螯蝦瘟流行病學和診斷技術(shù)研究進展

曾韻穎，陳信忠，龔艷清，郭書林，朱黃鑫

（廈門海關(guān)，福建廈門 361026）

螯蝦種類繁多，分布廣泛，主要棲于淡水，耐污能力強，多種螯蝦可供人類食用，具有重要經(jīng)濟價值。此外，一些螯蝦體色艷麗美觀，而且容易飼養(yǎng)，近年來成為觀賞水族館里的新寵。變形藻絲囊霉（Aphanomyces astaci，A.astaci）導致的螯蝦瘟是最嚴重的流行病之一，對全球螯蝦物種構(gòu)成了重大威脅，已導致歐洲和亞洲的本土螯蝦大量死亡。A.astaci是全球100 種最嚴重的外來入侵物種之一[1]。

由于源產(chǎn)螯蝦種類很少，我國于20 世紀40 年代從北美引進了俗稱小龍蝦的克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），因其生存和繁殖能力強，成為我國主要養(yǎng)殖品種。20 世紀90 年代我國又從澳大利亞引進了澳洲淡水龍蝦紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），因其食性廣、生長快、肉質(zhì)鮮美，深受市場歡迎。我國已成為全球最大的螯蝦生產(chǎn)國和消費國。目前除臺灣地區(qū)外，我國大陸地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖螯蝦發(fā)生螯蝦瘟。本文對螯蝦瘟的病原學、流行病學和診斷技術(shù)進行綜述，以期為我國螯蝦瘟防控技術(shù)儲備研究提供參考。

1 病原

1.1 病原及分類

螯蝦瘟的病原主要為A.astaci，其屬于卵菌綱（Oomycota）水霉目（Saprolegniales），因具有絲狀等特性而被歸入真菌。但其與真菌有明顯不同，而與褐藻和硅藻關(guān)系更密切，因此卵菌綱與硅藻和褐藻一起被歸為菌界（Stramenopiles）或藻物界（Chromista）。

基于隨機擴增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）的研究[2-4]，發(fā)現(xiàn)A.astaci有5 個基因型，被歸為4 個群或4種菌株：A 群（Astacus，簡稱As 菌株）來自奧斯塔歐洲螯蝦（A.astacus）和格魯西東歐螯蝦（A.leptodactylus）；B 群（PacifastacusI，簡稱PsI 菌株）來自瑞典奧斯塔歐洲螯蝦和歐洲的信號螯蝦（P.leniusculus）；C 群（PacifastacusII，簡稱PsII 菌株）來自加拿大信號螯蝦；D 群（ProcambarusII，簡稱Pc 菌株）來自西班牙克氏原螯蝦。除此之外，Makkonen 等[5]報告了來自叉肢螯蝦（Orconectes limosus）的E 群e 菌株。文獻[6]報道，PsI 菌株致病力最強，可導致所有奧斯塔歐洲螯蝦在幾天內(nèi)死亡，而As 菌株毒力一般較弱。

有關(guān)A.astaci的基因組已有較多的研究報告。Makkonen 等[7]對A.astaciPc 基因型菌株P(guān)O3 和魚類流行性潰瘍綜合征病原入侵絲囊霉（A.invadans）菌株NJM9701 線粒體DNA（mtDNA）基因組進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者的mtDNA 分別為 49 489 bp 和49 061 bp，具有相似的遺傳內(nèi)容和結(jié)構(gòu)，編碼35 種蛋白質(zhì)。

近年來有很多學者對不同地區(qū)的A.astaci菌株基因型進行了研究。Martín-Torrijos 等[8]報告：來自美國東南部螯蝦和對蝦的A.astaci線粒體rnnS和rnnL基因具有迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最高遺傳多樣性，包含8 個基因型，其中6 個為新描述的基因型；A.astaci在該地區(qū)分布廣泛，遺傳多樣，支持螯蝦瘟起源于美國東南部的假說；A.astaci沒有表現(xiàn)出明確的物種特異性或地理模式。

在歐洲，Moj?i?ová 等[9]對2014—2019 年發(fā)生在捷克的螯蝦瘟病原基因型進行了研究，發(fā)現(xiàn)與宿主克氏原螯蝦有關(guān)的D 群菌株導致了捷克奧斯塔歐洲螯蝦和石螯蝦（Austropotamobius torrentium）大量死亡。微衛(wèi)星基因分型技術(shù)也重新鑒定了兩個As 中獨特的SSR 基因型。Rezinciuc等[10]對白圓鉗螯蝦（Austropotamobius pallipes）分離的A.astaci菌株進行AFLP-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株均為D 群，并具有相似的適應溫暖水溫的特性。Panteleit 等[3]2018 年報告格魯西東歐螯蝦A.astaci感染率為9%，叉肢螯蝦感染率為8%。所有海洋十足目動物中均未檢測出A.astaci。來自德涅斯特河的格魯西東歐螯蝦攜帶B 群菌株，而來自多瑙河三角洲的A.astaci屬于A 群和B 群。在多瑙河的入侵螯蝦種群中還發(fā)現(xiàn)A 群A.astaci。微衛(wèi)星分析揭示了與基因型Up 相同的基因型。Makkonen 等[11]比較了3 種基因型的A.astaci菌株對奧斯塔歐洲螯蝦的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsI 菌株具有高致病力，可在幾天內(nèi)殺死所有螯蝦；兩種As菌株致病力較小，部分受感染螯蝦未出現(xiàn)死亡；試驗證實兩種As 菌株之間的毒力存在差異；另外還發(fā)現(xiàn)部分奧斯塔歐洲螯蝦對螯蝦瘟抵抗力有所增強，尤其對As 菌株。Makkonen 等[12]報告不同A.astaci基因型之間的毒力存在明顯差異：PsI 菌株在人工感染的奧斯塔歐洲螯蝦種群中可引起快速發(fā)病和死亡，而As 菌株的毒力存在差異，表現(xiàn)出更多可變性，如部分奧斯塔歐洲螯蝦種群對一些As菌株表現(xiàn)出明顯增加的抗性。

除了常見的A.astaci，引起螯蝦疫病的病原可能還包括其他致病的絲囊霉。Viljamaa-Dirks 等[13]報告了一種導致奧斯塔歐洲螯蝦暴發(fā)螯蝦瘟的新病原，暫定為芬尼克絲囊霉（Aphanomyces fennicussp.novum）。該病原與A.astaci非常相似，采用OIE 推薦的特異性檢測A.astaciITS基因的普通PCR 和qPCR 檢測，結(jié)果均呈陽性，但通過有關(guān)菌絲結(jié)構(gòu)和厚壁孢子形成的形態(tài)學特征，以及使用RAPD-PCR 法、微衛(wèi)星基因分型法、病原毒力檢測和基于ITS測序的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法，可以將該菌與A.astaci區(qū)分。Makkonen 等[14]從美國加州的信號螯蝦中分離了35 個A.astaci菌株和2 個新的絲囊霉屬菌株，發(fā)現(xiàn)其中A.astaciB 群菌株對奧斯塔歐洲螯蝦有很強的毒力；一個新菌株與在中歐水蚤中發(fā)現(xiàn)的絲囊霉高度相似，另一個新菌株與芬蘭的奧斯塔歐洲螯蝦中分離的變形藻絲囊霉或芬尼克絲囊霉分離株（序列相似性為93%）關(guān)系最密切，兩種新菌株都不會引起螯蝦死亡。絲囊霉屬物種的多樣性尚未完全被闡明，因為同一地點采集的少量螯蝦中發(fā)現(xiàn)了多種絲囊霉屬物種。

1.2 病原生物學特性

A.astaci生活史簡單。營養(yǎng)菌絲侵入宿主組織后產(chǎn)生基質(zhì)外孢子囊，孢子囊釋放變形蟲樣的初生孢子，隨后釋放出雙鞭毛游動孢子。游動孢子在水中游動，當遇到易感寄主時，就附著并發(fā)芽，產(chǎn)生侵入性營養(yǎng)菌絲。游動孢子對螯蝦角質(zhì)層具有趨化性。

不同A.astaci菌株的最佳生長溫度有所不同。在實驗室條件下，菌絲體在4.0～29.5 ℃均可生長。但大多數(shù)菌株的適宜生長溫度小于18 ℃，水溫高于21 ℃時生長緩慢。種群間傳播速度取決于水溫等多個因素?，F(xiàn)場觀察表明：在4～16 ℃時，較高的水溫會加快傳播速度；在低水溫時，傳播曲線增長非常緩慢，宿主發(fā)生死亡的時間可能長達數(shù)月。從克氏原螯蝦分離的菌株在較高水溫下生長得更好[10]。

A.astaci孢子形成對于疾病的傳播至關(guān)重要。Strand 等[15]報告了隱性攜帶者螯蝦釋放A.astaci孢子的動態(tài)過程：在沒有死亡和脫殼的情況下，隱性感染的螯蝦持續(xù)釋放中等數(shù)量的孢子（每只螯蝦約2 700 個孢子/周）；垂死的螯蝦在死亡前1 周釋放的孢子數(shù)量顯著增加，可能在虛弱個體中出現(xiàn)了螯蝦瘟病癥；水溫18 ℃時產(chǎn)生的孢子明顯比4 ℃多，但水溫從17 ℃上升到23 ℃時，水溫越高，釋放的孢子數(shù)量越少。綜上表明不同階段的隱性感染螯蝦都會對高度敏感的螯蝦物種構(gòu)成持續(xù)感染風險。Svoboda 等[16]研究表明，受感染的叉肢螯蝦在蛻皮期間，A.astaci孢子數(shù)量顯著增加。Makkonen 等[17]報告了PsI 菌株感染奧斯塔歐洲螯蝦后釋放A.astaci孢子的動態(tài)過程：死亡前2 d 到死后12 h 的孢子數(shù)為500～2 000 個/L，死后24 h孢子數(shù)顯著增加至12 000 個/L，2 d 后達到峰值約65 000 個/L，死后第4 天開始下降，直到低于死亡前水平。該結(jié)果證實垂死和剛死亡的螯蝦可釋放出大量孢子，在死后1～3 d 內(nèi)逐漸達到峰值。螯蝦感染僅3 d 即出現(xiàn)急性死亡證實了PsI 基因型的致死潛力，而強大的孢子形成能力可能是PsI 基因型的關(guān)鍵毒力因素之一。

2 流行病學

2.1 地理分布

北美洲擁有全球最豐富的淡水螯蝦物種。螯蝦瘟被認為起源于北美，這是因為北美以外的國家引進北美螯蝦進行養(yǎng)殖、游釣或水族館觀賞，導致螯蝦瘟傳播，使本土螯蝦種群數(shù)量減少。目前A.astaci主要分布在北美和歐洲。1859 年首次在意大利發(fā)現(xiàn)歐洲本土螯蝦——白圓鉗螯蝦大規(guī)模死亡，標志著A.astaci開始在歐洲傳播。隨后，1874 年在法德邊境地區(qū)又暴發(fā)了幾次螯蝦瘟[18]。后來的幾十年，A.astaci病原體沿著多瑙河流域擴散，目前已遍布歐洲大部分地區(qū)。20 世紀60 年代西班牙首次暴發(fā)螯蝦瘟疫情，20 世紀80 年代該病進一步擴展到不列顛群島、土耳其、希臘和挪威[19]。

近年來歐洲不斷有暴發(fā)螯蝦瘟的報告。Martín-Torrijos 等[20]對西班牙2004 年以來發(fā)生的50 多起螯蝦瘟進行了分析，發(fā)現(xiàn)A.astaci已經(jīng)活躍了45年，克氏原螯蝦和信號螯蝦已成為A.astaci的保蟲宿主；北部地區(qū)主要為b 基因型，南部、中部和東部地區(qū)主要為d1 和d2 基因型。Filipová 等[18]報告法國信號螯蝦種群中A.astaci平均感染率約為20%，因信號螯蝦與本土的白圓鉗螯蝦有著相似的棲息地，可對其構(gòu)成嚴重威脅。其他一些非本土螯蝦物種——叉肢螯蝦、O.immunis和克氏原螯蝦中也檢測到A.astaci。Tilmans 等[21]首次報告了荷蘭的螯蝦瘟發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)6 種外來甲殼動物種群中，叉肢螯蝦和信號螯蝦為中等水平感染，中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和Orconectes cf.virilis中也檢出陽性，而克氏原螯蝦為零星感染，Procambarus cf.acutus中還未檢測到病原體，證明了單個區(qū)域內(nèi)潛在宿主之間A.astaci流行率存在顯著差異。Parvulescu 等[22]報告了羅馬尼亞多瑙河及其支流對本土格魯西東歐螯蝦和入侵的叉肢螯蝦分布的監(jiān)測結(jié)果：2009—2011 年叉肢螯蝦的相對密度隨著時間的推移穩(wěn)步增加，而本地格魯西東歐螯蝦的密度急劇下降，至少32%的入侵螯蝦和41%的本土螯蝦感染了A.astaci。Cammà 等[23]報告了意大利發(fā)現(xiàn)的第一起螯蝦瘟，從發(fā)病的白園鉗螯蝦中分離到A.astaci和A.repetans兩種病原。Caprioli 等[24]也報告了意大利白園鉗螯蝦種群中檢測到A.astaci感染。Svoboda 等[25]報告了格魯西東歐螯蝦種群感染A.astaci的情況：在20 世紀80年代，該種群因螯蝦瘟而急劇下降，盡管從那時起螯蝦瘟一直存在，但該地區(qū)的格魯西東歐螯蝦種群已經(jīng)有所恢復；34 只外觀健康的螯蝦中有5 只感染了A.astaci，表明歐洲本土螯蝦已經(jīng)可以與A.astaci共存。Mruga?a 等[26]最近在波斯尼亞和黑塞哥維那觀察到由A.astaci引起的螯蝦死亡，僅發(fā)生在歐洲螯蝦中，表明該病原對這個地區(qū)的本地物種構(gòu)成威脅。Kozubíková 等[27]調(diào)查了捷克的信號螯蝦和叉肢螯蝦的A.astaci感染率，發(fā)現(xiàn)信號螯蝦感染率很低，而叉肢螯蝦感染率很高，并且病原體流行與水體類型之間存在明顯的關(guān)系，流動水體中的感染率通常超過50%，而孤立靜止的水體感染率通常較低。

在亞洲，Hsieh 等[28]首次報告了我國臺灣地區(qū)養(yǎng)殖的紅螯螯蝦自然感染A.astaci。2013 年底，臺灣5 個螯蝦養(yǎng)殖場暴發(fā)未知疾病，累積死亡率為中至高。通過PCR 分析檢測到A.astaci，其與歐洲相關(guān)菌株序列相似性為99.8%～100%，原位雜交試驗進一步證實病原體為A.astaci。日本1927 年從北美引進克氏原螯蝦和信號螯蝦，導致本土的日本螯蝦（Cambaroides japonicus）種群數(shù)量下降。Martín-Torrijos 等[29]報告了日本首例本土的日本螯蝦暴發(fā)螯蝦瘟，通過組織學和分子生物學方法對病原進行了研究，對線粒體核糖體rnnS和rnnL的分析表明，病原是來自克氏原螯蝦的一種新的A.astacid3 菌株。

目前尚無A.astaci在非洲、中美洲、南美洲等地區(qū)分布的記錄。澳大利亞和新西蘭尚未發(fā)現(xiàn)螯蝦瘟[29]。但A.astaci的實際分布可能比報告的廣泛得多。

2.2 易感宿主

所有種類和不同生命階段的螯蝦均對A.astaci易感，但感染率存在物種差異。北美螯蝦易感，但其具有較強的抵抗力，信號螯蝦、克氏原螯蝦等感染后通常不發(fā)病。歐洲螯蝦包括奧斯塔歐洲螯蝦、白園鉗螯蝦、石螯蝦、格魯西東歐螯蝦等都高度易感，可以導致其天然種群急劇下降，瀕臨滅絕[4]。

不同菌株對不同螯蝦的致病力可能有所不同，具有一定的宿主特異性。Jussila 等[30]對分離自健康石螯蝦的As 菌株與分離自奧斯塔歐洲螯蝦、信號螯蝦和石螯蝦的PsI 菌株的毒性進行了比較，發(fā)現(xiàn)PsI 菌株感染奧斯塔歐洲螯蝦和石螯蝦的死亡率均為100%，而信號螯蝦的死亡率僅為25%；As 菌株對奧斯塔歐洲螯蝦致病，但對信號螯蝦和石螯蝦不致病，表明對某種歐洲本土螯蝦呈隱形感染的A.astaci菌株可能對其他歐洲本土螯蝦有害。Kusar 等[31]報告斯洛文尼亞本土石螯蝦和非本土的信號螯蝦的感染率分別為55.6%和11.4%，而且受感染的石螯蝦種群與非本土螯蝦攜帶者并沒有接觸，卻連續(xù)兩年持續(xù)感染A.astaci。

Martín-Torrijos 等[4]用北美克氏原螯蝦中分離的AP03 基因型A.astaci菌株對歐洲本地螯蝦白圓鉗螯蝦進行攻毒試驗，發(fā)現(xiàn)盡管大多數(shù)螯蝦表現(xiàn)出高死亡率，但種群之間存在顯著差異，其中部分種群對螯蝦瘟表現(xiàn)出高抗性，在4 個月的監(jiān)測期內(nèi)表現(xiàn)出100%的存活率；組織學分析顯示，組織中存在高度免疫反應，即菌絲 的包裹和黑化，類似于在北美抗性螯蝦物種中發(fā)現(xiàn)的反應。

除了螯蝦以外，中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）也被證明對A.astaci易感。Svoboda 等[32]報告了兩種淡水蝦——黃金米蝦（Neocaridina davidi）和戴氏沼蝦（Macrobrachium dayanum）人工感染A.astaci試驗的結(jié)果：感染后兩種蝦均未出現(xiàn)死亡，在黃金米蝦組織中未發(fā)現(xiàn)A.astaci數(shù)量增加，但在戴氏沼蝦的組織中發(fā)現(xiàn)A.astaci數(shù)量的增長，表明A.astaci可能在該物種的組織中生長。

2.3 傳播方式和途徑

A.astaci主要通過受感染的螯蝦或受污染的水以及漁網(wǎng)、漁具、靴子等受污染設(shè)備的轉(zhuǎn)運進行傳播。受感染螯蝦釋放出游動孢子，游動孢子在水中游動，對螯蝦具有明顯的趨化性，再附著未感染螯蝦。人為活動造成棲息地改變打破了自然傳播的屏障，使攜帶病原體的入侵物種進一步擴大范圍；氣候變化改變了環(huán)境條件，進一步使一些入侵物種受益，并有利于疾病的發(fā)展和傳播。歐洲20 世紀主要通過引進的北美螯蝦野外放養(yǎng)或從養(yǎng)殖場逃脫而傳播A.astaci，現(xiàn)在主要通過北美螯蝦種群的擴散以及私人將北美螯蝦放歸野外等途徑傳播。

有關(guān)A.astaci在不同種類螯蝦之間的傳播研究較少。James 等[33]在英國一條河流的孤立水域和開放水域中監(jiān)測信號螯蝦和強健螯蝦（Orconectes virilis）中的A.astaci，發(fā)現(xiàn)兩個水域的信號螯蝦都檢測到A.astaci，但強健螯蝦僅在開放水域發(fā)現(xiàn)感染A.astaci，而且強健螯蝦感染的A.astaci基因型與信號螯蝦的菌株相關(guān)，可能來自受感染的信號螯蝦。Svoboda 等[34]研究表明，叉肢螯蝦可以在蛻皮期間將A.astaci傳播給易感的奧斯塔歐洲螯蝦，奧斯塔歐洲螯蝦感染率明顯高于美洲螯蝦。

A.astaci還可以通過魚類的消化系統(tǒng)傳播，但通過哺乳動物和鳥類消化道傳播的可能性很小。Svoboda 等[35]在歐洲水獺和美洲水貂的試驗中發(fā)現(xiàn)，通過食肉溫血動物的消化道傳播A.astaci可能性很小，A.astaci對哺乳類的體溫敏感，但不同菌株對高溫的抗性存在差異，其中E、D 群比A、B群菌株更敏感。

2.4 發(fā)病率和死亡率

原產(chǎn)于北美大陸的螯蝦對A.astaci具有較強的抗性，可隱性感染而不發(fā)病，成為病原體的終身攜帶者。不同地區(qū)的北美螯蝦A.astaci感染率相差很大，感染率介于0～100%。芬蘭的最新報告表明，冷水環(huán)境下A.astaci可在奧斯塔歐洲螯蝦種群中以低感染率長期流行。不過，Thomas 等[36]發(fā)現(xiàn)：北美螯蝦也會死于螯蝦瘟，孵化4 周后的幼年信號螯蝦感染后死亡率很高，高水平感染的成年信號螯蝦也表現(xiàn)出行為異常，如很少離開水、逃避反應遲緩等。

歐洲螯蝦暴露于A.astaci的孢子中通常會導致感染并最終死亡，早期感染率可能較低，但可能導致相鄰種群100%死亡。其傳播速度與寄主種類、年齡、種群密度以及水溫等因素相關(guān)，傳播時間變化很大，可能從幾周到幾個月不等。珍稀的奧斯塔歐洲螯蝦種群被A.astaci感染數(shù)月后，不會出現(xiàn)明顯死亡，病原可在宿主種群中持續(xù)傳播幾年時間。

2.5 臨床癥狀

A.astaci最初感染外骨骼角質(zhì)層，隨后感染腹部和關(guān)節(jié)周圍的軟質(zhì)角質(zhì)層。高度敏感的歐洲螯蝦所有組織都可能被感染，而北美螯蝦感染通常局限于角質(zhì)層。

臨床癥狀與感染強度、水溫以及宿主種類等有關(guān)，差別很大。通常暴發(fā)的最初表現(xiàn)是，螯蝦出現(xiàn)大量死亡，或協(xié)調(diào)性不佳、身體不能翻轉(zhuǎn)等。感染性病灶可能肉眼可見，也可能無法辨別，常見表皮下肌肉局部變白或呈棕色。有時在受感染表皮中可以看到菌絲，菌絲會在表皮上形成細小的棕色痕跡。最典型的癥狀是，受感染或死亡個體的腹部和尾部胸腹側(cè)柔軟的角質(zhì)層、肛周區(qū)域的角質(zhì)層、甲殼和腹部之間的角質(zhì)層、步行足關(guān)節(jié)等部位出現(xiàn)黑色素斑點。這種黑色素斑點是宿主免疫反應的結(jié)果。對A.astaci具有抗性的螯蝦通過與A.astaci細胞壁相互作用，觸發(fā)其免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生廣泛反應，激活酚氧化酶原系統(tǒng)產(chǎn)生細胞毒性化合物和黑色素，以確保病原體包裹在角質(zhì)層中，防止其完全定殖于血腔。而一些對A.astaci敏感的螯蝦因無法阻止其血腔中的菌絲生長而發(fā)病死亡[4，37]。對于隱性感染的北美螯蝦，角質(zhì)層黑色化可能還有其他原因。

3 診斷技術(shù)

螯蝦瘟臨床癥狀的診斷價值十分有限，很多隱性感染的螯蝦不表現(xiàn)任何臨床癥狀。Alderman等[38]報告了A.astaci的IM 瓊脂培養(yǎng)方法，并描述了菌落、營養(yǎng)菌絲、孢子囊、初級孢子、游動孢子等各個發(fā)育階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Viljamaa-Dirks 等[39]對A.astaci的分離方法進行了改進。但這種分離方法可能要求較高，不僅要求送達實驗室的被檢樣本處于良好狀態(tài)，而且要求檢驗員具有一定的真菌分離經(jīng)驗。目前監(jiān)測螯蝦瘟最合適的方法是PCR 方法。使用普通PCR 或?qū)崟r熒光PCR 擴增出預期的PCR 產(chǎn)物即可確診，通過基因測序可以進一步確認基因型。

3.1 普通PCR 方法

已有幾種具有不同靈敏度和特異性的PCR 檢測方法。這些方法的敏感性可能與樣品質(zhì)量有關(guān)，對具有明顯臨床癥狀、瀕死或剛死的螯蝦樣品檢測敏感性較高。多數(shù)PCR 方法具有良好的特異性，但對于新發(fā)現(xiàn)的菌株，應通過測序進一步確認。

Oidtmann 等[40]報告了 基 于A.astaci5.8S rDNA 基因ITS序列的PCR 方法。對27 個A.astaci菌株、20 個卵菌綱非A.astaci菌株以及5種真菌的測試證明，該引物具有良好的特異性。奧斯塔歐洲螯蝦感染A.astaci后，2 d 即可檢測出陽性。Tuffs 等[41]比較了3 種檢測A.astaci的PCR方法的靈敏度和特異性，發(fā)現(xiàn)所有方法都具有良好的靈敏度和特異性，檢測限約為10 個游動孢子。Casabella-Herrero 等[42]驗證了兩種基于A.astaci線粒體核糖體rnnS和rnnL亞基的PCR 方法，并對包括其他卵菌屬物種和芬尼克絲囊霉在內(nèi)的76 個分離株進行了特異性測試，發(fā)現(xiàn)依據(jù)rnnS區(qū)域的序列分析足以鑒定A.astaci，但僅僅依據(jù)rnnL序列可能難以準確區(qū)分A.astaci和其他卵菌科的物種。Makkonen 等[5]開發(fā)了兩組引物來擴增核糖體rnnS和rnnL亞基的mtDNA，以研究A.astaci的多樣性。該方法可以直接從受感染的螯蝦組織中檢測和鑒定A.astaci基因型，在27 個A.astaci菌株中確認了4 個群（A、B、D、E）和5 個基因型（a、b、d1、d2、e）。

3.2 實時PCR 技術(shù)

3.3 菌株基因型分型技術(shù)

確定菌株基因型是對螯蝦瘟進行分子流行病學研究的重要工具。Viljamaa-Dirks 等[47]應用RAPD-PCR 技術(shù)，對芬蘭的奧斯塔歐洲螯蝦分離的A.astaci進行基因分型，發(fā)現(xiàn)43 株屬于As 基因型，26 株屬于Ps1 基因型；大多數(shù)Ps1 菌株（83%）與螯蝦瘟急性死亡有關(guān)，只有33%的As菌株與疫病暴發(fā)相關(guān)；As 菌株比Ps1 菌株更常見，在一些水體中可連續(xù)幾年分離到As 菌株。

通常RAPD-PCR 技術(shù)需要對菌株進行純培養(yǎng)。Minardi 等[48]通過設(shè)計特異性引物擴增不同基因型獨有的基因組序列，可以直接對臨床螯蝦樣本中的A.astaci菌株進行基因分型。采用該方法對各種臨床樣本以及培養(yǎng)物進行鑒定，成功區(qū)分了A、B、D 和 E群，C群還需要對PCR產(chǎn)物進行測序來確認。Caprioli 等[49]使用微衛(wèi)星標記法，對2009—2016年引起意大利7 起螯蝦瘟的菌株進行基因分型，確定有A、B、D 共3 個群，表明即使在相對較小的區(qū)域內(nèi)也可能存在多種基因型。A 群不僅在發(fā)生螯蝦瘟時被檢測到，而且在進口供人類食用的外觀健康的格魯西東歐螯蝦中也呈陽性。Grandjean等[50]應用微衛(wèi)星標記技術(shù)，對宿主組織樣本中的A.astaci進行基因分型，證明不同的北美螯蝦宿主攜帶多種基因型，包括最初在19 世紀引入歐洲導致螯蝦瘟的基因型。該技術(shù)可以直接對純培養(yǎng)樣品和混合基因組樣本中的病原體進行基因分型。James 等[45]使用微衛(wèi)星病原體基因分型技術(shù)，證實至少一個英國信號螯蝦種群感染了已知具有毒性的B 群A.astaci。

Minardi 等[51]結(jié)合生物信息學和分子生物學技術(shù)開發(fā)了針對線粒體DNA 的A.astaci基因分型分子標記，提高了基因分型的靈敏度；利用這些技術(shù)對不同臨床樣品進行驗證，證明在英國水域存在A 群和B 群A.astaci。

3.4 環(huán)境DNA 監(jiān)測技術(shù)

環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）技術(shù)是一種直接從水、土壤、空氣或生物體殘留物等環(huán)境樣本中提取DNA 進行物種調(diào)查的方法，是一種非致死性、經(jīng)濟實用的物種監(jiān)測技術(shù)。通過分析水樣中的eDNA，可以確定水生環(huán)境中是否存在入侵的、瀕?；蛏虡I(yè)上重要的物種或病原，盡早發(fā)現(xiàn)外來物種或有害生物入侵，保護本土物種和生態(tài)。

物種特異性eDNA 引物首先被用來檢測和區(qū)分物種。eDNA 已經(jīng)成功證明入侵螯蝦存在于日本安康湖附近的幾乎所有小溪中，表明eDNA 分析是一種有效的、高度敏感的評估水生生物分布方法[29]。Troth 等[52]基于eDNA 分析的調(diào)查方法來評估白圓鉗螯蝦、螯蝦瘟病原和信號螯蝦之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)該方法比傳統(tǒng)方法具有更高的特異性和靈敏度。不過，基于eDNA 對物種生物量進行定量分析的方法還不太可靠。Robinson 等[53]報告了同時檢測信號螯蝦、白圓鉗螯蝦和螯蝦瘟病原eDNA 的實時PCR 方法，對來自威爾士和英格蘭水樣和現(xiàn)場樣品的eDNA 進行直接檢測，顯示信號螯蝦、本地白圓鉗螯蝦以及螯蝦瘟病原均為陽性。

雖然eDNA 方法簡便易行，但需要從大量的水中進行分離濃縮，而且DNA 很容易降解而影響檢測結(jié)果。Pavi? 等[1]采用微生物生物膜方法提取螯蝦表皮中的DNA，可以檢測螯蝦中的A.astaci，無需進行致死性取樣，可以替代基于eDNA 的監(jiān)測方法；用PCR 和qPCR 對該方法進行驗證，結(jié)果與傳統(tǒng)的致死取樣方法一致。

Agersnap 等[54]報告了天然水體中監(jiān)測奧斯塔歐洲螯蝦、信號螯蝦和格魯西東歐螯蝦的方法，建立了基于線粒體細胞色素氧化酶1 的3 種螯蝦特異性檢測和定量PCR 分析，包括對2 個格魯西東歐螯蝦進化支的單獨分析。通過兩種方法檢測，確定檢測限均為5 拷貝，定量限分別為 5 和10 拷貝，并在已知的天然淡水生態(tài)系統(tǒng)中檢測到所有3 個物種的螯蝦種群。

4 小結(jié)

螯蝦瘟已經(jīng)對部分歐洲和亞洲國家的本土螯蝦和養(yǎng)殖螯蝦種群帶來巨大威脅。雖然有關(guān)螯蝦瘟的病原研究國外較多，但變形藻絲囊霉菌株和基因型較多，因而給病原檢測和鑒定帶來一定困難。目前尚無有效的治療藥物和方法可以控制該病對受感染養(yǎng)殖場的影響。但限制疫區(qū)內(nèi)的螯蝦轉(zhuǎn)運可以在一定程度上控制該病的傳播。養(yǎng)殖場必須采取嚴格的生物安全措施，減少病原通過設(shè)備、車輛或人員傳播。另外，要規(guī)范野外放生行為，禁止在有易感種群的野外放生各種螯蝦。

我國除臺灣以外，尚無針對螯蝦瘟的研究報告。我國大陸地區(qū)養(yǎng)殖小龍蝦規(guī)模大、分布廣，雖然至今尚無螯蝦瘟發(fā)生的報告，但正不斷從境外引進螯蝦進行種質(zhì)資源改良或觀賞。由于所有螯蝦都對螯蝦瘟易感，因此存在螯蝦瘟通過直接或間接的蝦苗貿(mào)易從疫區(qū)傳入大陸地區(qū)的巨大風險；加之，我國大陸地區(qū)養(yǎng)殖螯蝦疫情十分復雜，而基層又缺乏有效的病原診斷技術(shù)，使得很多傳染病病原需要深入研究。為有效監(jiān)控螯蝦瘟在我國的傳播，有關(guān)部門需在小龍蝦養(yǎng)殖區(qū)開展流行病學調(diào)查，并實施螯蝦瘟監(jiān)測計劃，同時需加強對進境螯蝦及其產(chǎn)品的嚴格檢疫。