酶處理后，于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHCⅡ類分子結(jié)合形成復(fù)合體，提呈給CD4+T 細(xì)胞。即表面受體不同，其所介導(dǎo)的內(nèi)吞抗原駐留的細(xì)胞器、抗原提呈的發(fā)生部位、提呈抗原所致敏的CD4+T 細(xì)胞或CD8+T 細(xì)胞均不同。ZELENAY 等［24］發(fā)現(xiàn)，DNGR-1 可促進(jìn)抗原進(jìn)入早期內(nèi)體而促進(jìn)DCs 的交叉提呈。BOZZACCO 等［25］則發(fā)現(xiàn)，相較于MR 或DC-SIGN，在淋巴器官廣泛表達(dá)的DEC205與HIV的gag p24的融合蛋白所誘導(dǎo)的抗體，在較低劑量的條件下也可促進(jìn)moDCs 產(chǎn)生明顯的交叉提呈。因此，對將外源性抗原靶向早期內(nèi)體的受體分子的發(fā)現(xiàn)和操控，正成為提高DCs 交叉提呈及DCs疫苗的主要策略。

4 內(nèi)體中抗原移位到細(xì)胞質(zhì)對交叉提呈的影響

在內(nèi)體-細(xì)胞質(zhì)交叉提呈途徑中，內(nèi)體中內(nèi)化的抗原自內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，可促進(jìn)DCs的交叉提呈，而此過程與細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）密 切 相關(guān)［26］。所謂ERAD是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中駐留的修飾酶將錯誤折疊的蛋白靶向運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)，被蛋白酶體降解的過程。ERAD 通路可細(xì)分為ERAD-L、ERAD-M、ERAD-C 3 種。其中，ERAD-L 主要涉及由Hrd3p、Usa1p、Der1p、Hrd1p 等組成的泛素化酶Hrd1p 復(fù)合物。其主要過程包括Hrd3p 和Der1p 將底物傳遞給Hrd1p、Usa1p 招 募Der1p 到Hrd1p 形 成 寡 聚 體、Hrd1p使底物復(fù)合物結(jié)合松散、ATP 復(fù)合物對Hrd1p復(fù)合物進(jìn)行變構(gòu)、底物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并Hrd1p泛素化、ATP 酶將復(fù)合物靶向蛋白酶體進(jìn)行降解等步驟，因此，Hrd1p在ERAD-L通路介導(dǎo)的抗原移位中發(fā)揮核心作用［27］。ZEHNER等［28］研究發(fā)現(xiàn)，干擾Hrd1不僅可導(dǎo)致交叉提呈減少，同時會影響MHCⅡ類途徑。除Hrd1p 外，ERAD 的其他成員還包括Sec61、Derlin-1、p97、gp78、CHIP、HERP 等［29］。ZEHNER 等［28］以特異性阻斷Sec61轉(zhuǎn)位的捕獲抗體為工具，發(fā)現(xiàn)TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）可介導(dǎo)Sec61自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位于內(nèi)體，且Sec61 而非Derlin-1 轉(zhuǎn)位是內(nèi)體抗原移位至細(xì)胞質(zhì)的關(guān)鍵。MéNAGER等［30］以人工合成的Melan-A的長肽（第16～40 位肽段）為模式抗原，發(fā)現(xiàn)moDCs對該長肽的交叉提呈依賴于p97內(nèi)體轉(zhuǎn)位。ZEHNER等［31］的后續(xù)研究則發(fā)現(xiàn)腫瘤易感因子101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）可負(fù)性調(diào)控MR 的K48泛素化，p97內(nèi)體轉(zhuǎn)位減少導(dǎo)致抗原移位到胞質(zhì)減少，降低DCs 的交叉提呈能力。因此，ERAD 成員蛋白p97、Hrd1p 介導(dǎo)內(nèi)體抗原到細(xì)胞質(zhì)的移位，Sec61 則介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白轉(zhuǎn)位到內(nèi)體，二者協(xié)同促進(jìn)DCs 對外源性抗原的交叉提呈。因此，以適應(yīng)性免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)的DC 疫苗首先應(yīng)聚焦于p97、Hrd1p、Sec61等靶分子，至于其他ERAD成員蛋白是否具有類似功能，尚待進(jìn)一步研究。

5 蛋白酶體降解抗原對交叉提呈的影響

移位進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的DCs 被蛋白酶體加工處理，該過程與泛素化密切相關(guān)［32］。泛素由76 個氨基酸組成，一個完整的泛素化過程需由泛素活化酶E1、結(jié)合酶E2 及連接酶E3 共同完成［33］?；罨窫1 在ATP 催化下，將泛素的羧基端與半胱氨酸形成硫酯鍵，在結(jié)合酶E2作用下，活化的泛素與結(jié)合酶E2半胱氨酸殘基結(jié)合，再由連接酶E3催化泛素分子羧基結(jié)合到靶蛋白賴氨酸側(cè)鏈上［34-35］。泛素有7 個賴氨酸（lysine，K）殘基，因此，蛋白的泛素化也可根據(jù)其發(fā)生泛素化的賴氨酸位置而分為K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63等方式的泛素化［36］。YOU等［37］以泛素化抑制劑PYR-41 或沙度利胺（Thalidomide）抑制NF-κB 通路泛素化所致的激活，觀察到內(nèi)體對p97 及Sec61 的招募減少并致內(nèi)化抗原的細(xì)胞質(zhì)移位降低，從而損害DCs 的交叉提呈。SONG 等［38］以病毒侵染巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RNF128 經(jīng)TBK1 發(fā)生K63泛素化而活化IFN- β 通路來發(fā)揮抗病毒作用。ZEHNER 等［31］利用表達(dá)MR K48 泛素化的突變體的DCs，發(fā)現(xiàn)MR 的K48 泛素化可明顯促進(jìn)DCs 對抗原的交叉提呈，而TSG101 則負(fù)性調(diào)控該交叉提呈過程。上述研究提示，DCs 表面受體的泛素化方式?jīng)Q定了內(nèi)吞抗原的亞細(xì)胞定位及蛋白降解途徑。MR及其他受體的泛素化方式對細(xì)胞交叉提呈能力的影響有待于進(jìn)一步研究。

6 抗原肽裝載至MHCⅠ類分子對交叉提呈的影響

DCs交叉提呈中所內(nèi)吞的抗原被蛋白酶體降解后，仍保留存在較長的肽段。只有經(jīng)胰島素調(diào)節(jié)氨肽酶（insulin-regulated aminopeptidase，IRAP）或內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 氨 肽 酶（endoplasmic reticulum aminopeptidase，ERAP）剪切的短肽，才能裝載于MHCⅠ類分子抗原肽結(jié)合溝槽［39］。因此，合適長度的抗原短肽及MHCⅠ類分子的數(shù)量也決定了DCs 的交叉提呈。一般而言，MHCⅠ類分子主要有來源于細(xì)胞表面、自內(nèi)體器室循環(huán)到吞噬體和經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入到內(nèi)體器區(qū)室3種來源［7］。BASHA等［40］通過調(diào)控MHCⅠ類分子胞質(zhì)段酪氨酸活性而調(diào)節(jié)其自胞膜向胞內(nèi)的運(yùn)輸，發(fā)現(xiàn)來自細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子影響DCs 的交叉提呈。NAIR-GUPTA 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，SNAP-23 磷酸化可增加Rab11a 介導(dǎo)的MHCⅠ類分子自循環(huán)內(nèi)體轉(zhuǎn)位到吞噬體而促進(jìn)交叉提呈。MONTEALEGRE等［42］也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)體器室及細(xì)胞表面GTP 酶Arf6 可通過影響MHCⅠ類分子與Rab11a+內(nèi)體的共定位而調(diào)節(jié)DCs 對Fc 受體介導(dǎo)的抗原提呈。以Brefeldin A（BFA）阻斷MHCⅠ類分子自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，或抑制目的分子CD74 從而抑制MHCⅠ類分子自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位至內(nèi)體中發(fā)現(xiàn)，將MHCⅠ類分子滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可明顯抑制交叉提呈［43-44］。上述研究均提示，內(nèi)體中MHCⅠ類分子的數(shù)量也是DCs 交叉提呈能力的決定因素。

7 結(jié)語與展望

近年來，國內(nèi)外對DCs 交叉提呈的機(jī)制已有報道。但涉及交叉提呈的深層次問題，如液泡途徑和內(nèi)體-細(xì)胞質(zhì)途徑的準(zhǔn)確界定、可溶性抗原或顆粒性抗原的機(jī)制區(qū)別、泛素化方式對抗原亞細(xì)胞定位的影響、抗原在胞內(nèi)的移位過程及機(jī)制、MHCⅠ類分子的移位及轉(zhuǎn)運(yùn)等，均需要新的探索。此類探索不僅可認(rèn)識DCs 新的生物學(xué)特性，也為設(shè)計基于適應(yīng)性免疫應(yīng)答的DCs 疫苗提供新的靶點(diǎn)，為維護(hù)人類健康做出新的免疫學(xué)貢獻(xiàn)。