間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在眼部疾病中的研究進(jìn)展①

付長秀 孫建偉 張蕓 吳文哲 鄭永欽 賀軍棟（昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650000）

眼功能障礙是一種普遍存在的健康問題，世界衛(wèi)生組織（WHO）在全球范圍內(nèi)進(jìn)行了數(shù)年的努力，已最大限度地減少視力損害或殘障。雖然治療策略已經(jīng)發(fā)生了實質(zhì)性的轉(zhuǎn)變，但仍存在一些挑戰(zhàn)。眼睛，一個獨特的視覺感覺器官，被認(rèn)為是一個防止免疫原性炎癥的免疫豁免部位［1］。盡管如此，仍存在幾種涉及眼部的炎癥性疾病和免疫介導(dǎo)的疾病，嚴(yán)重的會導(dǎo)致視力障礙，例如干眼綜合征、角膜同種異體排斥反應(yīng)、葡萄膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性等［2-4］。這些眼部疾病給人們的日常生活帶來了極大的不便，因此許多研究者都在探索新的治療方法。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是具有分化、釋放再生生長因子和免疫調(diào)節(jié)等功能且存在于多種組織中的成體干細(xì)胞［5］。MSC在一定條件下可以分化成各種類型的間充質(zhì)譜系細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞［6］。它們具有增殖和遷移至損傷部位的能力，并通過分泌抗炎和生長因子促進(jìn)傷口愈合［7］。它們還與先天和后天免疫細(xì)胞相互作用，并通過旁分泌作用調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。目前普遍認(rèn)為，MSC在體內(nèi)以旁分泌方式起作用，而不是直接分化［8-9］。

根據(jù)細(xì)胞中囊泡分泌的方式，細(xì)胞外囊泡可分為兩大類：一類被稱為微囊泡，直接從細(xì)胞膜脫落；另一類稱為外泌體（exosomes），當(dāng)多囊體與質(zhì)膜融合時，通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外環(huán)境［10］。外泌體最早是由PAN和JOHNSTONE在1983年發(fā)現(xiàn)的。他們發(fā)現(xiàn)在綿羊網(wǎng)狀紅細(xì)胞成熟過程中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體釋放到細(xì)胞外與一種小囊泡有關(guān)［11］。1989年，JOHNSTONE將這類功能性囊泡定義為外泌體［12］。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，直徑40~150 nm，包含特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA和DNA［13］。考慮到它們的納米尺寸，外泌體很容易穿過生物屏障并進(jìn)入靶器官，可以與特定的受體細(xì)胞相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在外泌體表面上的磷脂酰絲氨酸受體、整聯(lián)蛋白、四跨膜蛋白、凝集素、聚糖以及其他黏附分子的表達(dá)有助于該過程［14］。外泌體可以通過巨胞飲作用、吞噬作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或膜融合作用、內(nèi)化作用將信息傳遞至靶細(xì)胞，或者不遞送內(nèi)含物直接作用于細(xì)胞表面［15-18］。因此，外泌體已被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞間通訊和遞送蛋白質(zhì)、RNA、DNA和其他分子成分，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞功能的載體［19］。外泌體在生物體液中具有良好的耐受性，廣泛分布在尿液、血清、羊水、唾液、腦脊液、乳液和鼻分泌物中［20］。這些屬性為外泌體作為治療性遞送載體在心血管疾病、腎損傷、眼部疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝纖維化等疾病中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)［21-24］。

盡管MSC移植具有明顯的優(yōu)勢，但同種異體和異種免疫排斥，惡性轉(zhuǎn)化以及小血管倒伏和阻塞的風(fēng)險仍然存在［25］。然而外泌體給藥可以避免所有這些潛在風(fēng)險［26］。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exos）具有與MSC相似的功能，并且與細(xì)胞相比，外泌體更安全、穩(wěn)定、容易儲存。因此，作為基于間充質(zhì)干細(xì)胞治療策略的安全且更有利的替代方法，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體無細(xì)胞治療方法已經(jīng)開發(fā)出來，并取得了一定的成果。例如，來自特定培養(yǎng)基中的MSC-Exos在體外具有一定程度的免疫抑制作用，并且通過抑制炎癥機(jī)制在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中表現(xiàn)出治療能力［13］。也有研究證明了載有miR-132的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）外泌體作為微小RNA（mi-RNA）攜帶和轉(zhuǎn)移的載體，顯著增加了體外血管形成、Matrigel栓塞和心肌梗塞中的新生血管形成［27］。ZHAO等［28］也 發(fā) 現(xiàn) 來 源 于 骨 髓 的MSC-Exo通 過MAPK途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，從而改善骨質(zhì)疏松癥。本綜述重點討論外泌體在幾種眼病中的最新研究進(jìn)展。

2 外泌體在眼部疾病中的相關(guān)研究

2.1 角膜相關(guān)疾病角膜相關(guān)疾病主要是化學(xué)或熱灼傷，創(chuàng)傷性損傷或免疫和遺傳性疾病引起的角膜創(chuàng)傷，與炎癥、新血管形成、潰瘍和瘢痕形成有關(guān)。不正確或延遲的治療可能導(dǎo)致失明。在過去的十年中，MSC療法作為抗炎、抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)的治療策略得到廣泛的關(guān)注。在幾種組織模型中，MSC的旁分泌顯示出抑制炎癥和血管生成，促進(jìn)組織傷口修復(fù)的作用。無細(xì)胞策略在促進(jìn)角膜傷口修復(fù)中也發(fā)揮重要作用，其中涉及調(diào)節(jié)炎癥，血管生成和組織再生等各種因素。有研究已經(jīng)證實了MSC-Exos中可溶性因子對角膜創(chuàng)傷模型的體內(nèi)外治療作用。SHEN等［29］發(fā)現(xiàn)在兔脂肪MSCExos的共同培養(yǎng)下，兔角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖多，凋亡少，并有新的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（包括膠原蛋白）沉積。在小鼠淺表間質(zhì)創(chuàng)傷模型中，局部角膜基質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過TSG-6依賴途徑，下調(diào)纖維化標(biāo)志物肌腱蛋白-c、ACTA2、Col3A1和SPARC，抑制中性粒細(xì)胞浸潤，從而抑制角膜炎癥和角膜瘢痕［30］。SAMAEEKIA等［31］發(fā)現(xiàn)人角膜間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可加速角膜上皮傷口愈合，可為眼表損傷提供治療方法。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和宿主細(xì)胞之間的囊泡可以傳遞活性的β-葡萄糖醛酸苷酶，使宿主細(xì)胞能夠分解代謝積累的糖胺聚糖，從而防止了角膜混濁和視力障礙的發(fā)展［32］。以上研究表明MSCExos在角膜的損傷中起到了修復(fù)治療的作用，并且為以后角膜相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

2.2 視網(wǎng)膜相關(guān)疾病視網(wǎng)膜疾病由許多因素導(dǎo)致，如氧化應(yīng)激、遺傳疾病、光誘導(dǎo)損傷、化學(xué)損傷、血管缺陷或老化等。由于哺乳動物視網(wǎng)膜的自我再生能力有限，視網(wǎng)膜變性引起的視覺障礙很難治療。手術(shù)和藥物干預(yù)等治療方案更適合早期診斷的患者，對于晚期的患者并沒有明顯的效果。此外，一些視覺仿生設(shè)備，如ArgusⅡ，是一種無細(xì)胞視網(wǎng)膜植入物，作用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，以刺激色素性視網(wǎng)膜炎或年齡有關(guān)的黃斑變性患者的視覺傳輸，但是其費用十分昂貴，并且有用戶報告其在視覺輸出方面有一定的障礙［33-34］。因此，需要探索新的方法來治療視網(wǎng)膜疾病?，F(xiàn)有研究已經(jīng)表明，MSC已經(jīng)顯示出治療視網(wǎng)膜疾病的特殊前景，例如在急性視網(wǎng)膜損傷，視神經(jīng)損傷和自身免疫性葡萄膜炎等疾病中都取得了良好的效果［35-37］。

MSC-Exos在視網(wǎng)膜疾病中的研究也越來越普遍。由于外泌體中含有許多微小RNA（mi-RNA）、長鏈非編碼RNA（Lnc-RNA）、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并且可以將這些物質(zhì)靶向運輸?shù)教囟ǖ募?xì)胞從而發(fā)揮修復(fù)損傷的作用。在激光誘發(fā)的視網(wǎng)膜損傷小鼠模型的玻璃體中，注射了源自小鼠脂肪組織和人臍帶的MSC及其外泌體后，均減輕了玻璃體損傷，抑制了細(xì)胞凋亡，并抑制了炎癥反應(yīng)，且視覺功能的恢復(fù)程度相同。MSC-Exos注射到玻璃體后，視網(wǎng)膜中單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）明顯下調(diào)。在體外，MSC-Exos還下調(diào)熱損傷后視網(wǎng)膜細(xì)胞中的MCP-1 mRNA表達(dá)。而玻璃體內(nèi)注射MCP-1的中和抗體促進(jìn)了視網(wǎng)膜激光損傷的恢復(fù)，但同時使用MSC-Exos和MCP-1并沒有顯示出外泌體的治療作用。這些結(jié)果表明，MSC-Exos通過下調(diào)MCP-1來緩解激光誘發(fā)的視網(wǎng)膜損傷［38］。同樣，MSC-Exos還減輕了人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞藍(lán)光刺激和激光誘發(fā)的視網(wǎng)膜損傷，明顯下調(diào)了VEGF-A并逐漸改善激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，從而具有更好的視覺功能［39］。

高糖刺激和糖尿病都會引起視網(wǎng)膜炎癥等疾病?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，MSC-Exos可有效預(yù)防Ⅰ型糖尿病和實驗性自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病。此外，進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測定表明MSC-Exos抑制了抗原呈遞細(xì)胞的激活，并抑制了Th1和Th17細(xì)胞的發(fā)育。由此也揭示了MSC-Exos替代細(xì)胞療法預(yù)防自身免疫性疾病的可能性［40］。高血糖大大增加了糖尿病大鼠或暴露于高葡萄糖的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells，HREC）的炎癥，增加了caspase-1、IL-1β和IL-18的水平。MSC-Exos可以有效地逆轉(zhuǎn)這種反應(yīng)。與對照MSC-Exos相比，過表達(dá)miR-126的MSC-Exos顯著降低了高葡萄糖誘導(dǎo)的HREC中HMGB1表達(dá)和NLRP3炎性體的活性，更成功地抑制了HMGB1信號傳導(dǎo)途徑并抑制了糖尿病大鼠的炎癥。實驗結(jié)果表明MSC-Exos中的miR-126表達(dá)通過下調(diào)HMGB1信號傳導(dǎo)途徑來減少高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥［41］。

黃斑裂孔對于50歲以上的女性來說是一種健康威脅，會使中心視力下降，并且其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。ZHANG等［42］的研究表明MSC-Exos治療可促進(jìn)黃斑裂孔功能的恢復(fù)。由此說明，對于難治性黃斑裂孔患者，MSC-Exos治療可能是一種有效和安全的改善術(shù)后視力的方法。

綜上所述，MSC-Exos在視網(wǎng)膜疾病中起到了一定的保護(hù)及修復(fù)作用，還在治療炎癥方面扮演著重要角色。但是，其抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用有關(guān)的具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

2.3 眼部神經(jīng)相關(guān)疾病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglial cells，RGC），既不可替換，又不能軸突再生。RGC的功能障礙和喪失（例如青光眼和外傷性視神經(jīng)病變）是失明的主要原因。之前已證明BMSC作為神經(jīng)保護(hù)藥是有效的?，F(xiàn)在有研究證明BMSC衍生的外泌體為RGC的保護(hù)提供了顯著的治療益處，這是由其miRNA而不是蛋白質(zhì)介導(dǎo)的。并且外泌體不存在將活細(xì)胞移植到玻璃體中相關(guān)的并發(fā)癥風(fēng)險（免疫排斥，有害的增殖/分化）［43-44］。在嚙齒動物青光眼模型中，外泌體可以主動整合到神經(jīng)元從而促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)。外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)的研究雖然剛剛開始，但是已經(jīng)取得了初步的成果，為以后研究眼部神經(jīng)相關(guān)疾病提供了新的策略。

3 小結(jié)及展望

MSC-Exos已經(jīng)在眼部疾病中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，首先，MSC-Exos能夠抑制角膜炎癥，促進(jìn)角膜傷口愈合等作用；其次，無論在激光刺激的視網(wǎng)膜損傷還是高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷中，MSC-Exos都可以緩解其損傷或炎癥程度，對于難治性黃斑裂孔的術(shù)后恢復(fù)也有很大的幫助；最后，MSC-Exos還可以在青光眼中促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)。雖然MSC-Exos在眼部疾病中已經(jīng)取得一定的成果，但是仍然存在著許多未知和挑戰(zhàn)。首先，由于外泌體是高度異質(zhì)的，不同來源的外泌體對眼部疾病的作用是不一樣的，因此預(yù)選外泌體的最有效組織來源至關(guān)重要；其次，MSC-Exos在眼部疾病中的分子作用目前尚未闡明，還需要進(jìn)一步研究。此外，MSC-Exos的注射頻率和劑量仍然沒有確定，不能保證MSC-Exos持久的作用。為了成功地轉(zhuǎn)化為臨床療法，迫切需要新穎和先進(jìn)的技術(shù)來獲得大量具有穩(wěn)定功能的高純度外泌體。有挑戰(zhàn)就有希望，外泌體有望成為治療眼部疾病的新策略，從而為眼部疾病患者帶來新的希望。