中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)與炎癥性腸病關(guān)系的研究進(jìn)展①

馬雪妮 許慧梅 程 龍 楊一蕃 張德奎

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，蘭州 730030）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是常見的慢性、反復(fù)發(fā)作性、非特異性胃腸道自身炎癥性疾病，主要包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）［1］。已有的證據(jù)表明，基因、環(huán)境、免疫等多種因素共同參與IBD 的發(fā)?。?-3］。IBD 的主要病理變化是異常的黏膜免疫和炎癥反應(yīng)，其主要特點(diǎn)包括促炎癥細(xì)胞因子、氧自由基、氮的生成及炎癥細(xì)胞的激活。其中，中性粒細(xì)胞是參與組織炎癥損傷的主要細(xì)胞，其在IBD 中的主要機(jī)制涉及遷移并聚集在炎癥部位，并釋放炎癥因子及大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4-5］。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究表明：作為一種有別于細(xì)胞壞死和凋亡的特殊細(xì)胞死亡程序，中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）與許多自身免疫/炎癥性疾?。巯到y(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、痛風(fēng)及小血管炎等］、腫瘤性疾?。ǚ伟?、乳腺癌及結(jié)直腸癌等）、創(chuàng)傷愈合（糖尿病患者創(chuàng)傷愈合）、感染性疾病（敗血癥及膿毒癥等）、血栓性疾?。ㄏ轮铎o脈血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等）等密切相關(guān)［6-13］。而炎癥性腸病作為胃腸道自身炎癥性疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本文重點(diǎn)就NETs 與炎癥性腸病關(guān)系的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制和治療方案提供新思路。

1 NETs概述

1996 年，TAKEI 等［7］使用氟波醇（phorbol myristate acetate，PMA）激活中性粒細(xì)胞時(shí)觀察到，中性粒細(xì)胞的分葉核退縮、擴(kuò)散，染色體解聚，核膜破裂，核內(nèi)成分釋放到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜破裂。同時(shí)，BRINKMANN 等［14］在2004 年將該過程中釋放于細(xì)胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正式命名為NETs。隨著后續(xù)研究的不斷深入，NETs 被認(rèn)為是以DNA 為骨架，其間鑲嵌組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、鈣衛(wèi)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、組織蛋白酶G 等顆粒蛋白、蛋白水解酶、抗菌肽及組蛋白等［15］。目前已發(fā)現(xiàn)，多種物質(zhì)能誘導(dǎo)NETs 形成，包括細(xì)菌、真菌、原生動物、病毒等在內(nèi)的病原體和一些化學(xué)或生物因素［7，16-19］。中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs的過程被稱為NETosis，目前研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)刺激物的不同，其主要涉及3種不同模式：①自殺式NETosis：又稱晚期溶解性NETosis，此類NETs的產(chǎn)生起始于中性粒細(xì)胞受到PMA 等刺激后通過蛋白激酶C（PKC）激活Raf/MERK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，進(jìn)而刺激ROS 產(chǎn)生，從而組蛋白在肽?；彼崦搧啺访?（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）的作用下向瓜氨酸化組蛋白轉(zhuǎn)變，形成瓜氨酸化的組蛋白，其中瓜氨酸化的組蛋白H3（citH3）發(fā)揮了重要作用，并導(dǎo)致核染色體解聚［20］。該過程僅需2～4 h，并且與凋亡機(jī)制不同，其不需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases，Caspase）的參與。此過程主要依賴于ROS的產(chǎn)生及PAD4 介導(dǎo)的核染色體解聚［20］；②細(xì)胞核DNA 釋放式NETosis：又稱為早期非溶解性NETosis，Toll 樣受體和補(bǔ)體C3 蛋白等可觸發(fā)此種類型的NETosis，釋放NETs 后的中性粒細(xì)胞壽命不受影響，且細(xì)胞核膜和細(xì)胞膜的完整性不被破壞，仍具有運(yùn)動、趨化、吞噬病原體的能力，此過程約持續(xù)5～60 min［15］。但與自殺式NETosis 不同，該過程不依賴于ROS 的產(chǎn)生和Raf/MERK/ERK 信號通路的激活，然而該模式具體的發(fā)生機(jī)制尚不清楚［8］；③線粒體DNA 釋放式NETosis：此類NETosis 同樣依賴于ROS 的產(chǎn)生，主要由于中性粒細(xì)胞受到GM-CSF、C5a 或LPS 刺激，持續(xù)約15 min［15］。

2 NETs與IBD的關(guān)系

2.1 NETs 放大IBD 的炎癥反應(yīng) IBD 主要表現(xiàn)為腸道黏膜慢性、反復(fù)發(fā)作性、非特異性炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)：中性粒細(xì)胞的浸潤與內(nèi)鏡下嚴(yán)重程度和全身炎癥指數(shù)相關(guān)，而血清中C-反應(yīng)蛋白的水平和糞便中的乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白可作為腸道炎癥的敏感標(biāo)志物，值得注意的是，乳鐵蛋白和鈣衛(wèi)蛋白都是NETs的關(guān)鍵組成部分［21-23］。與之相似的是，2012年的一篇研究報(bào)道了在UC 患者的結(jié)腸組織中檢測到穿透素3（PTX3）、MPO以及NE，三者均為NETs的組成部分［24］。雖然這些分子可以獨(dú)立于NETs 分泌，但目前研究表明其在IBD炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。BENNIKE 等［11］采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在UC 患者組織標(biāo)本中，有11種與中性粒細(xì)胞及NETs 有關(guān)的蛋白質(zhì)水平升高，并且通過共聚焦顯微鏡觀察在UC 患者的結(jié)腸組織標(biāo)本中進(jìn)行了驗(yàn)證。DINALLO 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，UC 患者結(jié)腸組織中PAD4 和citH3 的表達(dá)均增加。體外實(shí)驗(yàn)也表明，NETs 增加了UC 患者固有層單核細(xì)胞（LPMCs）炎癥細(xì)胞因子（如IL-1β和TNF-α）的產(chǎn)生?？赡艿臋C(jī)制是NETs 能夠增強(qiáng)UC 患者LPMCs 的ERK1/2的磷酸化，而選擇性的ERK1/2抑制劑——PD98059 顯著降低了NETs 誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用3.0%的葡聚糖硫酸鈉溶液（dextran sulphate sodium，DSS）能夠誘導(dǎo)BALB/c 小鼠產(chǎn)生NETs，主要表現(xiàn)為DSS 干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織中PAD4 及citH3 的表達(dá)量明顯高于對照組，同時(shí)，采用選擇性PAD4 的抑制劑——鏈黑菌素能夠有效地緩解DSS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，NETs 可引起巨噬細(xì)胞釋放促炎癥細(xì)胞因子，HU等［26］的研究結(jié)果揭示了NETs 作為損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的復(fù)合物（包含DNA、組蛋白和絲氨酸蛋白酶等），在LPS 存在的情況下通過Caspase-1 和Caspase-8 的作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞樣J774 細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，NET 相關(guān)的DNA 和絲氨酸蛋白酶參與了細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β。而IL-1β 是一種典型的促炎癥細(xì)胞因子，可刺激局部和全身炎癥反應(yīng)。最近的一項(xiàng)研究顯示，NETs能顯著增強(qiáng)單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞對低劑量LPS的反應(yīng)，并增加TNF-α、IL-6 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的釋放，而DNase 可顯著降低該細(xì)胞的激活，同時(shí)，TNF-α、IL-6和MCP-1分泌量均減少［27］。因此，NETs可能通過附著于細(xì)胞外游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA）骨架上的蛋白水解酶、顆粒蛋白及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子等作用放大了IBD的炎癥反應(yīng)。

2.2 NETs 加劇IBD 的組織損傷 腸道上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cell，IEC）損傷導(dǎo)致腸上皮屏障功能受損是UC 的病理生理學(xué)表現(xiàn)之一，同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelium cell，EC）受損也會導(dǎo)致局部潰瘍黏膜延遲愈合，加重腸道損傷。GOTTLIEB等［28］研究結(jié)果表明，無論是兒童UC 還是CD 患者，NETs的表達(dá)明顯高于健康對照組。MARIN-ESTEBAN等［29］的研究結(jié)果顯示，PLB-985 細(xì)胞系分化的中性粒細(xì)胞，在Escherichia coli誘導(dǎo)下產(chǎn)生的NETs 能夠破壞人腸上皮樣細(xì)胞Caco-2/TC7 細(xì)胞的F-肌動蛋白細(xì)胞骨架，可能的原因是鑲嵌于游離DNA 骨架上的組蛋白、蛋白酶及ROS 介導(dǎo)的損傷作用。同時(shí)，部分研究指出作為NETs 的重要組成部分，包括蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、MPO、NE、組蛋白和組織蛋白酶G等在內(nèi)的中性粒細(xì)胞蛋白的抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)自身抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA），可作為IBD 診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［30］。這些分子在NETs 形成期間釋放，該過程可能也是ANCA產(chǎn)生的重要原因。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：ANCA可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs 并激活補(bǔ)體導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，暴露于NETs 的樹突狀細(xì)胞可誘導(dǎo)ANCA 產(chǎn)生，而在IBD 患者血清中也能檢測到針對MPO 的ANCA。有趣的是，與CD 相比，針對PR3 的ANCA在潰瘍性結(jié)腸炎患者的組織標(biāo)本中更容易檢測出來，從而可以區(qū)分兩種疾?。?1］?？赡艿脑蚴沁@兩種疾病釋放出的NETs 在組成成分上存在一定差異。同樣，作為NETs的重要組成部分，NE的水平在IBD 患者糞便中升高，其破壞了上皮屏障功能，而抗彈性蛋白酶治療能夠改善小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。另一方面，近期有文獻(xiàn)報(bào)道，NETs 分別通過組胺及PR3 介導(dǎo)了小血管炎和敗血癥中血管內(nèi)皮功能損傷，而此作用在中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中得到驗(yàn)證［32］。另外，有研究指出，除了NETs 引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)腸道炎癥和潰瘍以外，受損的血管內(nèi)皮還能轉(zhuǎn)化為促凝表型，可能與活化的血小板共同作用，導(dǎo)致腸道外血栓的形成。而DNase 處理后，DSS 小鼠結(jié)腸炎腸道黏膜上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡明顯低于對照組［27］。因此，NETs可能通過破壞腸道黏膜上皮屏障功能及損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)IBD的發(fā)生發(fā)展。

2.3 NETs 促進(jìn)IBD 的高凝狀態(tài) 動靜脈血栓栓塞是IBD 患者死亡的重要原因。近年來，NETs 與動靜脈血栓的研究越來越多，研究表明：NETs 通過自身網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成一個(gè)支架，用于黏附血小板、紅細(xì)胞（RBC）和血小板黏附分子，例如纖維蛋白原、血管性血友病因子（VWF）和纖連蛋白。同時(shí)，NETs 的許多組成部分均可主動觸發(fā)血小板活化和血液凝固，如組蛋白H3和H4對內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有高度的細(xì)胞毒性，同時(shí)它們也可以觸發(fā)血小板聚集。而NE 和組織蛋白酶G 主要通過組織因子途徑抑制劑（TFPI）的蛋白水解作用增強(qiáng)組織因子和XII 驅(qū)動的凝血。此外，NETs也可直接結(jié)合XII因子，并與血小板共同激活XII因子［33］。HE等［13］研究表明，NETs促進(jìn)了IBD 患者的促凝活性，同時(shí)會加重血栓栓塞事件的發(fā)生。其中，TNF-α 在IBD 患者外周血中增加，從而引起NETs 釋放，而以上過程主要與血小板-中性粒細(xì)胞相互聚集及宿主細(xì)胞與微生物相互作用相關(guān)。NETs 誘導(dǎo)產(chǎn)生的ANCAs 可引起磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，并為凝血因子FXa和凝血酶原酶復(fù)合物提供結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)凝血酶和纖維蛋白生成。而凝血酶和FXa除了是凝血過程的被動介體外，還通過PAR 信號參與IBD 患者和小鼠模型中炎癥的惡化和延長［34］。因此作者指出，NETs、磷脂酰絲氨酸及其誘導(dǎo)的凝血酶和FXa在IBD中提供了橋接免疫、炎癥和血栓形成的聯(lián)系。此外，NETs 參與血栓形成，通常是由配體結(jié)合中性粒細(xì)胞Toll樣受體2（TLR2）和TLR4或IgG復(fù)合物的受體［35］。此外，體外研究發(fā)現(xiàn)，TLR2和TLR4拮抗劑能夠降低PS+血小板的百分比及PS+的血小板微粒含量，同時(shí)，TLR4拮抗劑也能降低PS 在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUCECs）的表達(dá)［27］。因此，NETs 可能通過影響機(jī)體凝血功能在IBD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

3 NETs與IBD治療的關(guān)系

各種靶向NETs 的治療藥物已在臨床中得到運(yùn)用，如：囊性纖維化、痛風(fēng)和SLE，預(yù)計(jì)在IBD 中也可能發(fā)揮作用［8，36］。目前，IBD 的常規(guī)治療（包括氨基水楊酸制劑、激素等）雖有一定療效，但仍存在部分患者對標(biāo)準(zhǔn)劑量激素反應(yīng)差，或存在長期激素依賴抵抗情況；而針對部分激素治療效果較差的中重度IBD 患者而言，以抗TNF-α 為代表的生物制劑極大改善了IBD 患者預(yù)后生存［37］。有研究指出，TNF-α能誘導(dǎo)UC 患者中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，而英夫利西單抗（IFX）通過阻斷TNF-α 可顯著降低UC 患者結(jié)腸組織中PAD4 和NETs 表達(dá)，為臨床上抗TNF-α 治療難治性IBD 提供了一定依據(jù)［25］。此外，動物實(shí)驗(yàn)顯示，DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道的擬桿菌和梭狀芽孢桿菌明顯增加，給予IBD 小鼠模型抗生素或?qū)⑿∈笾刂糜跓o菌環(huán)境中都能顯著緩解病情，從而證明腸道菌群在UC 發(fā)病中起到一定的作用［38］。VONG等［39］提到，CD患者的結(jié)腸組織中能經(jīng)常分離到黏附侵襲性大腸埃希菌（adherent-invasiveEscherichia coli，AIEC），在使用抗生素的基礎(chǔ)上，該細(xì)菌能增加實(shí)驗(yàn)性小鼠NETs 及ROS 的產(chǎn)生。同樣，Afa/Dr 彌散黏附大腸桿菌（diffusely adheringEscherichia coli，DAEC）菌株C1845 誘導(dǎo)NETs 殺死細(xì)菌并損傷人腸上皮樣細(xì)胞［29］。同時(shí)，有研究指出作為一種益生菌——鼠李糖乳桿菌能夠抑制ROS 及NETs 的產(chǎn)生，該現(xiàn)象在體外實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞及人早幼粒細(xì)胞系d.HL-60 中得到驗(yàn)證［40］?；谝陨涎芯?，益生菌可能通過NETs 調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)，改善腸道菌群比例失調(diào)，修復(fù)損傷腸道黏膜，從而廣泛用于IBD的輔助治療。此外，由于NETs產(chǎn)生過程的復(fù)雜性及組成成分的多樣性，多種物質(zhì)可直接或間接地作用于NETs，可能成為治療IBD 的前體物質(zhì)，如作用于cf-DNA 的DNase 1、PAD4選擇性抑制劑鏈黑菌素、ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸、MPO 的抑制劑PF1355、內(nèi)源性NETosis 的抑制劑前列腺素E2（PGE2）等［8，25，27，36］。因此，NETs 靶向治療將為IBD提供更多的治療選擇。

4 結(jié)語

自發(fā)現(xiàn)NETs 的10 余年來，有關(guān)NETs 的研究成為多種疾病的研究熱點(diǎn)。由于NETs 自身組成成分中含有自身免疫性抗原物質(zhì)，因此NETs 也與自身免疫性/炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而炎癥性腸病屬于腸道自身炎癥性疾病，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NETs 可能通過放大炎癥反應(yīng)，加劇組織損傷、促進(jìn)高凝狀態(tài)等過程在IBD 中發(fā)揮重要作用，NETs 相關(guān)分子很可能成為IBD 治療干預(yù)的靶標(biāo)。然而，NETs在IBD 中具體的作用機(jī)制及NETs 與UC 和CD 之間的關(guān)系是否存在一定的差異尚不明確，因此，今后需要開展更多高質(zhì)量的體外及體內(nèi)研究，以期為IBD 的治療方案和特異性靶點(diǎn)藥物的開發(fā)提供新的思路。