三氧療法在卒中后肺炎康復治療中的潛在作用

張倩，席家寧

首都醫(yī)科大學附屬北京康復醫(yī)院，北京市100144

腦卒中對全球衛(wèi)生保健系統(tǒng)和社會造成重大負擔[1]。除神經功能缺損外，卒中后呼吸道感染和尿道感染等并發(fā)癥也對患者的進一步康復構成障礙，并增加死亡風險[2]。腦卒中相關感染，特別是肺炎，與不良預后獨立相關[3]。細菌性肺炎是最常見的并發(fā)癥[4]。

1 卒中后肺炎的特點

微生物學數據顯示，卒中后肺炎大多數為早期發(fā)作的醫(yī)院獲得性肺炎或社區(qū)獲得性吸入性綜合征。金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細菌，如肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌或腸桿菌屬等最為常見[5]。

患者的臨床狀況，如卒中嚴重程度、保護性反射受損、吞咽困難、機械通氣及其他醫(yī)源性侵入性操作等，影響卒中后肺炎的感染率。由于缺乏保護性反射，患者的誤吸風險增加，并與意識障礙程度有關。大多數卒中相關性肺炎由吞咽困難和隨后吸入口咽或胃內容物引起的。但臨床上，約一半卒中后肺炎患者沒有吞咽困難；同時，約一半健康成年人睡眠時發(fā)生誤吸，但不會發(fā)展為肺炎[6]。這意味著還涉及其他機制，如腦卒中誘導的免疫抑制[7]、對感染的易感性和全身性抗炎反應[8]。

中樞神經系統(tǒng)通過自主神經系統(tǒng)感知體內炎癥，并在發(fā)生全身性感染或受傷時產生強烈的反調節(jié)反應；這種反應本質上是抗炎和免疫抑制的，可以被認為是適應性反應，有助于遏制因感染和損傷引起的炎癥。腦或脊髓損傷可導致中樞神經系統(tǒng)產生炎性介質，或破壞神經免疫相互作用的控制信號，這兩種情況均可能導致固有和適應性免疫系統(tǒng)下調；而在沒有周圍炎癥刺激的情況下，這會導致人體防御系統(tǒng)嚴重缺陷，使宿主易受微生物侵襲[7]。

卒中后肺炎的治療通常是經驗性的，非插管患者可能難以獲得下呼吸道培養(yǎng)物。目前除護理和功能訓練外，預防性抗生素也應用于臨床實踐。系統(tǒng)綜述表明[9]，預防性應用抗生素可降低卒中后肺炎的風險，但抗生素治療對腦卒中患者的死亡率沒有顯著影響。故目前尚無足夠的證據推薦急性腦卒中后常規(guī)預防性使用抗生素[10]。

2 三氧療法

三氧(O3)是由3個氧原子組成的特殊分子，是氧(O2)的同素異構體，因特征性刺激氣味，又名臭氧，具有極強的氧化性。三氧療法基于醫(yī)用劑量O3與體液混合后產生的各種生物學效應，目前用于50 多個病理過程的治療。三氧療法結合O2-O3混合物，具有不同的治療劑量[11]。三氧療法給藥根據治療目標和治療部位而不同，目前常用O3自體輸血(ozonated autohaemotherapy,O3-AHT)，其優(yōu)勢是取預定量血液，經計算，可以注入精確的O2-O3混合氣體。少量血液在體外與O3發(fā)生快速反應，產生各種生化產物后，輸回患者。其他治療方式包括通過肌肉、椎間盤內和椎旁直接注射給藥。直腸注入是另一個常見的給藥方式。經鼻、輸卵管、口腔、陰道、膀胱、胸膜和腹膜腔灌氣是需要慎重選擇的給藥途徑[12]。

臨床試驗證明[12-15]，O2-O3療法在心血管、外周血管、神經系統(tǒng)、退行性病、骨科、胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)病理方面的有效性，包括多發(fā)性硬化癥[16]、纖維肌痛[17]、糖尿病/潰瘍[18-19]、皮膚疾病/傷口愈合[20-21]、傳染病[12,22]、口腔科[23]以及骨髓炎[24]。

根據O3靶向相關分子機制，試圖尋找這些過程是否與卒中后肺炎發(fā)病機制相關，以推定其治療靶標，為卒中后肺炎中應用O3治療進行理論準備。

3 三氧療法作用機制

O3是一種三原子氣體分子，在自然界中是由于射線與大氣中的O2反應產生，性質很不穩(wěn)定，極易分解成O2和氧原子(O)，常溫下O3半衰期為20～30 min。天然的O3能阻擋紫外線，保護人體免受傷害。人體也會產生氧化劑攻擊入侵的病原體，除過氧化氫、超氧化物、次氯酸鹽和O2外，還包括O3。人外周血分離的帶有抗體的中性粒細胞，可通過水氧化途徑催化O3生成，從而有效殺滅細菌[25]。O3有免疫調節(jié)和抗炎、抗氧化活性，有抗菌、鎮(zhèn)痛、促進氧合和血管舒張作用等[12,26]。

3.1 免疫調節(jié)及抗炎

O3和其他醫(yī)用氣體，如一氧化碳和一氧化氮具有雙重作用，具體取決于劑量和細胞的氧化-還原狀態(tài)。O3很容易溶解在血漿的水中，并被親水性抗氧化劑(如還原性谷胱甘肽、抗壞血酸和尿酸)作為犧牲性化合物而部分(20%～40%)淬滅，大部分與多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)反應并由白蛋白運輸[27]。治療范圍為10～80 μg (0.21～1.68 μmol)/ml，以產生精確微小的氧化應激，從而引起無毒性的功效。O3是一種前藥，在反應過程中快速消失，產生兩個重要產物：過氧化氫和脂質氧化產物(lipid oxidative product,LOP)，最終以4-羥基壬烯(4-Hydroxynonenal,4-HNE,來自ω-6 PUFA)和4 羥基-2-己烯(4-hydroxy-2-hexenal,4-HHE,來自ω-3 PUFA 的反式)的形式存在[28]。

過氧化氫容易擴散到免疫細胞，同時也是信號轉導中的調節(jié)步驟，促進多種免疫反應[29-30]，特別是干擾素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的增加；IL-2 增加會啟動免疫反應[31]。另外，過氧化氫激活核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)和轉化生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)，從而增加免疫活性細胞因子的釋放，上調組織重塑。過氧化氫增強酪氨酸激酶活性，磷酸化IκB (NF-κB 的一個亞基)[32]，介導NF-κB 作用。低劑量O3抑制前列腺素合成，釋放緩激肽，增加巨噬細胞和白細胞分泌物，促進過氧化氫和一氧化氮水平，從而刺激IL-8 增加。IL-8還激活NF-κB。動物實驗顯示[33]，使用O3可減輕和預防大腸桿菌誘導的腎臟系統(tǒng)炎癥反應。

低劑量O3可促進單核細胞形成和T 細胞活化。當T 細胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識別入侵者后，TCR 相關的蛋白激酶(70-kDa zeta-chain associated protein,ZAP-70)分子發(fā)生酪氨酸磷酸化反應，激活磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLCγ1)[34]，產生兩個關鍵的第二信使：肌醇三磷酸酯(inositol triphosphate,IP3)和二?；视?diacyl glycerol,DAG)。IP3與其位于內質網膜上的受體IP3r 結合，導致Ca2+從內質網進入細胞質；細胞質中Ca2+升高激活鈣調磷酸酶，從而使活化T 細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)脫磷酸化并將其轉運到細胞核中。NFAT 誘導細胞因子轉錄，如IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 和干擾素-γ，同時還有DNA 上的免疫應答元件。這些細胞因子具有促炎和趨化作用，促進嗜中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和其他炎性細胞聚集、浸潤，并增強其吞噬能力，以殺死局部病原體[33]。NFAT 也可以在其他細胞和組織中表達，自身也可以與DNA 結合。NFAT 與DNA 的結合主要通過核轉錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)共存誘導。AP-1 通過促分裂原激活的蛋白激酶途徑激活，從而激活免疫應答[28]。過氧化氫是一種活性氧，可以充當O3的信使[35]，誘導NFAT或AP-1激活，從而刺激先天免疫系統(tǒng)，幫助細胞免于損傷。

由O3引起的中度氧化應激會增加核因子-類胡蘿卜素2 相關因子2 (nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)活化，Nrf2 激活抗氧化反應元件(anti-oxidative response element,ARE)的轉錄，即Keap1/Nrf2/ARE 信號通路，調控抗炎基因表達，抑制炎癥進展[36]。誘導ARE 轉錄后，各種抗氧化劑酶響應O3的短暫氧化應激，水平升高，如過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉移酶、過氧化氫酶、血紅素加氧酶-1、NADPH-醌-氧化還原酶和熱休克蛋白，它們與臨床多種疾病的自由基清除有關[12]。

3.2 刺激氧代謝和調節(jié)血管

O3是O2跨膜流動的刺激物。三氧療法繼發(fā)細胞內O2含量增加，使線粒體呼吸鏈更有效[33]。O3-AHT 可增加紅細胞果糖磷酸激酶活性，從而增加糖酵解速度，進而增加ATP 和2,3-二磷酸甘油酸酯(2,3-diphosphoglycerate,2,3-DPG)，2,3-DPG 使血紅蛋白解離平衡偏移，從而增加組織中O2的輸送。再加上一氧化氮合酶活性增加，O3-AHT 刺激區(qū)域灌注明顯增加[37]。反復治療可產生足夠LOP，到達骨髓，作為應激源，促進紅細胞生成和抗氧化酶上調。O3也引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸減少，并協(xié)助氧化細胞色素C。

O3可以改善血液循環(huán)，以及向缺血組織輸送氧氣[38]，增加抗氧化酶糾正慢性氧化應激可增加成紅細胞分化，導致紅細胞增加，即“氧化預處理”[39]。此外，O3誘導產生血管舒張劑前列環(huán)素[31]，并通過血管內皮細胞刺激一氧化氮產生[40]。這些事件有利于微循環(huán)水平血管擴張，降低周圍血管阻力。

4 三氧療法應用于卒中后肺炎

卒中后肺炎的發(fā)生與環(huán)境(如患者所處空間及醫(yī)源性侵入性操作)、病原體致病性、患者免疫與屏障功能受損相關。以下發(fā)病機制可能與O3治療靶點對應。

4.1 免疫和抗炎作用

卒中后肺炎最常培養(yǎng)出的細菌為需氧革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌，包括腸桿菌科(肺炎克雷伯菌、大腸桿菌)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌[6,41]。隨著抗生素的濫用，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌變得越來越普遍，也時常可以看到多重耐藥細菌。念珠菌通常代表定植或氣管受累[42]。與非臥床患者相比，大約75%危重患者感染革蘭氏陰性桿菌[43]。在革蘭氏陰性菌中，脂多糖似乎起了重要作用。

脂多糖與其主要受體Toll樣受體4(Toll-like receptors,TLR-4)結合[44]。細胞內銜接蛋白(如MyD88)與TLR-4 結合并激活涉及細胞外信號調節(jié)激酶和p38 等多種細胞內信號級聯(lián)反應；TLR 激活巨噬細胞，產生促炎細胞因子，包括TNF、IL-1β 和IL-6，協(xié)調局部和全身炎癥反應。TNF 和IL-1β 依次激活局部內皮，誘導血管舒張，并增加血管通透性，使血清蛋白和白細胞募集到感染部位。此外，內皮上組織因子(也稱“凝血因子Ⅲ”)增加，導致局部凝血級聯(lián)反應，有助于防止微生物通過血液傳播。IL-1β 和IL-6 一起激活肝細胞，產生急性期蛋白，這些蛋白質激活補體并調理病原體，以便巨噬細胞和中性粒細胞吞噬。這些信號的表達通過NF-κB途徑激活[45]。

微生物病原體可以通過多種致病方式，使機體感染。大腸桿菌使用效應子逃避先天免疫應答。效應子之一OspG 與泛素化E2 蛋白結合，可阻止NF-κB 亞基-α (IκBα)抑制劑降解，從而抑制NF-κB 活化[46]。OspB 與OspF 作用，通過招募宿主因素改造染色質，降低IL-8 水平[47]。總體上，效應子減弱炎癥反應，使細菌得以長期存活[48]。肺炎克雷伯菌免疫逃避策略的重要手段為阻止由NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)控制的TLR依賴性激活：克雷伯菌可劫持去泛素化酶cylindromatosis (CYLD)和MAPKs 磷酸酶MKP-1；在組織水平，克雷伯菌利用IL-10 的抗炎特性塑造局部微環(huán)境，通過限制炎癥反應實施免疫逃避[49]。銅綠假單胞菌的鞭毛、脂多糖和4 型菌毛有高度炎癥性，可被宿主模式識別受體(如TLR)識別，通過NF-κB信號通路引發(fā)炎癥反應[50-51]。

動物實驗證明，腦卒中導致與菌血癥和肺炎相關的細胞介導免疫持續(xù)下降，如單核細胞失活、淋巴細胞減少、Th1/Th2轉移，早期NK 細胞和T 細胞反應受損，尤其是干擾素-γ 產生減少，誘發(fā)關鍵性抗菌防御缺陷[52]。腦卒中患者T 細胞快速丟失和功能失常是常見變化，與腦缺血后免疫抑制一致。腦卒中后，細胞免疫應答降低、交感神經活動增加，與較高的感染風險相關[9-10,53]。

O3可增加巨噬細胞和白細胞分泌，增強粒細胞吞噬能力，促進單核細胞形成和T 細胞活化。過氧化氫誘導NFAT 激活，啟動免疫系統(tǒng)；同時通過Keap1-Nrf2-ARE 信號通路產生抗炎作用。與野生動物相比，Nrf2-/-動物表現(xiàn)出更嚴重的炎癥和組織損傷，推測Nrf2 信號傳導途徑在炎性疾病中具有保護作用[54]。激活肺泡巨噬細胞Nrf2，可對肺部炎癥產生保護作用，阻止向肺氣腫發(fā)展[55]。

4.2 改善血液循環(huán)和氧化預處理

O3改善血液循環(huán)和向缺血組織輸送氧氣的作用，以及2,3-DPG 水平增加、谷胱甘肽還原劑增加，我們推測O3處理可以部分改善因炎癥受損的氧化代謝。O3通過增加Keap1-Nrf2-ARE信號通路中的抗氧化酶，糾正慢性氧化應激，增加成紅細胞分化，導致紅細胞增加，即氧化預處理。同時通過前列環(huán)素和一氧化氮的產生，改善微循環(huán)。

5 小結

三氧療法可能對卒中后肺炎有效，減少抗生素使用。機制主要歸因于免疫和抗炎系統(tǒng)激活，細胞抗氧化酶活性上調，血小板生長因子釋放增強，血液循環(huán)和O2遞送改善組織氧合，增強新陳代謝[25]。Nrf2-ARE、NF-κB、NFAT、AP-1 等是O3發(fā)揮作用的主要信號通路。這種療法沒有副作用[56-57]。可進一步通過臨床試驗證實其療效。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。