潰瘍性結腸炎患者腸道菌群的變化及其與IL-23/IL-17軸的關系*

馬旭園， 代志峰， 王慧超， 楊靜楠， 唐向陽， 康玉華， 丁春生， 李玉霞， 楊瑞林， 林旭紅△

(河南大學 1淮河醫(yī)院消化內科， 2淮河醫(yī)院檢驗科， 轉化醫(yī)學中心， 3第一附屬醫(yī)院腎內科， 河南 開封 475000)

潰瘍性結腸炎(ulcerate colitis，UC)的病因及發(fā)病機制至今仍未完全闡明，目前普遍認為主要由環(huán)境因素、遺傳易感因素、腸道屏障功能障礙和免疫功能異常等多種因素相互作用所致，其中，慢性炎癥反應和免疫應答紊亂是造成UC的關鍵病理環(huán)節(jié)，而腸道內菌群紊亂又是造成炎癥反應和免疫應答改變的重要因素，成為影響UC病變的重要因素。

生理情況下，腸道菌群保持相對穩(wěn)態(tài)，與宿主相互作用，在吸收營養(yǎng)、抵抗病原體入侵及促進維持正常免疫功能中發(fā)揮重要作用。細菌在宿主早期免疫-炎癥反應系統(tǒng)成熟中發(fā)揮重要作用，與宿主建立有效的“交互對話”，因此細菌是早期最主要的導致慢性炎性紊亂如UC的環(huán)境因素。近年來，越來越多的研究認識到，腸道菌群失調與UC的發(fā)生密切相關[1-2]，總體來講，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)患者腸道菌群特征性組成變化包括黏膜總菌變化，多樣性降低，伴隨疾病進展早期菌群組成改變[3]，如具有爭議的侵襲性細菌(變形菌、梭桿菌和活潑瘤胃球菌)種類的增加，伴隨保護性菌(毛螺旋菌、雙歧桿菌、羅斯氏菌和薩特氏菌屬)數量下降[4]。且多數研究者都支持活動期UC患者與健康對照者的腸道菌群存在差異，而緩解期UC患者與健康者的腸道菌群無差異這一觀點。因此，腸道菌群是控制UC進一步發(fā)展的一個靶點。

目前，關于UC患者腸道菌群的研究因選擇的疾病病程不同、分期不同、治療與否而分析方法各異，再加上腸道菌群具有的復雜性，其完整的結構與功能未能被完全了解，導致關于UC患者腸道需氧菌和常見厭氧菌的變化尚無統(tǒng)一認識，其在宿主疾病發(fā)生中所起到的具體作用也尚未能完全闡明，且這些菌群的變化與患者腸黏膜病理改變的關系還不明確。目前國內外相關文獻報道主要側重于某一類腸道菌群與UC的關系，并沒有全面進行腸道內常見菌群與UC相關性對比，因此，腸道菌群與UC的相關性研究仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

本研究在前期工作的基礎上，采用涂片鏡檢、細菌培養(yǎng)、real-time PCR和免疫組化等方法分別對活動期UC患者及正常健康人群糞便菌群進行差異分析，并將白細胞介素23 (interleukin-23，IL-23)/IL-17與組織病理學和目標菌群進行相關性分析，旨在研究UC進展過程中腸道主要菌群變化及其與IL-23/IL-17的關系，以期尋找UC相關的特異微生物種類或持續(xù)變化模式，對精確診斷提供指導意義，為臨床應用抗生素及益生菌治療 UC 提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 UC患者收集及臨床信息采集

根據2012年中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病學組制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》修訂的標準，收集我院2016年8月～2017年6月UC患者(同時行腸鏡檢查及病理活檢，病歷資料完整)20例進行研究，其中，男13例，女7例，均為活動性復發(fā)UC患者(曾接受氨基水楊酸類藥物治療)，留取標本前4周內均未應用抗生素和微生態(tài)制劑等可能影響腸道菌群的藥物。核心臨床標準：入圍患者入院后行血液學檢測及結腸鏡檢查。排除標準為臨床資料不完整；伴有嚴重心、肝、肺、腎疾病患者；合并嚴重感染、糖尿病患者；合并UC并發(fā)癥患者；妊娠及哺乳期患者；合并腸外表現的患者；患有其他自身免疫性疾病患者。有以上任意一條均不納入本研究。同時收集20例本院體檢中心體檢健康者作為對照，男15例，女5例，無消化道慢性疾病史，常規(guī)體檢和糞常規(guī)檢查均未見異常。

2 實驗方法

2.1直接涂片鏡檢和菌群分析 取新鮮糞便標本，2 h內直接常規(guī)涂片(面積約1.5 cm±2.0 cm，厚度如血膜的菌膜)，干燥固定后革蘭染色，油鏡下觀察10個視野，根據每個油鏡視野細菌總數和各類細菌比例，判斷是否存在菌群失調及菌群失調程度，判斷和分級標準參照《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[5]。

2.2細菌培養(yǎng)鑒定 用10 μL接種環(huán)挑取新鮮糞便標本，采用4區(qū)劃線法進行接種。(1)需氧培養(yǎng)：接種血平板和中國藍平板，在5% CO2、37 ℃有氧環(huán)境中孵育24 h，使用全自動細菌鑒定儀對平板上生長的優(yōu)勢菌進行菌種鑒定；(2)厭氧培養(yǎng)：接種厭氧血平板，在37 ℃無氧環(huán)境中(厭氧氣體發(fā)生袋，日本三菱 MGC AnaeroPack-3.5L)孵育48 h，挑取優(yōu)勢菌做耐氧實驗，專性厭氧菌用API20A厭氧菌鑒定卡鑒定；(3)選擇性培養(yǎng)基：同時接種大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、腸球菌(Enterococcus)、擬桿菌(Bacteroidetes)、乳酸桿菌(Lactobacilli)和雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum,B.bifidum)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3細菌real-time PCR熒光定量分析 將涂片及培

養(yǎng)剩余的糞便標本置于-80 ℃保存，采用糞便DNA組提取試劑盒(TIANGEN，DP328-02)抽提糞便總DNA，具體方法按試劑盒說明書操作。提取的DNA測定濃度后保存于-20 ℃。應用Real-Time PCR試劑盒(TaKaRa，RR820A)，將糞便DNA進行擴增，擴增的細菌包括大腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌，每個標本做復孔檢測。引物設計用Primer Premier 5.0軟件。各細菌引物具體見表1。

表1 Real-time PCR所用特異性引物

F: forward; R: reverse.

2.4血紅蛋白(hemoglobin)、白蛋白(albumin)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)的測定 取患者空腹血標本，常規(guī)測定血紅蛋白、白蛋白、血沉和C反應蛋白水平。

2.5疾病臨床Mayo評分、Baron分級及結腸組織病理學分析 記錄患者一般情況、體重、大便量和性狀及精神狀態(tài)等，經結腸鏡活檢取UC患者和健康體檢者腸黏膜組織。按照Mayo評分方法[6]，對疾病活動度評分，具體評分標準見表2，其中，總分<2分為癥狀緩解，3～5分為輕度活動期，6～10分為中度活動期，11～12分為重度活動期。內鏡下活動度分級參照改良的Baron分級[7]，見表3。腸黏膜組織常規(guī)石蠟切片進行HE染色，光鏡下觀察腸黏膜組織潰瘍形成、炎細胞浸潤、充血和水腫等情況，并參照Siegmund等[8]評分方法進行組織病理學評分，見表4。每個組織標本選5張切片，每個切片隨機選擇4個視野。

表2 Mayo評分系統(tǒng)

表3 Baron分級評分標準

表4 組織學評分標準

2.6免疫組織化學法檢測結腸組織中IL-17和IL-23的表達 切片脫蠟至水化，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，微波修復抗原后，分別與IL-17和IL-23的 I 抗(Abcam，ab79056，ab45420)4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗及辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB(博士德，AR1022)顯色，棕褐色反應產物代表抗原定位。各蛋白表達的半定量用Image-Pro Plus軟件分析。

2.7Western blot法檢測結腸組織中IL-17和IL-23的表達 制備結腸組織樣品，用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，P0011-2)測定蛋白質濃度；配制合適濃度的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE，恒流150 mA轉膜55 min，5%牛奶(TBST配制)室溫封閉1.5 h，加 I 抗(Abcam，ab79056，ab45420)雜交，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜，加入酶標 II 抗(Thermo，31460)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液(康為世紀，CW0049M)曝片，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并根據Marker位置及蛋白分子量比對結果。內參照用β-actin。使用軟件ImageJ分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量用目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5軟件對資料進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用t檢驗;計數資料采用2檢驗;腸黏膜組織IL-17和IL-23表達的平均吸光度與Baron分級相關性采用Spearman相關分析，平均吸光度與病理組織學評分相關性采用Pearson相關分析，平均吸光度與腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光定量的相關性分析采用Pearson相關分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 直接涂片鏡檢和菌群分析

如圖1A所示，與對照組相比，活動期UC患者球菌數量明顯增多，桿菌數量明顯減少，且菌群失調程度明顯升高；II度和III度失調的比例分別從對照組的10%和0%，升高至UC組的30%和25%，2組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1. Results of direct smear and flora analysis for stool. A: the original image of the fecal smears (×1 000)； B: comparison of flora analysis.

圖1糞便直接涂片鏡檢和菌群分析結果

2 細菌培養(yǎng)鑒定

需氧培養(yǎng)結果表明，活動期UC患者的需氧菌總數和單菌量均有明顯改變，其中大腸桿菌菌數較正常人顯著降低，腸球菌菌數明顯增加(P<0.01)，見圖2A；厭氧培養(yǎng)鑒定結果發(fā)現，厭氧菌總數減少，其中擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌數較正常人顯著減少(P<0.01)，見圖2B。以上結果經選擇性培養(yǎng)基進行確認，發(fā)現大腸桿菌在選擇性顯色培養(yǎng)基呈圓形、微凸、光滑、邊緣整齊，呈綠色光澤，UC患者的數量明顯降低；在PFIZER選擇性腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上孵育48 h后，腸球菌形成圓形、扁平、表面凹陷、邊緣整齊的灰色菌落；擬桿菌在BDS培養(yǎng)基上孵育后，形成圓形、微凸、光滑、邊緣整齊、半透明、灰白色，不溶血的菌落；雙歧桿菌在專用瓊脂培養(yǎng)基孵育后，形成圓形、光滑、邊緣整齊、不透明、大部分顯白色的大小兩種菌落；乳酸桿菌在選擇性培養(yǎng)基孵育后，形成圓形、光滑、邊緣整齊，半透明、灰白色的菌落。UC患者的腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌數量明顯降低。

Figure 2. The analytic results of fecal bacterial cultures. A: selective cultures and the change rates ofEscherichiacoliandEnterococcus; B: selective cultures and the change rates ofBacteroidetes,BifidobacteriumbifidumandLactobacilli. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖2糞便細菌培養(yǎng)結果分析

3 細菌real-time PCR熒光定量分析

目標菌屬定量分析表明，UC患者糞便中大腸桿菌相對定量較正常人顯著降低，腸球菌菌數明顯升高，擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌數較正常人顯著減少(P<0.01)，見圖3。

4 血紅蛋白、白蛋白、血沉和C反應蛋白水平

UC患者血紅蛋白較對照組無明顯改變，白蛋白較正常人明顯降低(P<0.05)，血沉和C反應蛋白明顯增高(P<0.01)，見表5。

Figure 3. Quantitative analysis of fecal bacteria by real-time PCR. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖3細菌real-timePCR熒光定量分析

5 疾病臨床活動度及組織病理積分

與正常組相比，UC患者Mayo評分明顯增高(P<0.01)，Baron分級明顯增加(P<0.01)，見圖4A、B。HE染色結果表明，正常組結腸黏膜上皮細胞完整，腺體排列整齊緊密，富含杯狀細胞，固有層僅見少量散在的中性粒細胞及淋巴細胞，毛細血管無充血、擴張；UC組結腸黏膜糜爛，腸黏膜受損，上皮細胞大量破壞，腺體破壞，排列紊亂，陷窩結構破壞，杯狀細胞大量消失，固有層、肌層均可見大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，毛細血管充血、擴張，隱窩膿腫形成，并見多發(fā)潰瘍，甚者表面有膿苔，組織學評分明顯高于正常組(P<0.01)，見圖4C。

表5 各組常規(guī)指標的比較

ESR: erythrocyte sedimentation rate;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Figure 4. Mayo scoring (A), Baron grading (B) and HE staining (C) results. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖4Mayo評分、Baron分級及組織病理學結果

6 結腸組織中IL-17和IL-23的表達

免疫組化結果顯示，正常結腸黏膜組織IL-17和IL-23表達微弱，而病變結腸組織表達豐富的IL-17和IL-23，陽性表達主要位于黏膜上皮細胞和固有層單個核細胞，為胞漿染色，顆粒呈棕黃色，且固有層內可見強陽性棕褐色顆粒聚集，平均吸光度均明顯升高(P<0.01)，見圖5。Western Blot結果表明，IL-17和IL-23蛋白表達水平較對照組均有明顯升高(P<0.01)，見圖6。

7 IL-17和IL-23表達與Baron分級及病理組織學積分的相關性

如表6所示，將IL-7和IL-23平均吸光度與Baron分級進行Spearman相關分析，結果顯示，UC患者結腸黏膜組織中IL-17和IL-23表達的平均吸光度與Baron分級的相關系數分別為0.717(P=0.02)和0.849(P=0.016)，表明二者與內鏡下活動度分級呈正相關。另外，Pearson相關分析表明，UC患者結腸黏膜組織中IL-17和IL-23表達的平均吸光度與病理組織學評分的相關系數分別為0.660(P=0.030)和0.675(P=0.032)，提示二者與病理組織學評分亦呈正相關。

Figure 5. The protein levels of IL-17 and IL-23 in the colon detected by immunohistochemical staining(×400). Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖5免疫組化檢測結腸組織IL-17和IL-23蛋白的表達水平及定位

8 IL-17和IL-23表達與大腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌熒光定量的相關性分析

Pearson相關分析表明，IL-23表達的平均吸光度與大腸桿菌數量呈負相關(r=-0.699，P=0.025)，與腸球菌數量呈正相關(r=0.872，P=0.010)，IL-17表達的平均吸光度與腸球菌數量呈正相關(r=0.764，P=0.046)，但二者與其他目標菌屬的數量無明顯相關性，見表7。

討 論

體內的腸道菌群構成了一個極其復雜的腸道內微生態(tài)系統(tǒng)，在宿主的腸道免疫系統(tǒng)、營養(yǎng)物質的合成與吸收、抑制致病菌等眾多方面均發(fā)揮著重要作用[9-10]。

有研究認為，腸黏膜屏障功能障礙可能是UC發(fā)病的觸發(fā)扳機[11]，腸道菌群紊亂與異常免疫反應介導之間的相互作用可能是導致腸粘膜功能障礙，參與 UC 發(fā)病的始動因素[12]。將一些基因敲除或基因缺陷小鼠置于無菌環(huán)境中不會發(fā)生UC，置于正常腸道菌群中或予某些腸道菌群(如腸球菌)灌腸后可誘發(fā)UC[13]，證明了“無菌無炎癥”的觀點，提示腸道菌群成分是腸炎發(fā)病不可或缺的因素之一?，F已發(fā)現，多種細菌和病毒等病原體參與炎癥性腸病發(fā)病。Gradel 等[14]發(fā)現感染彎曲桿菌或沙門氏菌的患者易患IBD；Li等[1]觀察了16例健康人和41例UC患者糞菌，發(fā)現正常人糞便微生物多樣性明顯高于UC患者，與正常人、靜止期和輕度活動期相比，中、重度活動期患者糞菌中的主要類型明顯改變，且主要細菌的比例與疾病活動呈負相關，UC患者產氣莢膜梭菌數量增加，屎腸桿菌、直腸桿菌數量減少；Rajili-Stojanovi等[15]應用高重復率系統(tǒng)發(fā)育微陣列技術檢測15例UC患者和15例健康對照者糞菌，認為UC患者糞菌組成明顯不同于健康對照，UC緩解期相關微生物相對穩(wěn)定，且在所有患者相似，在活動期，菌群失調的主要標志物有：梭菌屬IV簇細菌多樣性明顯降低，參與丁酸和丙酸代謝的細菌包括瘤胃球菌屬、直腸真桿菌、羅氏菌屬、阿克曼氏菌豐度降低，而條件致病菌梭菌屬、消化鏈球菌屬、螺桿菌、彎曲桿菌、艱難梭菌豐度升高。另有研究發(fā)現，幽門螺桿菌感染與IBD發(fā)病呈負相關，幽門螺桿菌通過多種機制使宿主受益，從而起到保護宿主免受IBD襲擊[16]。因此，基于不同的分析方法，對于活動期UC患者腸道菌群組成，歷來的研究結果千差萬別。

Figure 6. The protein levels of IL-17 and IL-23 in the colon detected by Western blot. Mean±SEM.n=20.**P<0.01vscontrol group.

圖6Westernblot檢測結腸組織IL-17和IL-23蛋白的表達水平

表6IL-17和IL-23表達與Baron分級及組織病理學評分的相關性

Table 6. Correlations between IL-17/IL-23 expression and Baron grade as well as histopathological score

ProteinBarongradeHistopathologicalscorerPrPIL-170.7170.020.6600.030IL-230.8490.0160.6750.032

表7 IL-17和IL-23表達與目標菌群的相關性

腸道菌群分析可反映腸道細菌的狀態(tài)，因此我們首先對各組標本進行糞便涂片、需氧及厭氧培養(yǎng)，發(fā)現2類菌均有不同程度的改變，其中，需氧菌總數增加，以大腸桿菌降低和腸球菌升高變化最為明顯；厭氧菌總數減少，主要表現為擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌減少，這與國內外文獻報道部分相似，從而大體水平上揭示UC患者腸道細菌的變化。為了驗證以上結果，我們用以上需氧及厭氧菌的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)現與鑒定結果一致。同時，為全面反映腸道狀態(tài)，本研究選取消化道內幾種目標菌屬，對UC患者目標菌屬進行定量研究，結果顯示，大腸桿菌、擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌在UC組糞便標本中較正常組含量有所減少，而腸球菌在UC組糞便標本中較正常組含量有所增高。這些結果與活菌培養(yǎng)的結果一致。正常情況下，雙歧桿菌和乳酸桿菌可與腸黏膜細胞密切結合，在腸黏膜表面形成生物學屏障，阻止致病菌、條件致病菌的定植和入侵，因此二者的減少將明顯削弱腸黏膜對各種致病因素的防御作用。另外，由于腸球菌釋放外毒素，勢必加重UC患者已存在的腸道局部炎癥反應和免疫紊亂。但是這些細菌在UC中的具體作用機制還有待進一步研究。

雖然腸黏膜固有層免疫細胞平衡著腸道微生物的免疫耐受和對腸道微生物致病菌的防御作用，但UC仍然被認為可能是腸黏膜免疫細胞對腸道菌群抗原的過度應答導致腸道屏障功能受損過度的炎癥反應狀態(tài)[17-18]。新近研究表明，以分泌IL-17為特征的CD4+T細胞是一種新的輔助性T細胞亞群，被認為具有介導炎性反應、自身免疫性疾病等重要免疫調節(jié)作用[19]。我們發(fā)現IL-23/IL-17的表達在正常的結腸上皮細胞較低，而在UC患者結腸上皮細胞的表達明顯升高，通過相關性分析，發(fā)現IL-23與IL-17平均吸光度與Baron分級和組織病理學評分均呈正相關，表明二者在UC的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，但二者表達水平與UC患者腸道菌群的關系尚不明確。通過將IL-23/IL-17的平均吸光度與常見菌熒光定量進行相關性分析，發(fā)現IL-23平均吸光度與大腸桿菌數量呈負相關，IL-23/IL-17與腸球菌數量呈正相關，而二者表達水平與擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌數量無關，提示IL-23/IL-17作為UC發(fā)生發(fā)展的關鍵因子，其與腸道菌群含量的變化可能存在一定關聯，因其相互之間的影響最終在UC的發(fā)生中起到重要作用。關于IL-23/IL-17與腸道細菌的因果關系在UC中的作用，已有研究認為,腸道內致病菌產物與各自的Toll樣受體結合，誘導抗原遞呈細胞分泌IL-23，IL-23再與相應受體結合，誘導IL-17表達，促發(fā)炎癥級聯放大，最終介導腸道炎癥發(fā)生和腸黏膜損傷[20]。多種動物模型研究表明，IBD的病理是宿主對正常細菌的異常免疫反應和宿主對異常細菌的正常反應的交叉[21]，但菌群失調到底是IBD的原因，還是IBD的結果，目前并不明確[4]。

本研究也存在局限性，如培養(yǎng)只能檢測腸道中的活菌，而不能代表死菌，由于腸道菌群種類較多，不能完全反映所有菌群，且分析過程中只能涉及那些能在現有條件較易培養(yǎng)出來的細菌，而能培養(yǎng)的細菌由于種類太多，也只能選擇有代表性的數種。

綜上所述，活動期UC患者存在明顯的菌群失調，改變的細菌與患者炎癥程度密切相關，IL-23/IL-17作為UC發(fā)生發(fā)展的關鍵因子，與腸道菌群含量的變化可能存在一定關聯，其相互作用在UC的發(fā)生中起到重要作用。

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