獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物通過內(nèi)源性線粒體通路誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞凋亡*

郝崗平， 郝佳麗， 李 悅， 趙法興， 張媛英， 蔣漢明， 楊中法

(1泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000； 2江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系， 江西 撫州 344000)

白血病約占腫瘤發(fā)病率的3%左右，其死亡率為(3.2～7.4)/10萬人口，在兒童及35歲以下的死亡率中占第1位[1]。目前治療白血病的主要手段仍然是聯(lián)合化療。而如伊馬替尼(imatinib)等靶向藥物治療慢性粒細(xì)胞白血病時(shí)抗藥性的產(chǎn)生明顯降低了治療效果, 因此尋找高效低毒的白血病治療藥物仍是主要研究目標(biāo)。

山慈菇為我國(guó)常用中藥材，有較強(qiáng)的化痰散結(jié)作用，大多以復(fù)方入藥用于肝癌、胃癌和白血病等抗腫瘤治療, 并取得了良好效果，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用，開發(fā)潛力巨大，其藥用基原植物為蘭科植物杜鵑蘭和獨(dú)蒜蘭[Pleionebulbocodioides(Franch.) Rolfe]的干燥假鱗莖[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從杜鵑蘭球莖分離出的主要化學(xué)成分為二苯乙烯類、菲類和聯(lián)芐類，其中一些化合物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌和胃癌等細(xì)胞表現(xiàn)出非選擇性中等強(qiáng)度細(xì)胞毒活性[2-4]。但目前對(duì)獨(dú)蒜蘭化學(xué)成分及活性研究不多，還沒有關(guān)于抗白血病細(xì)胞方面的報(bào)道。

本研究采用人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞和急性髓性白血病HL-60細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過體外實(shí)驗(yàn)研究獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯(ethyl acetate,EtOAc)提取物的抗白血病活性，為獨(dú)蒜蘭抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的研究提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

1.1藥材 獨(dú)蒜蘭購(gòu)自貴州雷山中藥材公司，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院江維克教授鑒定為山慈菇藥材來源之一獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖。

1.2細(xì)胞 人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞和急性髓性白血病HL-60細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.3試劑與儀器 IMDM培養(yǎng)基(HyClone)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(fetal bovine serum， FBS； Gibco)； DMSO(上海索寶生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；XTT 試劑(BI)；抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶[cleaved poly (ADP-ribose) polymerase,cleaved PARP)]、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2 抗體(CST)；抗細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)抗體(Santa Cruz)。FACSAria流式細(xì)胞儀(BD)。

2 主要方法

2.1獨(dú)蒜蘭提取物的制備 將350 g獨(dú)蒜蘭干燥假鱗莖粉碎，加入90%乙醇浸泡24 h，超聲波提取2 h。殘?jiān)?0%乙醇水重復(fù)1次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得乙醇浸膏。取乙醇浸膏加入適量水混懸，分別用石油醚(petroleumether,PE)、乙酸乙酯和水飽和正丁醇(n-butanol,n-Bu)進(jìn)行萃取，得石油醚萃取物2.7 g、乙酸乙酯萃取物3.5 g和正丁醇萃取物45.3 g。分別用DMSO溶解石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物為400 g/L溶液，使用時(shí)用IMDM培養(yǎng)基稀釋到所用濃度。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 用IMDM+10%胎牛血清+1×105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)條件，1～2 d 傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè)。

2.3XTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K562和HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×108/L。以每孔100 μL接種細(xì)胞，其中分別加入石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，使其終濃度為800、400、200、100、50和25 mg/L;另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基不加入K562和HL-60細(xì)胞作空白對(duì)照，陰性對(duì)照(0 mg/L)組為加入與最高濃度組等量DMSO的細(xì)胞組，下同，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。然后每孔加入XTT試劑50 μL，490 nm測(cè)定吸光度(A490)，按照公式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率：細(xì)胞活力抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%, 同時(shí)計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。選取最佳有機(jī)萃取物、藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4臺(tái)盼蘭拒染法活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 分別用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物處理2 mL密度為2.0×108/L的培養(yǎng)細(xì)胞。60 h后，制備細(xì)胞懸液，9份細(xì)胞懸液加1份0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻，將細(xì)胞懸液充入細(xì)胞計(jì)數(shù)板池，鏡下計(jì)數(shù)拒染的細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞數(shù))[5]。按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組活細(xì)胞數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L，培養(yǎng)2 mL細(xì)胞于6孔板，分別用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行處理。24 h后收集細(xì)胞。PBS清洗1～2遍，加入1 mL預(yù)冷的70%的乙醇，4 ℃過夜固定；離心棄去乙醇，PBS清洗1遍；加入500 μL 加有50 mg/L RNase A和50 mg/L PI染料的PBS，37 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60和K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L，培養(yǎng)2 mL細(xì)胞于6孔板，分別用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行處理，24 h后采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。取2 mL細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，分別加入100 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后，室溫避光反應(yīng)15 min，隨后加入400 μL Binding Buffer，1 h內(nèi)避光上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物處理2 mL細(xì)胞密度為2.0×108/L的培養(yǎng)細(xì)胞， 24 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min；用冷凍過夜的甲醇 ∶丙酮(含1‰ Triton X-100)=1∶1的固定液1 mL，固定 5 min；3 500 r/min離心5 min；DAPI 200 μL 染色 5～10 min，3 500 r/min 離心5 min；加500 μL PBS，3 500 r/min 離心5 min；加100 μL PBS懸浮細(xì)胞，取15 μL細(xì)胞用熒光顯微鏡在紫外燈下觀察細(xì)胞核形態(tài)并采集照片。

2.8Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L，培養(yǎng)2 mL細(xì)胞于6孔板，分別用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行處理，24 h后收集細(xì)胞。PBS洗2次，總蛋白的提取用加有PMSF和蛋白抑制劑的RIPA裂解液(Solarbio和R0010)裂解細(xì)胞，手指彈管壁，直到變透明, 12 000 r/min 離心10 min；轉(zhuǎn)移上清到新管，提取到細(xì)胞總蛋白。胞漿蛋白的提取采用碧云天試劑盒(P0028)，按照說明書進(jìn)行。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉。用1∶1 000稀釋的 I 抗(cleaved PARP、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3)和1∶150稀釋的 I 抗(Cyt C和AIF)，4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育1 h后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光。以GADPH為內(nèi)參照。曝光顯影的目的條帶進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參照為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)值，以此判斷蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 獨(dú)蒜蘭不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力的影響

首先分別用800、400、200、100和 0 mg/L的乙酸乙酯、石油醚和正丁醇萃取物處理K562細(xì)胞。XTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正丁醇萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力影響很小；石油醚萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力有一定影響(P<0.05或P<0.01)；乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)胞活力有顯著影響，100 mg/L的乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力的抑制率達(dá)到89.11%，200 mg/L的抑制率達(dá)到96.62%，400 mg/L以上的抑制率為100%，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。這說明乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力的抑制效果最好，所以以下實(shí)驗(yàn)分別用200、100、50和25 mg/L的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行處理。

Figure 1. The effects of extracts ofPleionebulbocodioidesby 3 solvents on the viability of K562 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖13種溶劑的獨(dú)蒜蘭萃取物對(duì)K562細(xì)胞活力的影響

2 獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562和HL-60細(xì)胞增殖的影響

分別用200、100、50、25和0 mg/L的乙酸乙酯萃取物處理K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞24 h和48 h。XTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比,隨著乙酸乙酯萃取物濃度逐漸增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的活力抑制率逐步上升(P<0.05)。其中，HL-60細(xì)胞對(duì)乙酸乙酯萃取物更加敏感，50 mg/L萃取物處理24 h的細(xì)胞活力抑制率達(dá)到58.66%，處理48 h的抑制率達(dá)到79.86%;50 mg/L萃取物處理K562細(xì)胞24 h的抑制率達(dá)到49.54%，處理48 h的抑制率達(dá)到69.66%。計(jì)算得到乙酸乙酯萃取物對(duì)于HL-60作用24 h 的IC50約為(42.14±2.54) mg/L，對(duì)于K562細(xì)胞的IC50為(51.28±3.12) mg/L;作用HL-60 細(xì)胞48 h的IC50約為29.56 mg/L，對(duì)K562細(xì)胞的IC50為35.87 mg/L，見圖2。以上結(jié)果說明乙酸乙酯萃取物對(duì)白血病細(xì)胞的活力有明顯的抑制作用,HL-60細(xì)胞對(duì)此藥物更敏感。

臺(tái)盼蘭拒染法活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562和HL-60細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞大小基本一致，胞圓，光亮，臺(tái)盼藍(lán)拒染，而經(jīng)50 mg/L處理K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞60 h后的活細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞大小不一，死細(xì)胞呈藍(lán)色；不同濃度(200、100、50和25 mg/L)的乙酸乙酯萃取物均顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。這一結(jié)果說明獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562和HL-60細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。

Figure 2. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson the viability of K562 cells and HL-60 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞活力的影響

Figure 3. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson the proliferation of K562 cells and HL-60 cells (Trypan blue exclusion test, ×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞增殖的影響

3 獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562和HL-60細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示,隨著乙酸乙酯萃取物濃度增加，細(xì)胞凋亡率也隨之增加，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物顯著誘導(dǎo)了HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞的凋亡，且HL-60細(xì)胞比K562細(xì)胞對(duì)乙酸乙酯萃取物更加敏感,見圖4、5。

Figure 4. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson the apoptosis of K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖4不同濃度乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson apoptosis of HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖5不同濃度乙酸乙酯萃取物對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響

DAPI 染色后，在熒光顯微鏡下，K562細(xì)胞和HL-60對(duì)照組細(xì)胞均界限清晰，細(xì)胞胞質(zhì)完整，胞漿豐富，飽滿，胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻分布，少見強(qiáng)熒光的胞核，很少發(fā)生凋亡,見圖6A、C；K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞被獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物處理24 h后，2種細(xì)胞均發(fā)生明顯的凋亡，細(xì)胞體積縮小，胞核縮小，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，染色質(zhì)皺縮，內(nèi)部形成很多顆粒物質(zhì)甚至發(fā)生核碎裂，外周聚集形成邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體，呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)，見圖6B、D。

4 獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度的獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物處理24 h后，G2期細(xì)胞明顯增加，G0期細(xì)胞明顯減少，與正常對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HL-60細(xì)胞與K562細(xì)胞相似，處理24 h后, G2期細(xì)胞明顯增加，G0期細(xì)胞明顯減少，與正常對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7、表1。上述數(shù)據(jù)表明獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物使HL-60和K562細(xì)胞被阻滯于G2期。

Figure 6. The effects of EtOAc extract ofPpleionebulbocodioideson apoptosis-induced morphological changes of K562 cells and HL-60 cells (DAPI staining, ×400). A: K562 cells; B: K562 cells treated with EtOAc extract at 50 mg/L; C: HL-60 cells; D: HL-60 cells treated with EtOAc extract at 50 mg/L. The arrows showed apoptosis of nucleus.

圖6獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞凋亡核形態(tài)的影響

5 獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)內(nèi)源性線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

隨著藥物處理濃度的升高，cleaved PARP、cleaved caspase-3和Bax蛋白水平上升，而Bcl-2蛋白水平下降，與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。這表明乙酸乙酯萃取物可以上調(diào)cleaved PARP、cleaved caspase-3和促凋亡蛋白Bax的水平，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

許多藥物誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡中，Cyt C和AIF可從線粒體被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。我們的結(jié)果也顯示細(xì)胞質(zhì)中Cyt C和AIF在對(duì)照組細(xì)胞中檢不出，分別用25、50、100和200 mg/L的乙酸乙酯萃取物處理K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞24 h后，兩者的含量逐漸升高，與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。這說明獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物觸發(fā)了白血病細(xì)胞的內(nèi)源性線粒體凋亡通路。

討 論

近年來隨著新藥的出現(xiàn)和治療方法的改進(jìn)，白血病的完全緩解率有了明顯提高，但其多藥耐藥性以及較高的復(fù)發(fā)率仍是目前治愈白血病的主要障礙[6]。中藥提取物有可能作為治療白血病的有效資源。我們選取山慈菇基原植物之一的獨(dú)蒜蘭鱗莖萃取物進(jìn)行研究，期望獲得有效低毒的抗白血病藥物分子。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，獨(dú)蒜蘭的各個(gè)萃取部位中，正丁醇萃取物即使是800 mg/L的高濃度也對(duì)慢粒白血病K562細(xì)胞活力無明顯抑制作用；石油醚層萃取物400 mg/L時(shí)抑制率達(dá)到81.24%，有一定抑制作用；而乙酸乙酯萃取物對(duì)這2種細(xì)胞均有很好的抑制作用，100 mg/L時(shí)抑制率達(dá)到80.24%。這些結(jié)果說明抑制白血病細(xì)胞活力的活性成分主要集中在獨(dú)蒜蘭的乙酸乙酯萃取層中。

Figure 7. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson the cell cycle distribution of K562 cells and HL-60 cells.

圖7獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞周期的影響

表1獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物阻滯K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞周期于G2期

Table 1. EtOAc extract ofPleionebulbocodioidesinduced the cell cycle arrest at G2phage in the K562 cells and HL-60 cells (Mean±SD.n=3)

EtOAcextract(mg/L)K562cells(%)HL-60cells(%)G1G2G1G2056.6±2.5617.4±1.7861.1±2.3920.2±1.242551.2±4.0125.3±2.7553.7±5.7822.4±2.895039.7±5.12*29.2±3.47*44.5±4.48*24.0±3.1810029.6±3.23**36.4±2.84**44.0±5.16*31.7±2.09*

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

Figure 8. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson the protein levels of cleaved PARP, cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖8獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)cleavedPARP、cleavedcaspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

進(jìn)一步降低乙酸乙酯萃取層的作用濃度，XTT結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物能夠有效抑制K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞活力，作用呈劑量和時(shí)間依賴，對(duì)于HL-60細(xì)胞作用24 h 的IC50約為42.14 mg/L，對(duì)于K562細(xì)胞的IC50為51.28 mg/L，也說明乙酸乙酯層中含有有效的抗白血病細(xì)胞活性成分，且抑制效果很好。臺(tái)盼藍(lán)拒染活細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果也顯示獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞具有明顯的增殖抑制性。Wang等[4]報(bào)道山慈菇的另一個(gè)基原植物杜鵑蘭的二苯乙烯類化合物對(duì)肺癌細(xì)胞A549有很好的抑制增殖效果，所以推測(cè)獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物中抑制K562細(xì)胞和HL-60 增殖的化合物應(yīng)該也是二苯乙烯類化合物。

抑制細(xì)胞增殖可能通過改變白血病細(xì)胞生長(zhǎng)周期來實(shí)現(xiàn)。我們的結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物在G2期阻滯K562和HL-60細(xì)胞周期。G2是蛋白質(zhì)合成期，為進(jìn)入分裂M期做準(zhǔn)備，是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)。近年來研究表明阻滯于G2-M 期比阻值于G1期的還多見，提示其在腫瘤發(fā)生和治療等方面可能有重要意義。G2-M 期阻滯可能與DNA修復(fù)有關(guān)，在染色體分離前將損傷DNA修復(fù)，修復(fù)不好的DNA則退出增殖周期，進(jìn)入凋亡途徑。這樣通過縮短化療藥物導(dǎo)致的白血病細(xì)胞的G2-M阻滯，誘導(dǎo)其進(jìn)入凋亡途徑, 將對(duì)提高白血病的治療具有重要意義[7-9]。

Figure 9. The effects of EtOAc extract ofPleionebulbocodioideson protein expression of AIF and CytC in cytosol. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖9獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)胞質(zhì)AIF和CytC蛋白表達(dá)的影響

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅因細(xì)胞過度增殖，也與細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取物可誘導(dǎo)這2種細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且50 mg/L的乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡率為33.1%，而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡率為63.1%，也說明HL-60細(xì)胞對(duì)乙酸乙酯萃取物更加敏感，與XTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)，DAPI熒光染色法觀察細(xì)胞核熒光發(fā)現(xiàn)經(jīng)50 mg/L乙酸乙酯萃取物處理的K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞24 h后出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，碎裂，質(zhì)凝聚，邊緣化，核膜裂解，凋亡小體出現(xiàn)。

凋亡的發(fā)生主要通過內(nèi)源性線粒體途徑或外源性膜受體途徑這2條途徑發(fā)生，從而發(fā)生細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜泡化、染色質(zhì)濃縮、核仁碎裂及凋亡小體形成等一系列變化[10]。內(nèi)源性線粒體途徑的激活是Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)的許多抗腫瘤藥物的關(guān)鍵作用機(jī)制之一[11]。Bcl-2是公認(rèn)的的抗凋亡蛋白，其主要作用機(jī)制是調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的通透性，直接對(duì)抗促凋亡分子作用，它能阻斷多種細(xì)胞凋亡途徑的共同通道[12-13]。Bcl-2的高表達(dá)可能與急性白血病密切相關(guān)[14]。Bax則是最主要的促凋亡蛋白，與Bcl-2作用相反，Bax可增大細(xì)胞膜的通透性，轉(zhuǎn)移至線粒體膜上迅速形成的同源二聚體增多加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Bax/Bcl-2的比值調(diào)節(jié)Cyt C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活細(xì)胞質(zhì)caspases級(jí)聯(lián)系統(tǒng)引起的細(xì)胞凋亡[15-16]。內(nèi)源性線粒體途徑的主要起始因子是Cyt C和caspase-9，Cyt C自線粒體的釋放標(biāo)志著內(nèi)源性線粒體凋亡通路的激活。Cyt C激活caspase-9后，進(jìn)一步激活級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白caspase-3[17]。半胱天冬酶caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中的重要關(guān)鍵因子，也是凋亡過程的主要關(guān)鍵酶和執(zhí)行者[18]。PARP是caspase-3的最主要底物。在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，PARP前體(116 kD)被caspase-3剪切成85和31 kD 2個(gè)片段，使得PARP羧基端的催化區(qū)域與氨基端的2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域相分離，這樣PARP就不能發(fā)揮正常功能。導(dǎo)致受PARP負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡[19]。

本研究顯示，獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞凋亡的過程中，Bax、cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平隨著藥物濃度的增加，表達(dá)量協(xié)同升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。內(nèi)源性線粒體途徑特征蛋白Cyt C和AIF在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)也隨藥物濃度逐漸增高。這些結(jié)果說明獨(dú)蒜蘭乙酸乙酯萃取物誘導(dǎo)K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞凋亡可能通過內(nèi)源性線粒體途徑。Bcl-2表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了白血病細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，激活Bax轉(zhuǎn)移至線粒體膜上迅速形成的同源二聚體增多，加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程；同時(shí)作用于caspase的上游，促進(jìn)線粒體釋放Cyt C，釋放到胞漿中Cyt C與凋亡蛋白Apaf-1結(jié)合形成凋亡體，進(jìn)而激活caspase-3及其最主要的底物PARP，使核酸內(nèi)切酶的活性增高而促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。

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