疫苗誘導(dǎo)的免疫性血栓性血小板減少癥的可能機制與研究進展

朱耐偉，張 昕，霍丹丹，吳 丹，聶為民，黃 磊

2019年12月，中國武漢出現(xiàn)多例不明原因肺炎患者?？茖W(xué)家利用宏基因組測序技術(shù)（metagenomic next-generation sequencing,mNGS）對病原體基因進行了檢測，證明是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease-2019,COVID-19）[1]。截至2021年5月18日24時， WHO數(shù)據(jù)顯示全球累計確診患者163 312 429例，死亡3 386 825例，給世界公共衛(wèi)生、經(jīng)濟發(fā)展和人類健康帶來巨大影響[2]。目前，尚無針對SARS-CoV-2的特效抗病毒藥物，疫苗接種是當(dāng)前最有效且經(jīng)濟的防控手段[3]。世界各國采用滅活疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗、蛋白亞基疫苗和mRNA疫苗等技術(shù)方法，緊急開展COVID-19疫苗的研發(fā)與制備。截至2021年5月14日，全球范圍內(nèi)處于臨床前研究的疫苗184種，處于臨床研究的疫苗100種[4]。目前已上市的疫苗有滅活疫苗、腺病毒載體疫苗和mRNA疫苗。在疫苗最初的臨床試驗中，除了罕見過敏反應(yīng)外，無其他任何影響安全的重大事件報道。迄今為止，在全世界6億多人接種疫苗后，出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險仍然非常低。

然而，隨著研究者對大量疫苗接種后隨訪信息的分析，疫苗相關(guān)的自發(fā)性肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥越來越引起關(guān)注，其與肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥（heparin-induced thrombocytopenia,HIT）癥狀類似，研究人員將其定義為疫苗誘導(dǎo)的免疫性血栓性血小板減少癥（vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia,VITT）。本文就VITT的可能機制與研究進展作一綜述。

1 簡 介

根據(jù)英國、德國、法國和美國等國家報告的疫苗不良事件，VITT的發(fā)生率介于百萬分之一至百萬分之八[5]。VITT通常發(fā)生在接種COVID-19疫苗后5～30 d左右，其主要表現(xiàn)為血小板減少癥和血栓形成，血栓常發(fā)生在腦靜脈竇、門靜脈和內(nèi)臟靜脈等部位，造成缺血和出血性等損害。典型的實驗室特征包括血小板計數(shù)減少（常＜150×109/L）、D-二聚體升高（常＞4000 μg/L）、纖維蛋白原降低以及血小板因子4 （platelet factor 4,PF4）抗體陽性[6]。目前，導(dǎo)致出現(xiàn)VITT的疫苗主要有以下兩種：①ChAdOx1 nCoV-19 疫苗，是由牛津大學(xué)和阿斯利康公司共同研發(fā)的疫苗，其基于非復(fù)制型黑猩猩腺病毒載體，表達野生型刺突蛋白（spike protein,S蛋白），能有效誘導(dǎo)出體液免疫反應(yīng)（中和抗體和IgG）[7]，在I/II期臨床試驗中，未發(fā)現(xiàn)與ChAdOx1 nCoV-19疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件[8]。2021年2月中旬，首次出現(xiàn)因注射ChAdOx1 nCoV-19疫苗而發(fā)生門靜脈血栓和肺栓塞并最終死亡的病例。近期，不同研究團隊分別發(fā)現(xiàn)，部分人群在首次接種ChAdOx1 nCoV-19疫苗后5～24 d，在身體的特殊部位出現(xiàn)血栓形成和血小板減少癥癥狀，尤其是腦靜脈竇血栓形成（cerebral venous sinus thrombosis,CVST）和內(nèi)臟靜脈血栓形成，臨床表現(xiàn)包括深靜脈血栓、肺栓塞、動脈栓塞和血栓性微血管病等[9-14]。②Ad26.COV2.S疫苗，是由強生公司研發(fā)的腺病毒載體疫苗，Ad26.COV2.S疫苗是以復(fù)制缺陷型的人類26型腺病毒為載體，穩(wěn)定表達全長S蛋白的疫苗[15-16]。近期其他研究團隊也報道了Ad26.COV2.S接種后發(fā)生CVST和血小板減少癥的病例[17-19]。上述疫苗引發(fā)的癥狀類似于HIT的臨床表現(xiàn)，故將其定義為VITT。

2 致病機制

VITT的致病機制尚不清楚，其潛在的可能機制主要有PF4抗體作用、腺病毒載體作用及S蛋白作用3種。

2.1 PF4抗體的作用 PF4是一種帶正電荷的血小板蛋白，儲存在血小板α顆粒中[20]。PF4可通過電荷依賴的形式與帶負(fù)電荷的分子相結(jié)合，形成具有免疫原性的復(fù)合物，刺激機體產(chǎn)生特異性的IgG等抗體[21-22]?？乖贵w復(fù)合物與血小板膜表面的受體FcγRIIa相結(jié)合，激活血小板后引起血小板聚集，進而發(fā)生凝血反應(yīng)[23-25]。Greinacher等[9]、Schultz等[10]和Scully等[11]研究團隊發(fā)現(xiàn)發(fā)生VITT的患者體內(nèi)存在高水平的PF4-聚陰離子抗體，加入PF4可增強血小板的活化，提示疫苗接種可能會誘發(fā)針對血小板抗原的抗體形成，其中PF4抗體可能是VITT的主要致病原因。其發(fā)生機制類似于HIT ，提示免疫反應(yīng)可能是血栓形成的潛在原因之一[26-27]。

McGonagle等[28]認(rèn)為，經(jīng)肌肉注射的腺病毒載體疫苗會造成局部組織的微損傷，引起局部微出血和免疫細(xì)胞的活化，導(dǎo)致腺病毒DNA與PF4結(jié)合，抗原遞呈細(xì)胞攝取后，區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)的記憶B細(xì)胞產(chǎn)生大量抗PF4的自身抗體，從而造成VITT。該模型中DNA的有效載荷（即預(yù)先設(shè)計的DNA序列和結(jié)合物）和損傷部位的PF4可能是關(guān)鍵因素。Greinacher等[9]認(rèn)為，ChAdOx1 nCoV-19疫苗中的游離DNA可能是患者產(chǎn)生PF4抗體的觸發(fā)因素。該研究組在先前研究中發(fā)現(xiàn)，DNA和RNA與PF4形成的復(fù)合物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PF4-肝素復(fù)合物的抗體，其表現(xiàn)類似于HIT[29]。雖然有研究表明宿主的天然免疫系統(tǒng)可以與腺病毒相互作用，使腺病毒顆粒釋放出游離DNA[30-31]，但目前尚不清楚ChAdOx1 nCoV-19疫苗和Ad26.COV2.S疫苗是否存在游離DNA，該機制有待驗證。

S?rvoll等[32]對 492 例接種 ChAdOx1 nCoV-19疫苗的健康者檢測，僅有6例檢測到PF4-聚陰離子抗體，但上述抗體均無血小板活化的特性，受試者并無嚴(yán)重的血小板減少癥等臨床癥狀。Thiele等[33]檢測了健康疫苗接種者中PF4-聚陰離子抗體發(fā)生率，143例接種mRNA疫苗BNT162b2的人群中，8例PF4-聚陰離子抗體檢測呈陽性；138例接種ChAdOx1 nCoV-19疫苗的人群中，11例PF4-聚陰離子抗體檢測呈陽性，但上述人群的PF4-聚陰離子抗體均不能誘導(dǎo)血小板的活化，表明人群接種mRNA疫苗和腺病毒載體疫苗均可以出現(xiàn)PF4-聚陰離子抗體。此外，有研究表明5%～7%健康獻血者也可以檢測到低水平的非致病性PF4-聚陰離子抗體[34]。上述研究提示，大多數(shù)PF4-聚陰離子抗體與臨床無相關(guān)性，導(dǎo)致VITT的致病性血小板活化抗體仍是罕見的。

PF4在VITT發(fā)病機制中的作用仍不明確，PF4在VITT中是直接激活促進血栓形成還是以PF4-聚陰離子抗體的形式激活血小板仍有待研究。此外，引起VITT的致病性血小板活化抗體是疫苗的炎癥刺激誘導(dǎo)的抗PF4自身抗體，還是疫苗與PF4和血小板之間的交叉反應(yīng)誘導(dǎo)出的抗體，也尚須進一步加以探究和驗證。因此，有必要對自然感染后的抗PF4抗體和疫苗接種者深入研究，進一步在體內(nèi)模型中證明抗PF4抗體導(dǎo)致血栓形成和血小板減少癥，可能有助于深入了解VITT的風(fēng)險及病理生理學(xué)機制。

此外，有研究表明經(jīng)乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）修飾的血小板膜上可產(chǎn)生識別抗原的抗血小板自身抗體，從而導(dǎo)致血小板聚集，引起EDTA依賴性假性血小板減少癥[35-37]。因此，疫苗中的其他成分（如EDTA）是否參與VITT的形成，也須要進一步探討。

2.2 腺病毒載體的作用 研究發(fā)現(xiàn)，VITT主要出現(xiàn)在接種ChAdOx1 nCoV-19 疫苗和Ad26.COV2.S疫苗的人群中，但其機制目前尚不明確。上述兩種疫苗均以腺病毒為載體，ChAdOx1 nCoV-19疫苗主要是基于黑猩猩腺病毒的載體，來自腺病毒E亞群，使用柯薩奇和腺病毒受體及可能其他分子作為其細(xì)胞受體[38]。Ad26.COV2.S疫苗是基于人類腺病毒26型的載體，源自腺病毒D亞群，主要利用CD46作為其細(xì)胞受體[39]。兩種載體使用不同宿主細(xì)胞受體，可能具有不同的系統(tǒng)發(fā)育和生物學(xué)特性。目前，其他利用相同技術(shù)研發(fā)的腺病毒載體疫苗是否會引起VITT，還有待進一步證實。Barrett等[40]研究發(fā)現(xiàn)，接種ChAdOx1 nCoV-19疫苗后，抗ChAdOx1抗體在第一次給藥后的28 d內(nèi)開始增加，在84 d內(nèi)保持相對穩(wěn)定。因此，腺病毒載體疫苗接種后產(chǎn)生的抗載體抗體是否在VITT中發(fā)揮作用也不容忽視，須要進一步深入研究。

既往多項研究表明，動物體內(nèi)大量注射腺病毒可以引起血小板減少癥[41-43]，但當(dāng)前疫苗接種劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達不到動物實驗的致病條件。Stone等[44]發(fā)現(xiàn)腺病毒5型載體可直接結(jié)合并激活血小板，促進血小板與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致微血栓形成。Othman等[45]證實腺病毒5型載體可以激活血小板并誘導(dǎo)形成血小板-白細(xì)胞聚合物，同時腺病毒可激活內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生促凝血刺激，導(dǎo)致血小板減少癥和血小板功能障礙。目前，ChAdOx1載體和人腺病毒26型載體相關(guān)的研究尚處于空白，但仍不能排除腺病毒載體疫苗在某些情況下（如存在PF4抗體的情況下）導(dǎo)致病毒顆粒與血小板結(jié)合，從而激活血小板引起相應(yīng)癥狀。ChAdOx1 nCoV-19疫苗在BALB/c小鼠的生物分布研究發(fā)現(xiàn)，在給藥部位的骨骼肌中病毒拷貝數(shù)量最高，同時在心臟、肝臟、淋巴結(jié)、卵巢和睪丸等組織中也發(fā)現(xiàn)了低水平的病毒拷貝[46]。因此，腺病毒載體疫苗在注射部位以外的罕見易位是否會導(dǎo)致其與血小板相互作用也是同樣值得探索。

2.3 S蛋白的作用 SARS-CoV-2的S蛋白為三聚體跨膜糖蛋白結(jié)構(gòu)，是SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，也是COVID-19疫苗研發(fā)的主要靶點。其由N端的S1亞基和C端的S2亞基組成，其中S1亞基包含受體結(jié)合區(qū)域，負(fù)責(zé)識別和結(jié)合宿主細(xì)胞受體，S2亞基負(fù)責(zé)病毒外膜與細(xì)胞膜的膜融合[47]。Zhang等[48]研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的S蛋白可以直接活化血小板，并進一步證明是由S1亞基介導(dǎo)活化過程，導(dǎo)致凝血因子釋放、炎癥因子分泌和血小板-白細(xì)胞聚合物的形成，促進了體內(nèi)血栓的發(fā)生。因此，血液中游離S蛋白引起上述反應(yīng)的可能性在一定程度上存在，但疫苗接種后在血液中是否存在游離形式的S蛋白須在血液樣本中進一步驗證。

這兩款腺病毒載體疫苗編碼的S蛋白有所差異。Ad26.COV2.S疫苗編碼的是一種經(jīng)過修飾的融合前構(gòu)象的S蛋白，其在986位賴氨酸和987位纈氨酸處引入兩個脯氨酸突變從而穩(wěn)定S蛋白的融合前構(gòu)象，并將682位精氨酸和685位精氨酸分別突變，破壞了Furin蛋白酶切割位點，使得S蛋白無法脫落S1亞基[16]。而ChAdOx1 nCoV-19疫苗編碼的是未經(jīng)修飾的S蛋白，存在S1亞基脫落的情況。S蛋白的差異是否與VITT相關(guān)仍有待后續(xù)研究。

Almuqrin等[49]通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，ChAdOx1 nCoV-19疫苗感染體外細(xì)胞后，可表達多種腺病毒蛋白。目前還不清楚人體接種疫苗后是否也會表達腺病毒蛋白，但對上述現(xiàn)象的探索有助于更好地了解VITT的機制。

3 治療原則

根據(jù)國際血栓和止血學(xué)會對VITT的臨時治療指南[50]，目前的治療方法主要包括靜脈注射免疫球蛋白、糖皮質(zhì)激素、非肝素類抗凝藥和血漿置換。治療上要避免輸注血小板（除非患者須要緊急手術(shù)）、肝素、低分子量肝素和維生素K拮抗劑，以上藥物會加重抗體介導(dǎo)的血小板活化和凝血的發(fā)生[11，51]。對疑似VITT的患者應(yīng)立即給予靜脈注射免疫球蛋白（連續(xù)2 d，每日0.5～1.0 g/kg），免疫球蛋白可以通過結(jié)合Fc受體，抑制血小板的激活[52-53]，恢復(fù)患者的血小板計數(shù)并降低血液的高凝狀態(tài)，減少血栓栓塞的風(fēng)險[54-55]。若患者血小板計數(shù)低于50×109/L，則應(yīng)考慮使用糖皮質(zhì)激素（如潑尼松1～2 mg/kg）。如果患者血小板計數(shù)超過50×109/L且無嚴(yán)重出血，則可以使用非肝素類抗凝藥，如磺達肝癸鈉、阿加曲班或直接口服抗凝劑阿哌沙班和利伐沙班。當(dāng)患者通過靜脈注射免疫球蛋白和糖皮質(zhì)激素治療后，血小板計數(shù)仍低于30×109/L或纖維蛋白原水平低于1 g/L，則應(yīng)考慮早期使用血漿置換或補充纖維蛋白原至1 g/L以上，血漿中的IgG可以抑制抗體對血小板的激活，并在一定程度上糾正低纖維蛋白原血癥方面的凝血病[11，56]。

4 總結(jié)和展望

截至目前，COVID-19仍然是全世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，COVID-19疫苗為人類提供了重要且有效的保護，但VITT問題同樣不容忽視。VITT是主要針對ChAdOx1 nCoV-19疫苗，還是所有腺病毒載體的COVID-19疫苗甚至所有COVID-19疫苗，其致病機制又是如何，目前上述問題還須要進一步明確。相信在全世界科學(xué)家的共同努力下，VITT致病機理會不斷得到闡明，上述機制的明確將對候選疫苗的選擇及疫苗安全性提供有力的理論證據(jù)，勢必會進一步加速全球疫苗接種計劃，有效控制全球COVID-19疫情蔓延。