Toll樣受體激動(dòng)劑在變應(yīng)性氣道炎性疾病治療中的研究進(jìn)展①

劉佩強(qiáng) 許 昱（武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430060）

變應(yīng)性哮喘和變應(yīng)性鼻炎（AR）是目前最為常見的變應(yīng)性氣道炎性疾病，常將兩者稱為“同一氣道，同一疾病”。在過(guò)去的幾十年里，這兩種疾病的發(fā)病率逐年增加［1］。為了開發(fā)更安全有效的免疫疫苗或新的獨(dú)立療法，先天性免疫的模式識(shí)別受體（PRRs）成為重要的研究目標(biāo)［2-3］。Toll樣 受 體（TLRs）是識(shí)別入侵病原體的常見PRRs，并協(xié)調(diào)隨后的免疫反應(yīng)。在哮喘和AR患者中，TLRs的表達(dá)和功能與健康受試者顯著不同，這種免疫防御的差異可能是患者呼吸道易感性原因之一［4-5］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TLRs可作為干預(yù)免疫反應(yīng)進(jìn)程的靶點(diǎn)，TLRs激動(dòng)劑可通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受或氣道免疫反應(yīng)向Th1分化來(lái)阻止變應(yīng)性氣道疾病的進(jìn)展，為恢復(fù)過(guò)敏患者氣道保護(hù)性免疫反應(yīng)提供了切實(shí)的希望［5-6］。目前，TLRs激動(dòng)劑在變應(yīng)性氣道疾病的研究主要集中在TLR的2、4、7、8、9亞型，下文將重點(diǎn)闡述。

1 TLR2激動(dòng)劑

TLR2位于胞膜上，通常與TLR1形成異源二聚體來(lái)識(shí)別脂蛋白、肽聚糖等細(xì)菌來(lái)源的配體。TLR2激動(dòng)劑Pam3Cys和Pam3CSK4是生物合成的三?；鞍?，可作為抗過(guò)敏劑或免疫佐劑。霧化吸入Pam3Cys使卵清蛋白（OVA）致敏小鼠出現(xiàn)哮喘且短暫性加重，但隨后氣道高反應(yīng)減輕或消失，嗜酸性粒細(xì)胞顯著減少，肺浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量 增加［7］。Pam3Cys也可增 加CD80和CD86的 表達(dá)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DCs）的激活，隨后增加支氣管肺泡中干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生，而IFN-γ能有效抑制Th2反應(yīng)，抑制嗜酸粒細(xì)胞的活化、分化和募集［8］。另一方面，經(jīng)鼻給藥Pam3CSK4可抑制2型肺泡細(xì)胞產(chǎn)生的IL-33來(lái)緩解慢性哮喘癥狀，既減輕急性感染的嚴(yán)重程度，也可下調(diào)Th2炎癥反應(yīng)［9］。此外，無(wú)論是在特異性免疫治療（SIT）期間還是在SIT之后較長(zhǎng)時(shí)間，Pam3CSK4可改善鼻癥狀評(píng)分，降低鼻呼氣一氧化氮（nNO）水平［10］；Pam3CSK4在體外刺激來(lái)源于哮喘或AR患者的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）后，CD8+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量增多，并抑制CD4+T細(xì)胞增殖和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此可能作為SIT的良好佐劑［10-11］。

支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽-2（MALP-2）是從發(fā)酵支原體中獲得的TLR2/6激動(dòng)劑。MALP-2可誘導(dǎo)B細(xì)胞和DCs中CD80、CD86、CD40以及主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ和Ⅱ的表達(dá)，也增加DCs釋放IFN-γ的能力［12］。在小鼠哮喘模型中，經(jīng)霧化吸入MALP-2可使氣道高反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞因子顯著降低。同時(shí)，MALP-2促進(jìn)氣道中性粒細(xì)胞增多和IL-12 p70亞基的產(chǎn)生，并產(chǎn)生趨化因子，刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞在小鼠的肺內(nèi)積聚［13］。此外，BPPcysMPEG是MALP-2的 衍生物，也能刺激TLR2/6。在離體的肺組織切片中，BPPcysMPEG通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、趨化因子4（CCL4）和IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在OVA致敏小鼠中，體內(nèi)和局部給予含過(guò)敏原的BPPcysMPEG可使DCs成熟，并誘導(dǎo)其對(duì)過(guò)敏原產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答［14］。在塵螨致敏的小鼠中，BPPcysMPEG還能減少嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)TNF-α和IFN-γ的生成，同時(shí)在支氣管肺泡和縱隔淋巴結(jié)中誘導(dǎo)Th1反應(yīng)［15］。上述研究提示，TLR2激動(dòng)劑可在體內(nèi)外誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生，消除Th2反應(yīng)，同時(shí)也有望成為有效的免疫佐劑。

2 TLR4激動(dòng)劑

TLR4位于胞膜上，以TLR4為靶點(diǎn)治療哮喘或AR，其應(yīng)用基礎(chǔ)是TLR4激動(dòng)劑作為免疫佐劑來(lái)誘導(dǎo)耐受。單磷脂酰脂A（MPL）是一種TLR4激動(dòng)劑，來(lái)自沙門氏菌脂多糖（LPS）的解毒衍生物，是FDA唯一批準(zhǔn)用于AIT的第二代佐劑［16］。MPL是LPS經(jīng)水解和隨后色譜分析法得到的，它有一個(gè)磷酸基和六個(gè)?；鶄?cè)鏈，但沒(méi)有多糖側(cè)基。因此，MPL保留了LPS的免疫調(diào)節(jié)特性，但沒(méi)有其毒性［17］。MPL是人類疫苗中批準(zhǔn)的第一種TLR激動(dòng)劑，已被用于許多疫苗制劑中，尤其是在乙型肝炎和人乳頭狀瘤病毒疫苗中，不良事件的發(fā)生率極低［18］。自1999年以來(lái)，過(guò)敏患者已接受以MPL為佐劑的過(guò)敏疫苗臨床治療［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，MPL刺激TLR4后，DCs成熟并產(chǎn)生細(xì)胞因子，尤其是IL-12，可促進(jìn)T細(xì)胞向Th1分化［20］。一項(xiàng)針對(duì)13例花粉過(guò)敏患者PBMCs的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物花粉提取物和MPL的體外刺激可誘導(dǎo)IFN-γ增加，而IL-5減少。當(dāng)添加抗IL-12的中和抗體時(shí)，可抑制大約95%的IFN-γ產(chǎn)生。這也提示，MPL以IL-12和單核細(xì)胞依賴的方式使Th2向Th1偏移［21］。另外，MPL使哮喘患者肺部炎癥減少，如呼氣中的8-異前列腺素等氧化應(yīng)激標(biāo)志物減少，且無(wú)危險(xiǎn)副作用報(bào)告［22］。

CRX-675是一種水性MPL化合物，是抗過(guò)敏治療的獨(dú)立鼻內(nèi)制劑。經(jīng)鼻給藥CRX-675僅在100μg劑量下就能減輕AR患者的鼻部癥狀，14 d的使用期內(nèi)耐受良好且安全。CRX-675能降低小鼠哮喘模型中血清總IgE水平、氣道高反應(yīng)、氣道嗜酸性粒細(xì)胞和IL-13［23］。另外，TLR4激動(dòng)劑聚谷氨酸（γ-PGA）從桿菌細(xì)胞壁獲得，誘導(dǎo)DCs上共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達(dá)，并上調(diào)IL-12，可抑制Th2細(xì)胞因子、氣道高反應(yīng)和嗜酸性粒細(xì)胞［24］。ER-803022是一種合成的新型TLR4激動(dòng)劑，其抑制氣道高反應(yīng)、氣道嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-12、IFN-γ的產(chǎn)生以及通過(guò)TLR4/MyD88途徑抑制Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生［25］。UT12是另一種與TLR4/MD-2復(fù)合物結(jié)合的單克隆激動(dòng)性抗體，它可以在不誘導(dǎo)Treg或Th1細(xì)胞因子的情況下，通過(guò)消除Th2和Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)抑制變應(yīng)性氣道炎癥［26］。因此，TLR4激動(dòng)劑既作為成熟的免疫佐劑，還抑制Th2反應(yīng)，從而改善過(guò)敏癥狀。

3 TLR7/8激動(dòng)劑

TLR7位于胞內(nèi)，與TLR8形成異源二聚體來(lái)識(shí)別病毒來(lái)源的單鏈RNA。局部應(yīng)用TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特后，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和TNF-α的產(chǎn)生減少，DCs和NK細(xì)胞在肺組織中蓄積，并誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生［27］。咪喹莫特也可激活小鼠哮喘模型中一氧化氮、前列腺素和鈣激活鉀通道，發(fā)揮支氣管擴(kuò)張的作用［28］。瑞喹莫德（R848）是一種TLR7/8激動(dòng)劑，是治療氣道炎性疾病很有前景的免疫佐劑。rBet v1疫苗聯(lián)合R848的皮下免疫刺激特異性Th1反應(yīng)，有效抑制了樺樹花粉誘導(dǎo)的哮喘［29］。Der f1疫苗聯(lián)合R848在抑制過(guò)敏性哮喘方面顯示出較強(qiáng)的治療效果［30］。R848也可作為獨(dú)立治療方法，鼻內(nèi)應(yīng)用能有效抑制哮喘特征，如氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、黏液過(guò)度分泌，顯著降低IL-5、IL-13和IL-17的水平，并通過(guò)誘導(dǎo)IFN-γ和IL-27來(lái)抑制小鼠哮喘的發(fā)作［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白1/3（TIM1/3）與Th2介導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥有關(guān)，而R848可誘導(dǎo)的AR小鼠鼻黏膜TIM1/3表達(dá)下調(diào)，顯著減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞增生，下調(diào)血清和鼻黏膜IL-13、IL-17水平，增加Th1和Treg細(xì)胞比例，降低Th2和Th17細(xì)胞比例，并減輕AR小鼠的鼻部癥狀［32-33］。此外，R848可誘導(dǎo)AR小鼠PBMCs中IL-10和IFN-γ表達(dá)上調(diào)［33］。又有發(fā)現(xiàn)，TLR7基因缺失誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中IL-25、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）表達(dá)升高，2型先天淋巴樣細(xì)胞（ILC2s）募集以及Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，而R848可通過(guò)調(diào)節(jié)IL-25、IL-33表達(dá)水平來(lái)緩解AR［33］。另外，R848可通過(guò)誘導(dǎo)IFN-γ和記憶性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哮喘的長(zhǎng)期保護(hù)作用。與咪喹莫特相似，R848具有抗病毒和平喘作用，可用于治療病毒加重的哮喘［34］。

AZD8848是一種新型的TLR7激動(dòng)劑，是第一個(gè)經(jīng)鼻給藥的免疫調(diào)節(jié)化合物。為了限制藥物對(duì)給藥部位的影響，并盡可能減少全身細(xì)胞因子產(chǎn)生的相關(guān)潛在副作用，AZD8848被設(shè)計(jì)為一種前體藥物。這種代謝不穩(wěn)定的酯類是局部活性的，但在進(jìn)入循環(huán)時(shí)被丁基膽堿酯酶迅速水解為活性低得多的代謝產(chǎn)物。鼻內(nèi)應(yīng)用AZD8848使AR患者鼻灌洗液中IL-1α增多，肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和α2-巨球蛋白減少，這提示血漿滲出和肥大細(xì)胞活性降低［35］。在一項(xiàng)AR的Ⅱa臨床試驗(yàn)中，AZD8848更多的給藥次數(shù)并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，一周內(nèi)鼻腔給藥20μg三次與60μg一次相比，出現(xiàn)不良反應(yīng)更頻繁［36］。在過(guò)敏性哮喘患者中，AZD8848經(jīng)鼻給藥可能通過(guò)刺激1型干擾素反應(yīng)來(lái)降低Th2反應(yīng)，從而緩解過(guò)敏反應(yīng)。在為期8周的治療過(guò)程中每周給藥一次，一般耐受性良好，并且最大程度降低肺局部炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，減輕全身反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［37］。VTX-1463是另一種TLR8激動(dòng)劑，經(jīng)5次鼻內(nèi)治療后，草花粉過(guò)敏的AR患者鼻部癥狀減輕，且無(wú)任何副作用［38］。在過(guò)敏原暴露后24 h，單劑量VTX-1463（500 mg）可降低鼻灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞以及肥大細(xì)胞的促炎性介質(zhì)（組胺、cysLTs、PGD2），緩解鼻部對(duì)過(guò)敏原的早期反應(yīng)。VTX-1463在過(guò)敏原暴露前使用是有效的，但考慮到其作用起效相對(duì)較快，因此可能作為加重期或常年AR患者對(duì)癥治療的輔助手段［39］。上述研究結(jié)果提示，TLR7/8激動(dòng)劑具有成為哮喘預(yù)防和治療性藥物的潛力。

4 TLR9激動(dòng)劑

TLR9位于胞內(nèi)，其作用與TLR7相似，經(jīng)MyD88途徑調(diào)節(jié)Th2/Th1平衡，緩解氣道過(guò)敏反應(yīng)、抑制氣道重塑，TLR9激動(dòng)劑可能會(huì)成為下一代哮喘輔助治療藥物。合成的TLR9激動(dòng)劑CPG-ODNs可刺激B細(xì)胞、NK細(xì)胞和特異性抗原呈遞細(xì)胞增殖，并分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和免疫球蛋白［40］。同時(shí)，CPG-ODNs通過(guò)減少氣道膠原沉積、金屬蛋白酶活性和血管再生來(lái)抑制氣道重塑，也增加有效抗原呈遞必要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)抵抗入侵病原體的能力［40］。有研究發(fā)現(xiàn)，CPG-ODNs可降低小鼠哮喘模型支氣管肺泡中嗜酸性粒細(xì)胞、IL-4、IL-5和IgE的產(chǎn)生，并提高IL-10水平［41］。在皮下或黏膜致敏的情況下，CPG-ODNs減少氣道過(guò)敏的發(fā)生［42］。然而，嚴(yán)重哮喘小鼠在給予CpG-ODNs后并未受益，Th2免疫反應(yīng)和氣道高反應(yīng)在治療后均未緩解。同樣，嚴(yán)重哮喘時(shí)CPG-ODNs對(duì)產(chǎn)生IL-12或IFN-γ的反應(yīng)較低，未對(duì)氣道高反應(yīng)性和氣道平滑肌產(chǎn)生任何影響［43］。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)12次鼻內(nèi)應(yīng)用1018 ISS（CpG-ODNs類似物）后，支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞和IL-4、IL-5、IL-13水平明顯降低，這提示短期的1018 ISS治療可能持續(xù)抑制相關(guān)過(guò)敏原引起的肺部炎癥［44］。另外，QbG10是A型CpG-ODNs，已在屋塵螨過(guò)敏的AR患者中作為單一療法或免疫疫苗配方進(jìn)行了測(cè)試，能減輕AR患者的癥狀，同時(shí)滿足患者的藥物需求，提高患者的生活質(zhì)量。此外，持續(xù)性過(guò)敏性哮喘患者類固醇藥物停用后，QbG10可改善患者的整體哮喘癥狀［45］。

過(guò)敏原-TLR9免疫刺激DNA序列結(jié)合物（AIC）在臨床治療上也很有希望。季節(jié)性花粉暴露后，AIC短期治療增加AR患者鼻黏膜CD4+CD25+Treg細(xì)胞浸潤(rùn)，可減少Th2反應(yīng)［46］。經(jīng)AIC處理后，隨著Th1/Th2比值的升高，IgE的生成量可能出現(xiàn)短暫的增加，然后優(yōu)勢(shì)型IgE向IgG轉(zhuǎn)變。但是在后續(xù)的臨床試驗(yàn)中AIC并沒(méi)有減少AR患者的鼻部癥狀，對(duì)于AIC的起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間仍存在爭(zhēng)議［47］。此外，它也未能減輕兒童的哮喘癥狀。最近，一種新的TLR9激動(dòng)劑AZD1419被引入治療哮喘和AR。AZD1419具有更強(qiáng)的藥理活性，在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)對(duì)氣道過(guò)敏反應(yīng)的持久抑制，在臨床試驗(yàn)中安全且耐受性良好。同時(shí)，AZD1419能誘導(dǎo)強(qiáng)大IFN信號(hào)，這可能直接解決Th2反應(yīng)的失調(diào)并影響氣道炎癥進(jìn)展［48］。然而，也有研究顯示，部分TLR9激動(dòng)劑對(duì)哮喘治療無(wú)效［49］，關(guān)于TLR9激動(dòng)劑的作用仍需更多數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

5 小結(jié)與展望

幾乎所有的TLRs都在氣道炎癥的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮前哨作用，是調(diào)節(jié)變應(yīng)性疾病自然進(jìn)程的重要靶點(diǎn)。某些TLRs激動(dòng)劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性，使它們適合作為免疫疫苗的佐劑；而某些TLRs激動(dòng)劑可作為單獨(dú)的治療方法來(lái)緩解哮喘和AR的癥狀。然而，仍有許多問(wèn)題待解決。目前的大多數(shù)臨床試驗(yàn)都是在成人受試者上進(jìn)行的，而TLRs激動(dòng)劑對(duì)過(guò)敏兒童的治療有效性證據(jù)不足。其次，盡管TLRs激動(dòng)劑在抑制氣道高反應(yīng)和氣道重塑方面有很好的應(yīng)用前景，但通常用于輕度至中度哮喘，應(yīng)用于重癥哮喘仍有待進(jìn)一步研究。此外，由于不適當(dāng)?shù)慕o藥可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的免疫反應(yīng)，存在有關(guān)靶向TLRs的最佳配方的時(shí)間、劑量、患者選擇等其他問(wèn)題。目前對(duì)于TLRs激動(dòng)劑在變應(yīng)性氣道疾病中作用的研究主要集中在下氣道方面，而對(duì)于以鼻部炎癥為代表的上氣道疾病才剛剛起步?，F(xiàn)已知曉，AR與哮喘有著密切的聯(lián)系，即所謂“聯(lián)合氣道疾病”。因此，應(yīng)該重視上、下氣道炎癥反應(yīng)的相關(guān)性以及AR和哮喘協(xié)同治療的臨床意義。這也提示我們應(yīng)針對(duì)TLRs激動(dòng)劑在氣道變應(yīng)性炎癥中的作用及機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究，從而為臨床干預(yù)AR和哮喘等變應(yīng)性氣道疾病探索新的途徑。