魔芋軟腐病致病菌Pectobacterium aroidearum的特征及貝萊斯芽孢桿菌的生防效果

崔 雙陳昌龍馮佳豪曹 穎寇曉敏付 璐張榮萍謝 華*

（1 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；3 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621000）

魔芋（Amorphophallus konjac）屬天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物，在中國、日本和東南亞地區(qū)長期作為食物來源和藥材（Chua et al.，2010）。魔芋地下塊莖富含葡甘聚糖，這種天然的高分子優(yōu)質(zhì)膳食纖維具有可溶性、凝膠性、增稠性和成膜性等獨(dú)特理化特性，近年來被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)等生產(chǎn)領(lǐng)域（趙培城 等，2015；Devaraj et al.，2019）。魔芋在我國主要分布于云南、貴州、四川、重慶及陜南、鄂西、湘西、豫西南地區(qū)（劉佩瑛，2004）。近30 年，我國魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積常年穩(wěn)定在10 萬hm2（150 萬畝）左右，是世界魔芋原料生產(chǎn)與供給中心（周燚 等，2013）。由于其較高的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來魔芋產(chǎn)業(yè)已成為我國中西部地區(qū)農(nóng)民扶貧攻堅(jiān)的支柱產(chǎn)業(yè)（盧美歡等，2019）。細(xì)菌性軟腐病是魔芋生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重且防控極為困難的病害，在整個(gè)生長期及貯藏期均可發(fā)病，可為害葉片、葉柄及塊莖，一般引起產(chǎn)量損失20%～30%，病情嚴(yán)重地塊可導(dǎo)致產(chǎn)量損失達(dá)80%以上，甚至造成絕收（王紅巖 等，2019），嚴(yán)重制約和威脅我國魔芋產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

植物細(xì)菌性軟腐病主要致病菌包括Pectobacterium和Dickyeya屬，均可引發(fā)多種植物腐爛病害，涉及到蔬菜、花卉、果樹及大田作物（Ma et al.，2007）。其中，Pectobacterium是一個(gè)高度異質(zhì)化的類群，目前被報(bào)道有十幾個(gè)種（Portier et al.，2019）。早期我國科研人員利用表型及rRNA操縱子16S～23S rDNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（intergenic transcribed spacer，ITS）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將引起云南省魔芋軟腐病的致病菌鑒定為Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（原Erwinia carotovorasubsp.carotovora）（Gardan et al.，2003；修建華 等，2006）。2013 年，Nabhan 等（2013）基于表型、DNA-DNA 雜交、16S rDNA 和多位點(diǎn)序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA），將P.aroidearum確立為一個(gè)新種，而包含在P.aroidearum類群中的P.carotovorumPC1 被歸為P.aroidearumPC1。2018 年，該種首次在中國報(bào)道為大白菜軟腐病新致病菌，并初步描述了其生物學(xué)特征（李曉穎 等，2018；Xie et al.，2018）。而此前從陜西嵐皋縣魔芋上分離到的軟腐病致病菌M8 的16S rDNA 序列與P.carotovorumPC1 菌株關(guān)系最近（徐煒 等，2011），暗示其可能為P.aroidearum。孫苗苗（2019）通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定以及分子生物學(xué)鑒定，將在我國鄂西地區(qū)收集的魔芋軟腐病致病菌鑒定為2 個(gè)種，其中約66.7%為P.aroidearum，33.3%為Dickeya；魏環(huán)宇等（2020）基于形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試及16S rDNA 序列，將從云南西雙版納州和德宏珠芽魔芋分離到的軟腐病致病菌鑒定為P.aroidearum。然而，目前對云南富源、楚雄及四川宜賓等魔芋主要種植區(qū)最為嚴(yán)重的軟腐病害的致病菌種類和分類地位尚不清楚。

魔芋軟腐病的防治較為困難，通過合理密植和施肥、輪作、間套作等栽培措施，可在一定程度上降低發(fā)病率（古洪輝 等，2018）。在魔芋種植前使用70%甲基硫菌靈可濕性粉劑處理種芋，軟腐病發(fā)病初期使用20%噻菌銅懸浮劑等藥劑對軟腐病有明顯的防效（鐘剛瓊 等，2004；王紅巖等，2019），但長期使用化學(xué)藥劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且對環(huán)境和人畜的安全構(gòu)成潛在威脅。有研究表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）分別對馬鈴薯軟腐病和大白菜軟腐病致病菌P.atrosepticum和P.carotovorum具有良好的抑制效果（Sharga &Lyon，1998；Kosaka et al.，2016）。最新研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對生菜軟腐病致病菌P.carotovorum具有良好的拮抗效果（孫旺旺 等，2020）。

本試驗(yàn)從云南富源、楚雄和四川宜賓3 個(gè)主要魔芋種植區(qū)的軟腐病病樣中分離、純化得到3 株魔芋軟腐病菌菌株，并對其形態(tài)、生理生化、致病力和寄主范圍等特征進(jìn)行分析，明確了軟腐病致病菌的種類和生物學(xué)特性。同時(shí)，利用平板對峙法和盆栽試驗(yàn)開展了貝萊斯芽孢桿菌對魔芋軟腐病的防效分析，以期明確貝萊斯芽孢桿菌在防控魔芋軟腐病中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：2019 年從云南富源、楚雄及四川宜賓的魔芋種植區(qū)采集軟腐病病樣組織，分離、純化獲得魔芋軟腐病病原菌。對照菌株P(guān).aroidearumKC20（李曉穎 等，2018）、P.brasilienseBC1（Li et al.，2018）、P.odoriferumBCS7（Li et al.，2018）和P.versatileECC71（原P.carotovorumsubsp.carotovorum）（Portier et al.，2019）為北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心保存；7株貝萊斯芽孢桿菌（編號分別為BPC6、BPC16、W1-1、W2-3、W2-4、W2-7 和E2-4）分離自植物根際土壤，為北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心保存。

供試藥劑：3%中生菌素可濕性粉劑，購自福建凱立生物制品有限公司。

培養(yǎng)基：LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基的配制參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》（沈萍和陳向東，2007）；結(jié)晶紫果膠酸鹽（crystal violet pectate，CVP）選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨2 g·L-1、氯化鈣2 g·L-1、檸檬酸鈉10 g·L-1、硝酸鈉4 g·L-1、瓊脂粉8 g·L-1，1%結(jié)晶紫水溶液3 mL，5 mmol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，聚果膠酸鈉36 g·L-1，pH=7.0；金氏B（King’s B，KB）固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g·L-1、磷酸氫二鉀1.5 g·L-1、硫酸鎂1.5 g·L-1，甘油15 mL，瓊脂粉15 g·L-1，pH=7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離、純化與形態(tài)特征分析 采用常規(guī)平板劃線分離法，從魔芋軟腐病病樣組織分離細(xì)菌單菌落，通過顯微鏡下菌株形態(tài)觀察、革蘭氏染色和CVP 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，初步篩選魔芋軟腐病菌菌株。取各待測菌株單菌落分別接種于10 mL的LB 液體培養(yǎng)基，180 r·min-1、28 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，用滅菌水洗滌3 次，配制成OD600=0.2 的菌懸液（即2 × 108CFU·mL-1），回接到魔芋組織上。具體方法：用滅菌小刀在健康魔芋塊莖中心和盆栽植株的莖基部劃4 mm × 4 mm 的十字型傷口，深度為2 mm，分別取10 μL 菌懸液加入其中，置于28℃溫箱中培養(yǎng)24 h，然后從人工接種的魔芋發(fā)病組織處重新分離、純化病原菌，保存于-80 ℃冰箱備用。菌株在LB 培養(yǎng)基和CVP 選擇性培養(yǎng)基上的形態(tài)、掃描電鏡下菌株形態(tài)觀察、革蘭氏染色及鞭毛染色參考《植病研究方法》（方中達(dá)，1998）。

1.2.2 特異PCR 產(chǎn)物分析 將分離、純化后的魔芋軟腐病菌菌株于LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，使用Bacterial genomic DNA Kit〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取細(xì)菌基因組DNA，分別利用Pectobacterium果膠酸鹽裂解酶基因（pelY）特異性引物Y1/Y2（Darrasse et al.，1994）和16S～23S rDNA ITS 引 物G1/L1（Toth et al.，2001）對其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；分別采用限制性內(nèi)切酶RsaI 和HhaI 對G1/L1 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（Toth et al.，2001），取7 μL PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%、3%和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 菌株16S rDNA 和pmrA基因序列分析 分別用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F/1492R（Osborne et al.，2005）和pmrA基因引 物F0145/E2477（Kettani-Halabi et al.，2013）對供試菌株基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測序?；谒鶞y菌株序列及GenBank 中相關(guān)菌株基因序列，使用軟件MEGA6.0的鄰接法（neighbor-joining，NJ）分別構(gòu)建16S rDNA 和pmrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析。

1.2.4 全基因組平均核苷酸同源性（ANI）分析將分離、純化的3 株魔芋軟腐病菌菌株及對照菌株P(guān).aroidearumKC20 進(jìn)行全基因組測序，利用二代測序DNA 快速建庫試劑盒（Illumina 平臺(tái)），構(gòu)建插入片段長度為500 bp 的文庫，于Illumina HiSeq 測序平臺(tái)進(jìn)行雙末端150 bp（PE150）測序，測序深度至少100×。測序數(shù)據(jù)經(jīng)軟件Trimmomatic處理后（Bolger et al.，2014），應(yīng)用SPAdesV3.11.0進(jìn)行組裝（Bankevich et al.，2012）。利用MUMmer軟件進(jìn)行序列比對，獲得供試菌株間、供試菌株與P.aroidearumKC20 間以及供試菌株與NCBI 數(shù)據(jù)庫中Pectobacterium內(nèi)17 個(gè)種的菌株間的基因組平均核苷酸同源性（average nucleotide identity，ANI）值。

1.2.5 生理生化特性分析 將分離、純化的3 株魔芋軟腐病菌菌株接種于KB 培養(yǎng)基上，參考《植物病原細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》（Schaad et al.，2011）進(jìn)行生理生化特性分析。參照田宇等（2016）的方法，利用Biolog 全自動(dòng)微生物鑒定儀GEN Ⅲ OmniLog Plus（BiologTM）對菌株的種類進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

1.2.6 致病力及寄主范圍測定 將健康魔芋塊莖切開用75%酒精擦拭消毒后，置于下襯2 層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入7 mL 無菌水保持濕度，用滅菌小刀在其中心劃4 mm × 4 mm 的十字型傷口，接種10 μL 菌懸液（2 × 108CFU·mL-1），封口后在28 ℃下培養(yǎng)24 h，然后稱量魔芋塊莖腐爛組織質(zhì)量。將魔芋莖段切成8 cm 左右，在莖段中間接種10 μL 菌懸液（2 × 108CFU·mL-1），在28 ℃下培養(yǎng)12 h，然后觀察發(fā)病情況并記錄病斑長度。選取健康且長勢相近的魔芋盆栽植株，用滅菌注射器在魔芋莖基部下1 cm 位置注射1 mL 菌液，在28℃下培養(yǎng)24 h，然后觀察發(fā)病情況并記錄病斑長度。以無菌水為對照，每處理3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

人工接種12 種易受細(xì)菌侵染而引發(fā)軟腐病的植物，包括大白菜（Brassica rapa）、芹菜（Apium graveolens）、葉用萵苣（Lactuca sativa）、胡蘿卜（Daucus carota）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、辣 椒（Capsicum annuum）、西葫蘆（Cucurbita pepo）、鱷梨（Persea americana）等8 種 雙子葉植物和虎眼萬年青（Ornithogalum dubium）、大蒜（Allium sativum）、洋蔥（Allium cepa）、大蔥（Allium ampeloprasum）等4 種單子 葉植物（Ma et al.，2007；李曉穎 等，2018）。其中，大白菜、芹菜、葉用萵苣和虎眼萬年青采用活體植株接種方法（李曉穎 等，2018），辣椒、胡蘿卜、馬鈴薯、大蒜、洋蔥、大蔥、西葫蘆和鱷梨采用離體接種方法（王茜 等，2015）。

1.2.7 貝萊斯芽孢桿菌對魔芋軟腐病的平板對峙效果 將魔芋軟腐病致病菌菌株和貝萊斯芽孢桿菌分別置于LB 和NB 培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1分別振蕩培養(yǎng)18 h 和48 h，吸取100 μL 病原菌菌懸液（OD600=0.20）涂布于LB 培養(yǎng)基，然后在平板中心用直徑7 mm 的打孔器打孔，加入100 μL 貝萊斯芽孢桿菌菌懸液（OD600=5.00）。28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，測量抑菌帶大小。每處理3 個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.8 貝萊斯芽孢桿菌對魔芋軟腐病的盆栽防效將魔芋種球種于裝有草炭、營養(yǎng)土和蛭石（2V∶2V∶1V）的聚乙烯花盆中（直徑13 cm，高12 cm），分別采用貝萊斯芽孢桿菌菌懸液稀釋50 倍及3%中生菌素可濕性粉劑8 000 倍液，對發(fā)芽期魔芋進(jìn)行灌根處理，每株苗每次20 mL，每隔10 d 灌1 次，共3 次。展葉期用一次性醫(yī)用注射器刺傷魔芋植株莖基部1～2 次，刺傷但不穿透，之后向傷口處加入1 mL 病原菌菌懸液（2 × 108CFU·mL-1）。以清水為空白對照，每個(gè)處理20 盆，試驗(yàn)重復(fù)3 次。在溫度30～35 ℃、相對濕度85%～90%條件下培養(yǎng)2 d，然后測量病斑長度。分級標(biāo)準(zhǔn)參考孫旺旺等（2020）的方法并結(jié)合魔芋生長情況稍作修改：0 級，接種位點(diǎn)無侵染病癥；1 級，病斑開始形成，病斑長L≤0.5 cm；3 級，0.5 cm ＜L≤1.0 cm；5 級，1.0 cm ＜L≤3.0 cm；7 級，L＞3.0 cm；9 級，莖大部分腐爛或倒伏。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)級別）/（調(diào)查總株數(shù)×最大級數(shù)）× 100

防效=（空白對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對照病情指數(shù)× 100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與形態(tài)特征

從采集的魔芋軟腐病病樣組織（圖1-A）中分離軟腐病菌菌株，回接到魔芋塊莖上，24 h 后均發(fā)生腐爛（圖1-B），產(chǎn)生黏稠狀液體并伴有惡臭氣味；將菌株接種至魔芋盆栽植株莖基部，24 h 后接種部位發(fā)生腐爛且有惡臭氣味，產(chǎn)生半透明的水浸狀病斑并逐漸向兩端蔓延（圖1-C），與田間軟腐病發(fā)病癥狀表現(xiàn)一致。從人工接種的魔芋發(fā)病組織處重新分離、純化病原菌，獲得3 株致病菌菌株，分別命名為MY7、MY11 和MY18。這3 株菌株在LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h 后單菌落形態(tài)一致，均呈乳白色、半透明圓形、中央稍隆起、表面光滑且邊緣整齊（圖1-D），在CVP 選擇性培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h，均產(chǎn)生杯狀凹陷（圖1-E），掃描電鏡觀察其形態(tài)呈短桿狀，兩頭稍鈍圓（圖1-F），革蘭氏染色呈陰性（圖1-G），具有周生鞭毛（圖1-H）。

2.2 特異PCR 產(chǎn)物分析

利用Pectobacterium特異性引物Y1/Y2 的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，MY7、MY11 和MY18 與對照菌株P(guān).aroidearumKC20、P.brasilienseBC1、P.odoriferumBCS7 和P.versatileECC71 均能擴(kuò)增出預(yù)期片段大小約為434 bp 的PCR 產(chǎn)物（圖2-A）。16S～23S rDNA ITS 引物L(fēng)1/G1 擴(kuò)增結(jié)果顯示，MY7、MY11和MY18 與P.aroidearumKC20 擴(kuò)增片段大小一致，而與P.brasilienseBC1、P.odoriferumBCS7 和P.versatileECC71 不同（圖2-B）；將擴(kuò)增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶RsaI 和HhaI 酶切，結(jié)果顯示，MY7、MY11 和MY18 與P.aroidearumKC20 條帶大小相同，而與其他對照菌株均不同（圖2-C 和2-D）。

2.3 基于16S rDNA 和pmrA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

分別用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F/1492R和pmrA基因引物F0145/E2477 對供試菌株基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測序，獲得了MY7、MY11 和MY18 的16S rDNA 序列，GenBank 登錄號分別 為MT834964、MT834965 和MT 834966；獲得了3 株菌株的pmrA基因序列，GenBank 登錄號分別 為MT834967、MT834968 和MT834969。同源性比對結(jié)果顯示，MY7、MY11 和MY18 的16S rDNA 基因序列與已報(bào)道的P.aroidearumPC1（CP001657.1）同源性分別為98.09%、99.56%和99.86%，pmrA基因序列與P.aroidearumPC1 同源性分別為97.74%、98.50%和97.71%。基于16S rDNA 和pmrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，這3 株菌株與已發(fā)表的P.aroidearum菌株聚在一個(gè)分支群（圖3-A 和3-B）。

2.4 全基因組ANI 值分析

對菌株MY7、MY11、MY18 及 對照P.aroidearumKC20 進(jìn)行基 因組測 序，并登錄在GenBank：3 株菌株的登錄號分別為JACERJ000000000、JACERL000000000 和JACERM000 000000；P.aroidearumKC20 基因組序列的GenBank 登錄號為JACFXZ000000000。全基因組ANI 分析結(jié)果顯示，3 株菌株之間的ANI 值介于98.35%～98.46% 之 間，平均值 為98.39%；3 株菌株 與P.aroidearumKC20 菌株之間的ANI 值變化范圍為98.19%～98.27%，平均值為98.22%；3 株菌株與NCBI 中P.aroidearumPC1（NC_012 917.1）之間的ANI 值變化范圍為98.05%～98.08%，平均值為98.06%，均高于建議的Pectobacterium同 種ANI 閾 值（95%～96%）（Pritchard et al.，2015），而 與Pectobacterium其他16 個(gè)成員標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的ANI 值均低于該閾值（表1），因此進(jìn)一步確認(rèn)本試驗(yàn)分離、純化得到的MY7、MY11 和MY18 為P.aroidearum。這3 株菌株與P.brasiliense、P.polaris、P.carotovorum、P.aquaticum、P.versatile和P.odoriferum的平均ANI值范圍在90.15%～90.76%之間，顯示出較近的遺傳關(guān)系（表1）。

表1 MY7、MY11 和MY18 與17 個(gè)Pectobacterium 種菌株全基因組平均核苷酸同源性（ANI）值

2.5 生理生化特性分析

菌株MY7、MY11 和MY18 的生理生化特性表現(xiàn)一致：在5%和7% NaCl 及37 ℃條件下均能正常生長，均可液化明膠，在KB 培養(yǎng)基上均不能產(chǎn)生熒光色素，過氧化氫酶、硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，磷酸酶、氧化酶和蔗糖還原反應(yīng)呈陰性，與已報(bào)道的P.aroidearumKC20（李曉穎 等，2018）表現(xiàn)一致。Biolog 碳源利用結(jié)果表明，MY7、MY11和MY18 均能利用D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、β-甲基-D-半乳糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、α-D-葡萄糖、D-鼠李糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露醇、甘油、L-天門冬氨酸、D-葡萄糖二酸、丙酮酸甲酯和溴代丁二酸，均不能利用D-阿糖醇、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、奎寧酸、丙酸等作為唯一的碳源。這些特征均與參考菌株P(guān).aroidearumSCRI 109T（Nabhan et al.，2013）、P.aroidearumKC20 及P.aroidearumBYPT3 和WF-2（孫苗苗，2019）表現(xiàn)一致。MY7、MY11 和MY18 均不能利用D-麥芽糖、D-絲氨酸、α-酮戊二酸，不同于參考菌株P(guān).aroidearumSCRI 109T，但與已報(bào)道的P.aroidearumKC20、BYPT3 和WF-2 一致。此外，菌株MY11 不能利用L-鼠李糖、M-肌醇，菌株MY18 不能利用D-棉子糖、D-蜜二糖和L-鼠李糖，與參考菌株不同，顯示出菌株特異性利用特性（表2）。

2.6 致病力及寄主范圍測定

將魔芋軟腐病菌菌株MY7、MY11 和MY18分別接種在魔芋塊莖和離體、活體的魔芋莖稈上，從表3 可以看出，接種MY18 對魔芋塊莖和離體莖段致病力最強(qiáng)，塊莖腐爛質(zhì)量與病斑長度均顯著高于MY7 和MY11；MY18 和MY11 對活體植株莖致病力較強(qiáng)，病斑長度顯著高于MY7。

表2 MY7、MY11 和MY18 與報(bào)道的P.aroidearum SCRI 109T、KC20、BYPT3 和WF-2 Biolog 生化特性比較

表3 MY7、MY11 和MY18 致病力分析

將MY18 接種胡蘿卜、鱷梨、辣椒、馬鈴薯、西葫蘆、大蒜、洋蔥、大蔥、大白菜、芹菜、葉用萵苣和虎眼萬年青，24 h 后均產(chǎn)生明顯的軟腐癥狀（圖4），其中胡蘿卜、鱷梨、辣椒、馬鈴薯、洋蔥、大蔥均出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑并散發(fā)惡臭氣味，西葫蘆、大蒜出現(xiàn)淺黃色軟腐病斑，大白菜、芹菜、葉用萵苣、虎眼萬年青莖基部腐爛軟化，表明魔芋軟腐病菌菌株沒有寄主特異性，能侵染多種植物。

2.7 貝萊斯芽孢桿菌對魔芋軟腐病的防治效果

將7 株B.velezensis菌 株（BPC6、BPC16、W1-1、W2-3、W2-4、W2-7 和E2-4）與魔芋軟腐病菌菌株MY18 進(jìn)行平板對峙試驗(yàn)。結(jié)果顯示，7 株B.velezensis菌株對MY18 均有抑菌效果，其中B.velezensisBPC16、W2-7、W1-1 和E2-4 抑菌帶寬度大于BPC6、W2-3 和W2-4（表4）。選擇B.velezensisBPC16 和W2-7 菌懸液對盆栽魔芋植株進(jìn)行灌根處理。結(jié)果顯示，在莖稈上接種MY18 后，清水（CK）處理的魔芋植株發(fā)病率高達(dá)78.33%，病情指數(shù)達(dá)50.46；而經(jīng)B.velezensisBPC16 和W2-7 處理過的魔芋植株發(fā)病率（56.67%和63.33%）及病情指數(shù)（28.52 和34.45）均明顯降低，與藥劑對照3%中生菌素可濕性粉劑8 000倍液差異不顯著。B.velezensisBPC16 和W2-7 對魔芋軟腐病的防效分別為43.01%和31.99%，其中B.velezensisBPC16 的防效較中生菌素處理提高了9.26百分點(diǎn)（表5），但差異不顯著。

表4 貝萊斯芽孢桿菌對MY18 的拮抗效果

表5 貝萊斯芽孢桿菌BPC16 和W2-7 對魔芋軟腐病的盆栽防效

3 結(jié)論與討論

結(jié)合形態(tài)學(xué)、特異引物PCR、16S rDNA 和pmrA基因序列以及全基因組ANI 分析，本試驗(yàn)將2019 年從云南富源、楚雄和四川宜賓3 個(gè)主要魔芋種植區(qū)軟腐病樣中分離的軟腐病致病菌MY7、MY11 和MY18 鑒定為P.aroidearum。MY7、MY11 和MY18 形態(tài)特征符合Pectobacterium的描述（Schaad et al.，2011），包括在LB 固體培養(yǎng)基上為半透明圓形，表面光滑且邊緣整齊，能產(chǎn)生果膠酶特性，有鞭毛能運(yùn)動(dòng)，屬革蘭氏陰性桿菌。ITSRFLP 帶型分析可用于鑒定果膠桿菌種或亞種，是一種較為準(zhǔn)確且快速的分子鑒定方法（Toth et al.，2001）。本試驗(yàn)在Pectobacterium屬特異性引物Y1/Y2 均能擴(kuò)增出預(yù)期片段大小產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，利用ITS-RFLP 在MY7、MY11、MY18 及P.aroidearumKC20 中均獲得到條帶大小相同的產(chǎn)物，不同于菌 株P(guān).brasilienseBC1、P.odoriferumBCS7 和P.versatileECC71 擴(kuò)增結(jié)果。鑒于采用pmrA基因序列分析區(qū)分果膠桿菌種和亞種更加有效（Kettani-Halabi et al.，2013），在16S rDNA 序列分析基礎(chǔ)上，基于pmrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析也將MY7、MY11 和MY18 與其他P.aroidearum菌株聚在一個(gè)分支群。全基因組ANI 分析能夠快速便捷地比較出不同基因組之間的相似性，且ANI 值達(dá)到95%～96%以上定義為一個(gè)種（Pritchard et al.，2015）。為進(jìn)一步確認(rèn)3 株菌株的分類地位，本試驗(yàn) 將MY7、MY11、MY18 與P.aroidearumKC20及已報(bào)道的Pectobacterium17 個(gè)成員菌株的基因組序列進(jìn)行了ANI 分析，結(jié)果顯示MY7、MY11、MY18 與P.aroidearumK20 和P.aroidearumPC1 之間的ANI 平均值分別為98.22%和98.06%，而與其他Pectobacterium菌株的ANI 值均小于95%。因P.aroidearum標(biāo)準(zhǔn)菌株SCRI 109T尚未報(bào)道pmrA基因和全基因組序列，故未能與之進(jìn)行比較?；谂c其他P.aroidearum菌株的pmrA基因序列和全基因組ANI 值比較分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將MY7、MY11 和MY18 確定為P.aroidearum。

為明確MY7、MY11 和MY18 的生物學(xué)特性，幾個(gè)常規(guī)生理生化特性分析表明這3 株菌株都具備在5%和7% NaCl 及37 ℃條件下生長的能力，均可液化明膠，在KB 培養(yǎng)基上均不能產(chǎn)生熒光色素，過氧化氫酶反應(yīng)呈陽性，磷酸酶、氧化酶和蔗糖還原反應(yīng)表現(xiàn)為陰性，與已報(bào)道的P.aroidearumKC20 表現(xiàn)一致（李曉穎 等，2018）。MY7、MY11和MY18 均能利用D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、β-甲基-D-半乳糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、α-D-葡萄糖、D-鼠李糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露醇、甘油、L-天門冬氨酸、D-葡萄糖二酸、丙酮酸甲酯和溴代丁二酸，均不能利用D-阿糖醇、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、奎寧酸、丙酸等作為唯一的碳源，這些特征均與P.aroidearumSCRI 109T（Nabhan et al.，2013）、P.aroidearumKC20（李曉穎 等，2018）和P.aroidearumBYPT3及WF-2 表現(xiàn)一致（孫苗苗，2019）。MY7、MY11和MY18 均不能利用D-麥芽糖、D-絲氨酸、α-酮戊二酸的特性，不同于分離自南非的馬蹄蓮P.aroidearumSCRI 109T，但與已報(bào)道的P.aroidearumKC20、BYPT3 和WF-2 一致，可見分離自我國的P.aroidearum菌株表現(xiàn)出較高的一致性。此外，與P.aroidearum菌株不同，菌株MY11 不能利用L-鼠李糖、M-肌醇，菌株MY18 不能利用D-棉子糖、D-蜜二糖和L-鼠李糖，表現(xiàn)出菌株個(gè)體間的多樣性。

鑒于P.aroidearum在云南富源、楚雄和四川宜賓魔芋主要種植區(qū)，以及湖北宜昌（孫苗苗，2019），云南西雙版納和德宏（魏環(huán)宇 等，2020）等地引發(fā)軟腐病，對魔芋的生產(chǎn)帶來很大的威脅，本試驗(yàn)開展了貝萊斯芽孢桿菌生物防效分析。貝萊斯芽孢桿菌在植物病害，包括細(xì)菌性病害致病菌的生物防治方面顯示出良好的防治效果，如梨火疫病菌Erwinia amylovora和胡蘿卜果膠桿菌P.carotovorum（Liu et al.，2017）、生菜軟腐病菌P.carotovorum（孫旺旺 等，2020）等。但鮮見貝萊斯芽孢桿菌對魔芋軟腐病菌P.aroidearum的防治效果研究。本試驗(yàn)利用7 株貝萊斯芽孢桿菌（BPC6、BPC16、W1-1、W2-3、W2-4、W2-7 和E2-4）對峙P.aroidearumMY18 均有抑制效果；在盆栽防效試驗(yàn)中，B.velezensisBPC16 和W2-7 處理過的魔芋植株軟腐病發(fā)病率及病情指數(shù)均明顯降低，防效分別為43.01%和31.99%，顯示出B.velezensis在有效防治魔芋軟腐病方面的應(yīng)用潛力。