影響ELISA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的環(huán)節(jié)及試驗(yàn)成功的關(guān)鍵

郭紅佳 , 普朝華

（1.新平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 653400；2.新平縣畜牧推廣站 653400）

ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、適合批量操作等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、動(dòng)物疫病診斷、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。

1 ELISA試驗(yàn)操作環(huán)節(jié)

1.1 試劑。試劑盒的質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，試劑盒質(zhì)量不過(guò)關(guān)或者存儲(chǔ)不當(dāng)，導(dǎo)致試劑中抗原抗體的活性降低、失活，酶結(jié)合物濃度過(guò)高或偏低都將影響試驗(yàn)結(jié)果。

1.2 待檢樣品。常用的待檢樣品一般為血清（血漿），樣品采集中若出現(xiàn)溶血、細(xì)菌污染， 很可能造成樣品假陽(yáng)性，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.3 儀器設(shè)備。 試驗(yàn)前校準(zhǔn)移液器，提前預(yù)熱酶標(biāo)儀，檢查其能否正常工作。

1.4 操作

1.4.1 回溫: 試劑盒未回溫將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)前需將試劑盒從冰箱取出回溫至25℃，使用前各試劑充分混勻。

1.4.2 樣品稀釋: 樣品的稀釋倍數(shù)、方法，試劑盒操作說(shuō)明均有嚴(yán)格規(guī)定，未按試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)待檢血清進(jìn)行稀釋，或稀釋液與血清混合不均勻，將影響試驗(yàn)檢測(cè)果。

1.4.3 洗液配置: 洗滌是ELISA試驗(yàn)中操作次數(shù)最多的步驟，也是非常重要的一步。未嚴(yán)格按說(shuō)明準(zhǔn)確配置洗液，導(dǎo)致洗液濃度過(guò)高或偏低，造成洗板效果不佳，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.4.4 加樣: 加樣太快，液體濺出或產(chǎn)生氣泡；未垂直加樣，液體留在孔壁；加樣次序未按說(shuō)明書進(jìn)行；加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，板孔間反應(yīng)進(jìn)程不一致。

1.4.5 溫育: 溫育是ELISA試驗(yàn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，必須按照說(shuō)明書規(guī)定的時(shí)間、溫度進(jìn)行溫育，實(shí)踐中常采用的溫育溫度有室溫或37℃，通?？乖贵w在37℃經(jīng)過(guò)規(guī)定的溫育時(shí)間產(chǎn)物的生成達(dá)到頂峰。封板溫育時(shí)若陽(yáng)性標(biāo)本蒸發(fā)，會(huì)出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象。

1.4.6 洗板: 洗板在ELISA試驗(yàn)中雖算不上一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著試驗(yàn)的成敗，洗板的目的是為了去除反應(yīng)體系中未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗板不干凈易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性，而過(guò)度洗滌又會(huì)使抗原抗體洗脫，影響試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。

1.4.7 顯色: 顯色是ELISA反應(yīng)的最后一步，底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)10～15min，顯色時(shí)間、顯色溫度均影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，需嚴(yán)格按操作規(guī)程，固定顯色時(shí)間和溫度。

1.4.8 讀數(shù): 顯色結(jié)束后迅速加入終止液，TMB的終止液一般為疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉等酶抑制劑，加入終止液后反應(yīng)體系由藍(lán)色變?yōu)辄S色，應(yīng)盡快在2min內(nèi)通過(guò)酶標(biāo)儀讀取OD值，隨著時(shí)間的推移吸光度值將逐漸下降，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果讀數(shù)不準(zhǔn)。

1.5其他影響因素: 試驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、溫度、濕度亦是影響試驗(yàn)結(jié)果的因素。

2 ELISA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵

2.1 試劑盒質(zhì)量沒(méi)問(wèn)題。工作中挑選三證齊全、質(zhì)量可靠的試劑盒，避免非操作因素引起的誤差。

2.2 不同批號(hào)試劑盒不能混用，最好用新日期的試劑。

2.3 規(guī)范采樣。樣品采集過(guò)程盡可能做到無(wú)菌操作，全血的采集及血清的分離避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血和雜菌污染。

2.4 樣品保存得當(dāng)。當(dāng)天檢測(cè)的樣品標(biāo)本置于冰箱2℃～8℃保存；一星期內(nèi)檢測(cè)的樣品于-20℃保存；超過(guò)一個(gè)月后才檢測(cè)的樣品超低溫（-70℃）下保存。

2.5 樣品成功復(fù)溫。一般將樣品于實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)取出放置室溫下自然解凍復(fù)溫，樣本避免劇烈震蕩、搖晃，確保有效物質(zhì)沒(méi)有降解。

2.6 嚴(yán)格按說(shuō)明規(guī)程規(guī)范操作，操作過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)失誤，樣本編號(hào)沒(méi)有混亂。

2.7 移液器、酶標(biāo)儀定期檢查校驗(yàn)，酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定準(zhǔn)確。

3 總結(jié)

3.1 任何實(shí)驗(yàn)方法都要通過(guò)專業(yè)技術(shù)人員的操作完成，因此，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)強(qiáng)化質(zhì)量意識(shí)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，提高實(shí)驗(yàn)操作水平。

3.2 合格的試劑、精準(zhǔn)的儀器、優(yōu)良的設(shè)備、嚴(yán)格的操作規(guī)程以及排除各個(gè)環(huán)節(jié)的干擾因素是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的前提。

3.3 檢驗(yàn)人員必須具備良好的職業(yè)道德和認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度，充分認(rèn)識(shí)檢測(cè)質(zhì)量對(duì)于疫病診斷治療的重要性，以高度負(fù)責(zé)的態(tài)度對(duì)待每一份檢測(cè)標(biāo)本，確保每一份樣品的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤。