可樂定對慢性腦缺血大鼠學習記憶及ERK信號通路相關(guān)蛋白的影響*

王奎鵬， 余海濱

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州 450000)

腦缺血(ischemia)是因腦內(nèi)血氧供應不足而導致的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在發(fā)展中國家已經(jīng)成為繼心臟病和腫瘤的第3大致死病因[1]。有數(shù)據(jù)表明，腦缺血引起的致殘率高達20%～30%，在幸存的患者中，1/3的患者在1周之內(nèi)有所改善，40%患者確沒有任何改善，20%病患病情在第1周的時候甚至會加劇[2]，這提示腦缺血具有高治殘率及致死率。腦缺血超過1 h，即可出現(xiàn)不可逆性腦損傷，表現(xiàn)為不同程度的感覺、運動及認知功能障礙，該疾病一旦發(fā)生將會給家庭和社會帶來沉重的負擔。鑒于我國老齡化社會的到來，尋找有效的治療腦缺血的藥物以及治療途徑已刻不容緩。在尋找治療腦缺血的藥物中，α2腎上腺素受體激動劑進入人們的視野。有研究表明可樂定(clonidine)能顯著提高正常和高血糖全腦缺血的大鼠模型中神經(jīng)細胞的存活率以及谷氨酸的釋放[3]。但是對腦缺血的認知功能后遺癥是否具有改善作用仍然不清楚。此外，α2腎上腺素通路能介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路[4]。綜上所述，本文旨在探討可樂定是否通過調(diào)節(jié)ERK信號通路來改善腦缺血的后遺癥—學習記憶障礙，為慢性腦缺血提供新的治療策略。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

45只雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(300±50) g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0005。利用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham)組、腦缺血(ischemia)組和可樂定(clonidine)組，每組15只，術(shù)前連續(xù)給藥1周，其中可樂定組每日100 μg/kg可樂定灌胃，正常組和模型組每日灌胃等體積蒸餾水。手術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)30 d，均自由飲食與攝水。

2 實驗試劑及儀器

可樂定購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為09081232；抗ERK1/2、p-ERK1/2、環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(c-AMP-response element binding protein)CREB和p-CREB抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗及鼠抗β-actin抗體購自Santa Cruz Biotechnology。DYC2-24DN型電泳儀(北京市六一儀器廠)；MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；FA1104電子天平(上海方瑞儀器有限公司)。

3 方法

3.1大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)模型的制備 各組大鼠手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。手術(shù)當天，對大鼠稱重后，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于大鼠解剖板上，剪去頸部手術(shù)區(qū)毛，碘伏、醫(yī)用乙醇依次消毒手術(shù)區(qū)，于頸部行合適的切口，分離胸鎖乳突肌，切斷二腹肌前腹，暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)，靠近近心端結(jié)扎CCA，在分岔處結(jié)扎ECA，并預留一根線于CCA處，用微型動脈夾在遠心端進行夾閉，于CCA與ICA分岔處0.5 cm剪一小口，從開口處往頸內(nèi)動脈慢慢插入直徑0.235 mm或0.265 mm的尼龍栓，將栓線插入2.5cm左右可達到1.8～2.0 cm的插入深度，并用預留的手術(shù)線結(jié)扎切口處，全層縫合傷口，消毒，最后將大鼠放于鼠籠中并用白熾燈加熱維持大鼠體溫。持續(xù)栓塞2 h后將栓線拔出再灌注30 d，待動物蘇醒后血管栓塞的同側(cè)出現(xiàn)Hornor征和對側(cè)肢體運動障礙即為模型成功。假手術(shù)組操作過程同手術(shù)組，但大鼠右側(cè)頸總和頸外動脈不結(jié)扎也不插入栓線。

3.2Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)檢測大鼠學習記憶能力 術(shù)后4周對各組大鼠進行MWM實驗。(1) 定位航行實驗：將站臺置于水迷宮第3象限中央，每天相同時段讓大鼠面向池壁從第1象限中入水，電腦記錄其在90 s內(nèi)找到并爬上站臺的時間，若在90 s內(nèi)沒有找到站臺，則將其放至站臺停留20 s，逃避潛伏期記為90 s，每天游泳訓練2次，連續(xù)5 d；(2) 空間探索實驗：MWM實驗第6天，將第3象限中站臺撤去，在相同時段，讓大鼠自由游泳1次，每次時間為90 s。電腦記錄大鼠在第3象限的停留時間(residence time in the third quadrant，RTQ)、跨越隱匿站臺的次數(shù)及入水朝向角。

3.3腦組織實驗樣本的制備 MWM實驗完成后，對大鼠腹腔注射10% 水合氯醛(3.5 mL/kg)進行麻醉，麻醉成功后，迅速打開其胸腹腔，充分暴露心臟和肝臟，將灌注針從心尖插入左心室至主動脈，同時剪開右心耳，用0.01 mol/L PBS快速灌注至肝臟透明[4]。灌注成功后，將大鼠在冰上斷頭處死，快速分離海馬組織，一半腦組織迅速放入-80 ℃冰箱中，一半腦組織迅速放于4%多聚甲醛溶液中固定24 h備用。

3.4免疫組織化學檢測 將腦組織制成海馬相關(guān)區(qū)域冠狀切片并在梯度乙醇下常規(guī)脫蠟至水；室溫下用3% H2O2孵育25 min；在微波沸騰條件下用檸檬酸修復液行抗原修復；5% BSA 30 ℃條件下封閉30 min；滴加 I 抗稀釋液 (1∶300)，濕盒4 ℃孵育過夜。選擇合適的生物素化 II 抗工作液滴加于切片組織上，30 ℃避光孵育30 min；將適量的辣根酶標記物工作液滴加于切片組織上，30 ℃避光孵育30 min；DAB顯色劑顯色5 min，蘇木素復染30 s，沖洗干凈；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。用0.01 mol/L PBS代替 I 抗進行免疫組化染色設(shè)為陰性對照組，其余步驟同上。在倒置顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，用IPP 6.0軟件對染色結(jié)果進行累積吸光度(IA)值定量分析。

3.5Western blot檢測 將海馬組織從-80 ℃冰箱中取出，根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，BCA法測定并將各組蛋白調(diào)至等濃度，加適量上樣緩沖液并混勻，煮沸5 min；采用濕轉(zhuǎn)法將目標蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h，加入稀釋的I抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜；加入稀釋的 II 抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，化學發(fā)光法進行曝光；蛋白表達量以其與內(nèi)參照蛋白條帶灰度的比值表示。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 可樂定對SD大鼠逃避潛伏期的影響

與假手術(shù)組比較，在5 d定位航行的實驗中，腦缺血組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05或P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂定組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 3組SD大鼠逃避潛伏期的比較

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsischemia group.

2 3組SD大鼠在第3象限停留時間、跨越隱匿站臺次數(shù)及入水朝向角的比較

與假手術(shù)組比較，腦缺血組大鼠的RTQ及跨越隱匿站臺次數(shù)顯著減少(P<0.01)，入水朝向角明顯增加(P<0.01)；與腦缺血組比較，可樂定組大鼠的RTQ及跨越隱匿站臺次數(shù)顯著增加(P<0.01)，入水朝向角明顯減小(P<0.05)，見表2。

表23組SD大鼠間RTQ、跨越隱匿平臺的次數(shù)及入水朝向角的比較

Table 2. Comparison of RTQ, number of cross-hidden platform and the orientation angle between 3 groups of SD rats (Mean±SD.n=15)

GroupRTQ(s)NumberOrientationangle(°)Sham30.78±6.565.68±1.7236.52±18.78Ischemia15.32±4.97**1.35±0.86**65.69±34.33**Clonidine28.19±5.87##4.49±1.31##38.17±22.17#

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsischemia group.

3 免疫組織化學法檢測可樂定對海馬CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白的表達

海馬CA1區(qū)中p-ERK1/2蛋白主要存在于細胞膜及胞漿中，p-CREB蛋白主要存在于細胞核中。與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬中各蛋白陽性水平均明顯增加(P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂定組海馬中各蛋白陽性水平均明顯降低(P<0.01)，見圖1、表3。

4 Western blot 檢法可樂定對海馬組織中p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB的蛋白水平顯著增加(P<0.01)；與腦缺血組相比，可樂定組大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB的蛋白水平顯著減少(P<0.01)，見圖2。

討 論

本次實驗的目的是探討α2腎上腺素受體激動劑可樂定對腦缺血導致的學習記憶障礙是否具有改善作用?；诖宋覀兪紫炔捎眯袨閷W研究方法——Morris水迷宮檢測可樂定對慢性腦缺血大鼠是否具有改善學習記憶的作用，結(jié)果表明可樂定能提高腦缺血大鼠的學習記憶能力，發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象后我們進一步通過免疫組織化學和Western blot法檢測ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果表明ERK信號通路相關(guān)蛋白表達發(fā)生了改變，提示可樂定改善腦缺血后的學習記憶障礙可能是通過調(diào)節(jié)ERK信號通路實現(xiàn)的。

Figure 1. The relative protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB in hippocampal of 3 groups of SD rats (×400).

圖1可樂定對海馬CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白水平的影響

Figure 2. The effects of clonidine on the relative protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB in the hippocampal between 3 groups of SD rats. Mean±SD.n=15.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsischemia group.

圖23組SD大鼠海馬組織中p-ERK1/2和p-CREB相對蛋白表達量的比較

表33組SD大鼠海馬組織CA1區(qū)p-ERK1/2和p-CREB蛋白水平(IA)的比較

Table 3. Comparison of the protein levels of p-ERK1/2 and p-CREB (expressed asIA) in the hippocampal CA1 between 3 groups of SD rats (×103. Mean±SD.n=15)

Groupp-ERK1/2p-CREBSham2.09±0.619.83±2.15Ischemia5.76±0.77**20.52±4.81**Clonidine2.69±0.68##11.08±3.57##

**P<0.01vssham operation group;##P<0.01vsischemia group.

腦缺血能夠引起乙酰膽堿酯酶(acetylcholines-terase，AChE)活性增加，導致膽堿能系統(tǒng)功能降低，從而引起學習記憶能力的下降，甚至癡呆[5]。從上世紀70年代起α2腎上腺素受體激動劑已經(jīng)成功應用于高血壓的治療，并能夠降低充血性心力衰竭的心臟后負荷，此外，α2腎上腺素受體激動劑對腦缺血后導致的神經(jīng)損傷無論是從行為學還是功能上[6]都具有很好的改善作用。葉春玲等[7]發(fā)現(xiàn)可樂定作為α2腎上腺素受體激動劑能顯著延長腦缺血小鼠以及急性腦缺血貓的的存活時間。并且越來越多的研究表明可樂定可以對抗神經(jīng)元興奮性毒性從而具有神經(jīng)元保護作用。Zhang等[6]研究指出可樂定預處理可明顯提高大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能評分及降低腦梗死體積，從而對抗腦缺血產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。但可樂定對腦缺血的后遺癥是否具有改善作用目前報道甚少。我們的實驗旨在探討可樂定是否可以改善腦缺血后學習記憶障礙。

α2腎上腺素能通路介導的信號途徑多且復雜，除了經(jīng)典的Gi蛋白介導的 PKA-cAMP 通路以外，還可以激活絲裂原活化蛋白激酶家族中的ERK1/2通路[8]。ERK1/2是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育及生物學功能發(fā)揮的必需物質(zhì)，參與細胞的生長、分化和增殖，并介導凋亡信號傳遞等，然而一些新近研究報道指出，ERK信號通路可能參與神經(jīng)毒性作用[4]，腦缺血發(fā)生后，通過各種胞膜受體介導，激活蛋白激酶C途徑、腺苷酸環(huán)化酶途徑、肌醇三磷酸激酶途徑和酪氨酸受體途徑等，再激活MAPK級聯(lián)反應，引發(fā)腦缺血損傷[9]。此外，ERK1/2通路在神經(jīng)可塑性以及學習記憶中起著重要的作用[10]，與學習密切相關(guān)的形式就是長時程增強效應(long-term potentiation，LTP)，即突觸活動的易化現(xiàn)象，目前被公認為是研究學習記憶的最理想模型。大量的研究發(fā)現(xiàn)，LTP的形成伴隨著ERK2活性的升高，而采用特異性ERK2阻斷劑則可以抑制LTP的形成，起到長時程抑制的效果，因此表明ERK1/2與學習記憶密切相關(guān)。而我們的實驗表明腦缺血后ERK1/2活性增加，學習記憶下降，而可樂定則能逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，因此我們推測缺血狀態(tài)下，ERK1/2信號可能參與了學習記憶機制的調(diào)節(jié)或者修復過程。CREB作為ERK1/2下游信號因子也是cAMP反應原件應答蛋白，其主要在腦內(nèi)神經(jīng)元細胞核中表達，是被最早證實的具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用的細胞因子，其可以調(diào)節(jié)cAMP的基因轉(zhuǎn)錄主要是作用于cAMP的起始子以及由各種信號分子產(chǎn)生的cAMP大量下游信號靶點，從而影響很多神經(jīng)元的基因和蛋白表達，最終調(diào)節(jié)整個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。大量的實驗研究已經(jīng)證實CREB與學習記憶密切相關(guān)。有研究表明在海馬切片中后期LTP的維持伴隨著磷酸化CREB蛋白表達增加，這種情況可以持續(xù)4 h，證實了磷酸化CREB在LTP后期中起著非常重要的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，PKA抑制劑可以阻斷CERB的磷酸化以及長期LTP的形成，但是并不影響早期LTP階段。在早期壓力所致的學習記憶下降的中年ApoE4-TR大鼠中檢測到磷酸化CREB的降低[13]。據(jù)此表明磷酸化CREB與學習記憶密切相連。我們的實驗表明可樂定能夠使大鼠在原來象限所逗留的時間增加，表明可樂定確有提高學習記憶的作用，進一步觀察到與學習記憶密切相關(guān)的蛋白磷酸化ERK1/2以及CREB表達均減少，表明ERK1/2改善腦缺血后的學習記憶可能是通過降低磷酸化ERK1/2以及CREB表達來實現(xiàn)的。

總之，我們的實驗表明在MACO模型中所致的慢性腦缺血模型中可樂定具有改善腦缺血的學習記憶的作用，其可能是通過升高磷酸化ERK1/2以及CREB表達來實現(xiàn)的。

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