• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分型方法研究進展

    2021-03-28 01:47:36趙建平
    中國感染與化療雜志 2021年2期
    關鍵詞:葡菌噬菌體流行病學

    武 杰,趙建平

    金黃色葡萄球菌(金葡菌)是革蘭陽性球菌,在一般人群中的攜帶率為25%~50%,但在某些情況下也可成為致病菌,尤其是耐甲氧西林金葡菌(MRSA)已經(jīng)成為了醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染重要病原之一[1]。由于抗生素的廣泛使用,MRSA不僅對β內酰胺類耐藥,對其他臨床常用抗生素敏感率也逐漸降低。在歐洲,金葡菌中MRSA的檢出率約為29.9%[2]。在中國,根據(jù)2019 年CHINET 三級醫(yī)院細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù),臨床分離的革蘭陽性菌中最多的是金葡菌,而在金葡菌中MRSA的檢出率為31.4%,并且相比于甲氧西林敏感菌株,MRSA對大環(huán)內酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率均較高[3]。

    為此,近年一些臨床實驗室開展多種MRSA的分型研究以了解MRSA分布、耐藥性和系統(tǒng)發(fā)育情況,為進一步預防和控制MRSA感染提供理論依據(jù)。MRSA的分型方法多種多樣,傳統(tǒng)的有噬菌體分型,而新興的分型方法大多基于基因的多態(tài)性運用分子生物學的方法,常用的分型方法有噬菌體開放閱讀框分型法(phage open-reading frame typing,POT)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型、葡萄球菌染色體盒(SCC)mec(staphylococcal cassette chromosomemec,SCCmec)分型、輔助基因調節(jié)因子(accessory gene regulator,agr)分型、多位點序列分型(MLST)、葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,spa)分型、DNA微陣列分型[4-5]等。本文對國內外一些主要的MRSA分型方法進行綜述,旨在為MRSA感染的分析和流行病學調查方法提供思路。

    1 噬菌體分型

    由于不同細菌感染不同噬菌體的能力不同,當金葡菌受到一系列噬菌體的攻擊時,根據(jù)攻擊的結果,即細菌是否被噬菌體群殺死,可以確定細菌的噬菌體類型。國際公認的23個噬菌體(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和其他噬菌體)的基本組合可用于金葡菌的噬菌體分型。通常將23種噬菌體(RTD濃度)分別滴一滴于已培養(yǎng)好的涂布了MRSA的分型瓊脂平板上,過夜培養(yǎng)后觀察結果,根據(jù)溶菌結果判定分型情況。在最初進行MRSA的流行病學研究時,噬菌體分型在分析已知流行菌株中有一定價值; 但是其分型結果重復性差、結果分析存在主觀性以及較多MRSA菌株不能分型[6-7],現(xiàn)在國內有關MRSA分型的報道中已較少使用該方法。

    2 POT

    為了克服噬菌體分型不便于實驗室間比較等缺點,2006年Suzuki等[8]報道了一種基于PCR的快速MRSA菌株分型新方法,即POT,其擴增片段為MRSA中噬菌體基因組的開放閱讀框。Kawamura等[9]分別使用POT和PFGE對分離自醫(yī)院內的44株MRSA進行分型,表明兩種分型方法結果一致,均有效地鑒別出了12次MRSA感染暴發(fā)中的11次,鑒定成功率為91.7%,可見POT法是調查醫(yī)院MRSA感染暴發(fā)的一種有效的流行病學工具。但是近年使用POT對MRSA分型的報道仍然很少,可能與該方法的不穩(wěn)定性和重復性差有關。

    3 PFGE分型

    PFGE是一種有效的基因分型方法,于1984年Schwarz和Cantor首次提出,由于其分型率高、分辨率高、重復性好等優(yōu)點曾被認為是MRSA分型的“金標準”[10]。在一項關于MRSA引起的非醫(yī)院環(huán)境感染的薈萃分析中,通過PFGE的分型表明MRSA菌株來自醫(yī)院和社區(qū),且非醫(yī)院環(huán)境中MRSA感染的比例總體上很高[11]。PFGE分型在MRSA相關性分析、感染源追蹤和感染控制等方面作用明顯。對患者、醫(yī)護人員和病房環(huán)境中分離細菌的PFGE帶型進行分析,有助于院感部門確定感染源和傳播途徑,采取有效措施根除傳染源,阻止傳播,極大降低發(fā)病率和死亡率[12-13]。在一項分析來自中國東南地區(qū)某三級醫(yī)院不同病區(qū)和科室醫(yī)護人員的常規(guī)拭子以及MRSA分離菌的PFGE分型結果的報道中,由于從外科病房分離的2株MRSA具有相同的PFGE模式,表明MRSA可能在外科醫(yī)護人員之間傳播,提示醫(yī)院應有效控制可能存在的交叉感染[14]。

    然而,這項技術操作耗時長、技術要求高、試劑成本大、需要專業(yè)的設備,對于差異很小的某些菌株難以區(qū)分,且PFGE帶型可表示菌株克隆關系的遠近而不表示真正的系統(tǒng)發(fā)育過程。此外,凝膠制備和電泳條件(如溫度、濕度、設備等)的細微改變也會影響最終的分型結果,使得不同實驗室間的結果比較存在差異。

    4 SCCmec分型

    遺傳元件SCCmec是MRSA的耐藥決定基因所在位點。SCCmec主要由mec基因復合物、ccr基因復合物和J區(qū)(連接區(qū),分為J1、J2、J3)構成。mec基因復合物以mec基因為主,共有A、B、C、D、E 5種mec基因復合物類型,其中最重要的是mecA基因,可編碼對大多數(shù)β內酰胺類抗菌藥物結合力較低的一種新的青霉素結合蛋白(PBP)2a,從而對此類藥物耐藥。ccr基因復合物中起主要作用的是盒式染色體重組酶(ccr)基因,ccr基因被分為ccrA、ccrB、ccrC三種類型[15],可以對葡萄球菌染色體上的SCCmec切除和/或整合。根據(jù)mec基因復合物、ccr基因復合物和J區(qū)的各自不同類型,可將SCCmec分為各種類型(包括亞類),過去國際公認的有Ⅰ型~ⅩⅢ型,而最近又新發(fā)現(xiàn)了SCCmecⅩⅣ型[16-17]。研究表明,中國MRSA分離株中,SCCmecⅢ型最多,其次為Ⅳa型、Ⅱ型、Ⅰ型等[18]。由于SCCmecⅠ~Ⅲ型主要見于醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA),而SCCmecⅣ、Ⅴ型主要為社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA),此方法可能對鑒別醫(yī)院和社區(qū)感染,了解當前出現(xiàn)的MRSA暴發(fā)的流行病學起到重要作用。

    在方法學上,SCCmec分型主要通過多重PCR,即同一反應體系中加入多對針對不同SCCmec型所設計的引物,最終對目的DNA進行擴增。2002年Oliveira等[19]使用多重PCR法初步快速鑒定MRSA菌株SCCmecⅠ~Ⅳ型。2005年Zhang等[20]開發(fā)了一種新的多重PCR方法,可分析MRSA菌株中SCCmecⅠ~Ⅴ型及Ⅳ型的4種亞型Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd,他們提出并驗證了新的8對引物對SCCmec(包括亞型)分類的可行性和實用性。2007年Boye等[21]設計4對引物就可將MRSA菌株分為SCCmecⅠ~Ⅴ型的方法,此方法簡便、節(jié)約成本,但未能對亞型分類。鑒于先前的研究,2013年Mcclure-Warnier等[22]設計并發(fā)現(xiàn)了一種簡單的多重PCR方法,用于快速篩選主要的SCCmec類型,主要為Ⅰ~Ⅴ型及Ⅵ型和Ⅷ型,其中Ⅳ型最多可分為A~F亞型。遺憾的是,目前的多重PCR法主要用于SCCmecⅠ~Ⅴ型分析,不僅需要開發(fā)新的PCR對Ⅵ~ⅩⅢ型分型,更需要一種方法能將所有SCCmec類型及亞型進行準確分析。不僅如此,不斷新發(fā)現(xiàn)的SCCmec類型將對多重PCR法要求更高。

    5 agr分型

    agr是金葡菌的重要調控成分,參與調控不同獨立基因的表達和控制多種毒力因子的產(chǎn)生。agr是基因組中的一個多態(tài)性位點,agr高變區(qū)包括agrB基因C末端的三分之二、整個agrD基因以及agrC基因N末端的一半。agr可分別通過P2、P3啟動子轉錄RNAⅡ和RNA Ⅲ。RNAⅡ促進agrB、agrC、agrD、agrA基因表達,其產(chǎn)物膜蛋白AgrB將AgrD即前體自動誘導肽(AIP)轉化為成熟的AIP并分泌到胞外,當AIP濃度到達臨界閾值時,AIP與膜結合受體組氨酸激酶AgrC結合并使AgrA磷酸化,活化后的AgrA又可促進RNAⅡ和RNAⅢ的轉錄[23]。由于不同MRSA菌株agr具有多態(tài)性,其編碼產(chǎn)生的AIP及相應受體氨基酸序列也具有多態(tài)性,所以金葡菌分為4個agr型(Ⅰ~Ⅳ型)[23-24]。RNA Ⅲ可上調多種毒力因子如溶血素、腸毒素等的表達和下調細胞表面蛋白如纖維連接蛋白等的表達,以抵抗宿主防御和促進組織侵襲[24]。Francois等[25]報道了一種多重實時定量PCR可快速地確認agr類型,并且由于試劑成本較低,也適用于臨床實驗室和流行病學檢測。Abimannan等[26]對印度南部分離自醫(yī)院和社區(qū)的MRSA菌株進行分型,發(fā)現(xiàn)主要的agr類型為agrⅡ型,其次是agrⅠ、agrⅢ和agrⅣ型。但agr分型具有地區(qū)差異性,Goudarzi等[27]對伊朗德黑蘭地區(qū)106株MRSA進行分型發(fā)現(xiàn)agrⅠ型菌株是最多的,其次為agrⅡ、agrⅢ,而未發(fā)現(xiàn)agrⅣ,這與國內賈珉等[28]的研究結果一致。有研究表明大部分MRSA菌株的agr類型與特定的臨床感染有關。例如,大多數(shù)引起經(jīng)期中毒性休克綜合征的MRSA菌株屬于agrⅢ型;引起葡萄球菌燙傷樣皮膚綜合征(SSSS)、大皰性膿皰病的MRSA多為agrⅣ型[29]。大多數(shù)萬古霉素耐藥的MRSA菌株屬于agrⅡ型[30],而從患有心內膜炎的患者身上分離到的MRSA菌株主要與agrⅠ型相關[31]。agr分型具有可靠性高、重復性好、特異性強等特點,MRSA菌株的agr分型有助于了解其遺傳背景特征及致病性的特點,進而對預防MRSA感染和臨床用藥提供指導,并廣泛應用于MRSA的流行病學調查和監(jiān)測。但是agr分型更適用于攜帶毒力基因的菌株,并且不同地區(qū)agr分型結果難以統(tǒng)一,因此需要參考其他分型方法綜合分析。

    6 MLST

    MLST是在多位點酶電泳(multilocus enzyme eiectrophoresis,MLEE)分型技術的基礎上發(fā)展而來,MLEE是從細菌中提取出蛋白質進行凝膠電泳,根據(jù)蛋白質條帶之間的相似程度對細菌分型,而MLST對MRSA菌株的7個管家基因擴增測序,極大地改善了MLEE分型的精確性[32]。這7個管家基因分別是arcC(編碼氨基甲酸激酶,456 bp)、aroE(編碼莽草酸脫氫酶,456 bp)、glpF(編碼甘油激酶,465 bp)、gmk(編碼鳥苷酸激酶,429 bp)、pta(編碼磷酸乙酰轉移酶,474 bp)、tpi(編碼磷酸三酯異構酶,402 bp)和yqiL(編碼乙酰輔酶A,516 bp)。由于等位基因的多樣性,不同來源的MRSA菌株其管家基因有著不同的核酸序列,對7種管家基因擴增測序,并將結果提交到MLST數(shù)據(jù)庫(http://www.mlst.net)對比分析,最后得到菌株MLST結果,并賦予每個菌株數(shù)字形式的序列類型(ST)。對我國海南省分離自臨床的金葡菌的分子特征分析顯示,ST398、ST188和ST45是金葡菌分離株中的主要類型,其中ST398和ST45分別是甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)和MRSA分離株中的主要克隆[33]。然而,對意大利南部一家養(yǎng)殖場的豬和工作人員MRSA分離株進行MLST測定,結果顯示ST398是家畜相關MRSA(livestock associated MRSA,LA-MRSA)其主要類型[34]??梢?,MRSA菌株的ST流行類型的多樣性與地區(qū)、宿主有關,并且HA-MRSA、CA-MRSA和LA-MRSA中的優(yōu)勢ST型有較大差異,提示MRSA感染的來源和潛在的傳播路徑。

    MLST分型精確性好、可重復性強。對于新發(fā)現(xiàn)的ST型,上傳到MLST網(wǎng)站后其結果也便于不同實驗室間進行比較確認,使這項技術成為一個全球非常有用的流行病學分析工具。但是這種方法與MRSA的毒力基因沒有任何關系,MRSA的致病性不能被清楚認知。MLST的另一缺點是成本高且操作復雜。

    7 spa分型

    spa基因具有多態(tài)性,編碼特異性蛋白A,在金葡菌中高度保守,并提供合適的短重復序列區(qū)域作為單基因座序列分型的靶點,即spa分型。這是一種基于DNA序列的分型方法,專門用于金葡菌的鑒定,spa基因經(jīng)PCR擴增后進行序列測定,即可獲得分型。spa基因長度約為2 150 bp,包含三個區(qū)域:Fc結合區(qū)、X區(qū)和C末端區(qū)域。X區(qū)域,也稱為重復區(qū)域,由數(shù)目不定的長度為21~27 bp(主要為24 bp)的重復序列組成。由于重復序列的數(shù)量、排列順序和缺失、插入等改變,該區(qū)域具有多態(tài)性[35],進而反映spa的多種類型。

    截止現(xiàn)在,Ridomspa服務器數(shù)據(jù)庫(http://www.spaserver.ridom.de)包含19 392種spa類型、802個重復序列和431 456個菌株,其數(shù)據(jù)來自全球143個國家及地區(qū),可以對測得的spa分型結果進行對比分析,并收錄新發(fā)現(xiàn)的spa類型。除了使用PCR方法外還可使用高分辨率熔解(highresolution melt,HRM)曲線分析spa基因分型,該方法也需要對spa基因擴增,然后升溫解鏈,根據(jù)與標準曲線對比進行分析,是一種可靠、經(jīng)濟且簡便的分型方法,可以用作流行病學研究[35-36]。

    spa分型穩(wěn)定性高、重復性好。Malachowa等[37]用59株醫(yī)源性金葡菌對PFGE、MLST、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復分析(MLVA)和spa分型四種分型方法進行了水平比較,結果表明spa分型更接近MLST,并且建議將多種分型方法結合起來可進一步研究MRSA菌株分型結果。

    與其他方法相比,spa分型具有成本效益高、操作方便、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。此外,spa分型穩(wěn)定,有一個標準化的國際命名法,可以整合到國際數(shù)據(jù)庫,使用spa分型有助于了解醫(yī)院和社區(qū)環(huán)境中MRSA的克隆多樣性及其傳播[38]。但是,spa分型只局限于spa基因X區(qū)域的突變,對于MRSA基因組其他部分的改變未能有效判別,甚至出現(xiàn)錯誤分型。研究表明[39],t008和t002是全球分布最廣的spa類型,t032是歐洲最普遍的spa類型,主要集中在英國和德國且該類型菌株大多是MRSA,t008是美國最流行的類型,而t030是我國的主要類型。

    8 DNA微陣列分型

    DNA微陣列,也稱DNA芯片或基因芯片,是一種利用有序的附著在固體表面的DNA探針對樣品DNA進行識別測定的新技術。探針可以是寡核苷酸或基因片段,當其與樣本DNA(通常用熒光素標記)雜交時,產(chǎn)生的信號被采集并通過檢測器分析,以檢測特定細菌物種中是否存在互補核苷酸序列。據(jù)報道,DNA微陣列可以共價固定大約與180多個金葡菌基因相關的300個特異性探針,這些基因可以是分型位點、毒素基因、微生物表面成分相關基因以及藥物抗性基因,因此通過基因芯片技術,對病原菌進行基因分型的同時,也可研究其毒力和耐藥性,擴大了MRSA研究范圍,為臨床防治MRSA感染提供更全面的指導意見[40-42]。雖然DNA微陣列分型準確度高、分析范圍廣,但是需要昂貴的儀器和繁瑣的操作步驟,并且無法檢測到微陣列中未包含的基因。該實驗耗時較長,需要將從細菌中提取的DNA擴增后才可用于雜交。

    9 總結與展望

    MRSA在世界各地蔓延,分型方法對于醫(yī)院感染控制和流行病學研究至關重要。目前,傳統(tǒng)的分型方法幾乎已被淘汰。除DNA微陣列分型(此方法應用較少)外,PFGE分型、SCCmec分型、agr分型、MLST和spa分型等是主流方法,但由于每種方法優(yōu)劣不同,現(xiàn)在多綜合運用多種方法,詳細分析各地區(qū)MRSA的流行類型和分子特征。除此之外,在PCR方法中還有擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)分型,隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分型以及極具潛力的更為精細的全基因組測序方法。在未來,MRSA分型方法將不斷創(chuàng)新,向分辨率更高、可重復性更強、分析速度更快、操作更簡便、信息化和自動化更完善的方向發(fā)展,能廣泛地應用于臨床實驗室,為預防和治療MRSA感染以及流行病學調查和追蹤提供全面、準確、及時的信息。

    猜你喜歡
    葡菌噬菌體流行病學
    不同富集培養(yǎng)方法對噬菌體PEf771的滴度影響
    羊細菌性腹瀉的流行病學、臨床表現(xiàn)、診斷與防治措施
    羊球蟲病的流行病學、臨床表現(xiàn)、診斷和防治措施
    高效裂解多重耐藥金黃色葡萄球菌的噬菌體分離及裂解酶的制備
    新型冠狀病毒及其流行病學特征認識
    血流感染和皮膚軟組織感染金黃色葡萄球菌耐藥特征及多位點序列分型
    一起疑似霉變蛋撻引起食物中毒的流行病學調查
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應用
    中國北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進展
    噬菌體治療鮑曼不動桿菌感染的綜述
    亚洲怡红院男人天堂| 日韩免费高清中文字幕av| 在线免费十八禁| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品国产av在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美精品专区久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产黄色免费在线视频| 九草在线视频观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久久大av| 日日撸夜夜添| 亚洲av福利一区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久久久性生活片| 成人鲁丝片一二三区免费| 成人二区视频| 久热久热在线精品观看| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品不卡视频一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产成人精品福利久久| 精华霜和精华液先用哪个| 久久影院123| 精品人妻熟女av久视频| 少妇的逼水好多| 男女啪啪激烈高潮av片| 搡老乐熟女国产| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产av国产精品国产| a级毛色黄片| 国产又色又爽无遮挡免| 男人舔奶头视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 美女主播在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| 观看免费一级毛片| 国产熟女欧美一区二区| 午夜激情久久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 免费看不卡的av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线a可以看的网站| 在线a可以看的网站| 亚洲电影在线观看av| 国产熟女欧美一区二区| 免费观看在线日韩| 久久精品人妻少妇| 蜜臀久久99精品久久宅男| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费看a级黄色片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| xxx大片免费视频| 激情 狠狠 欧美| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产人妻一区二区三区在| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 男女啪啪激烈高潮av片| av在线播放精品| 晚上一个人看的免费电影| 黄色一级大片看看| 色吧在线观看| av女优亚洲男人天堂| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲天堂av无毛| 偷拍熟女少妇极品色| 狂野欧美激情性bbbbbb| 高清视频免费观看一区二区| 久久久成人免费电影| 能在线免费看毛片的网站| 在线观看人妻少妇| 久久久午夜欧美精品| av在线天堂中文字幕| 韩国av在线不卡| 在线播放无遮挡| 国产真实伦视频高清在线观看| 嫩草影院新地址| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 一本色道久久久久久精品综合| 大香蕉97超碰在线| a级一级毛片免费在线观看| 22中文网久久字幕| 久久99热这里只频精品6学生| 香蕉精品网在线| 国产成人精品福利久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 老司机影院成人| av专区在线播放| 亚洲精品自拍成人| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 丝瓜视频免费看黄片| 色网站视频免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | www.av在线官网国产| 在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 成人美女网站在线观看视频| 91久久精品电影网| 欧美性感艳星| 97在线人人人人妻| 91久久精品电影网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 直男gayav资源| 亚洲电影在线观看av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品国产av成人精品| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品视频女| 日本爱情动作片www.在线观看| 99热这里只有精品一区| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美成人a在线观看| 观看免费一级毛片| 日韩欧美精品v在线| 亚洲国产精品成人综合色| av黄色大香蕉| freevideosex欧美| 男男h啪啪无遮挡| 丝袜喷水一区| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美zozozo另类| videos熟女内射| 边亲边吃奶的免费视频| 91久久精品国产一区二区成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品女同一区二区软件| 真实男女啪啪啪动态图| av播播在线观看一区| 69av精品久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲精品久久午夜乱码| 真实男女啪啪啪动态图| 深夜a级毛片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 99热这里只有是精品50| 国产精品偷伦视频观看了| 久久韩国三级中文字幕| 久热这里只有精品99| 成人黄色视频免费在线看| 美女内射精品一级片tv| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美日韩综合久久久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品456在线播放app| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕亚洲精品专区| 久久精品人妻少妇| 色播亚洲综合网| 成人美女网站在线观看视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜视频国产福利| 国产成人91sexporn| 下体分泌物呈黄色| 久久女婷五月综合色啪小说 | 精品久久久久久电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久综合国产亚洲精品| 国产探花在线观看一区二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 六月丁香七月| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 黄片wwwwww| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黑人高潮一二区| a级毛色黄片| 在线a可以看的网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩综合久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 色播亚洲综合网| 久久这里有精品视频免费| 少妇丰满av| 国产片特级美女逼逼视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产一区亚洲一区在线观看| 91精品国产九色| 欧美xxⅹ黑人| 国产成人a∨麻豆精品| 国产淫语在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 秋霞在线观看毛片| 1000部很黄的大片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 人妻 亚洲 视频| 看非洲黑人一级黄片| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲最大成人中文| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 两个人的视频大全免费| 97热精品久久久久久| 在线播放无遮挡| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产视频内射| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲,一卡二卡三卡| 成人欧美大片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲av欧美aⅴ国产| av卡一久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 插阴视频在线观看视频| www.av在线官网国产| 久久久久久国产a免费观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91久久精品电影网| 亚洲最大成人手机在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 18禁在线播放成人免费| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产黄频视频在线观看| 丝袜脚勾引网站| 久久女婷五月综合色啪小说 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜日本视频在线| 国产精品一区www在线观看| 看十八女毛片水多多多| 黄色怎么调成土黄色| 欧美97在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品伦人一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久久久九九精品影院| 一个人看的www免费观看视频| 国产高清国产精品国产三级 | 国产成人精品久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品人妻久久久久久| 黑人高潮一二区| 99热这里只有精品一区| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久久久精品精品| 秋霞伦理黄片| 大片电影免费在线观看免费| 中文字幕免费在线视频6| 男人舔奶头视频| 亚洲四区av| 色综合色国产| 欧美激情在线99| 中文资源天堂在线| 嫩草影院精品99| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲国产av新网站| 男人狂女人下面高潮的视频| av在线观看视频网站免费| 国产片特级美女逼逼视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 中国国产av一级| 国产淫语在线视频| 亚洲av福利一区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av免费高清在线观看| 伦理电影大哥的女人| 久久久精品欧美日韩精品| 国产色婷婷99| 亚洲精品乱久久久久久| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久精品国产自在天天线| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av国产av综合av卡| 色婷婷久久久亚洲欧美| av在线蜜桃| 观看美女的网站| 中文字幕制服av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线观看美女被高潮喷水网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日本欧美国产在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人国产麻豆网| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 成人特级av手机在线观看| 国产乱来视频区| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品国产亚洲av天美| 国产色婷婷99| 日本免费在线观看一区| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久久午夜欧美精品| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品第二区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产一级毛片在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产在视频线精品| 男插女下体视频免费在线播放| 伊人久久国产一区二区| 九九在线视频观看精品| 2018国产大陆天天弄谢| 99热全是精品| 搞女人的毛片| 少妇人妻 视频| 国产 精品1| 久久鲁丝午夜福利片| 五月玫瑰六月丁香| 热re99久久精品国产66热6| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 美女内射精品一级片tv| 午夜免费观看性视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜福利视频精品| 久久这里有精品视频免费| 亚洲美女视频黄频| 免费黄色在线免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 七月丁香在线播放| 免费黄频网站在线观看国产| 色吧在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 黑人高潮一二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩精品有码人妻一区| 少妇 在线观看| 国产av国产精品国产| 国产精品久久久久久久久免| 插逼视频在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| xxx大片免费视频| 国产乱来视频区| 午夜视频国产福利| 91久久精品电影网| 国产精品久久久久久精品电影| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产69精品久久久久777片| 一级爰片在线观看| 看十八女毛片水多多多| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产亚洲91精品色在线| 禁无遮挡网站| 国产精品不卡视频一区二区| 国产极品天堂在线| 毛片一级片免费看久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 中国国产av一级| 尾随美女入室| 欧美激情在线99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 少妇高潮的动态图| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美区成人在线视频| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲国产高清在线一区二区三| 2021少妇久久久久久久久久久| 在线天堂最新版资源| 高清欧美精品videossex| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久久色成人| 日韩av不卡免费在线播放| 久久人人爽人人片av| 国产黄频视频在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 日本wwww免费看| 亚洲图色成人| 日日撸夜夜添| 欧美潮喷喷水| 18禁在线播放成人免费| 五月开心婷婷网| 国产免费一区二区三区四区乱码| 高清午夜精品一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久精品夜色国产| 亚洲欧美精品专区久久| 内地一区二区视频在线| av免费在线看不卡| 黄色欧美视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久久久成人| 亚洲精品影视一区二区三区av| 在线天堂最新版资源| 久久久久网色| freevideosex欧美| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲av国产av综合av卡| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 插阴视频在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 两个人的视频大全免费| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲国产精品成人久久小说| 尾随美女入室| 99热国产这里只有精品6| 欧美成人a在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 国产熟女欧美一区二区| 日韩大片免费观看网站| 色视频www国产| 少妇高潮的动态图| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲在线观看片| 日韩av免费高清视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费观看无遮挡的男女| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品第二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日日啪夜夜爽| 国产av不卡久久| 波多野结衣巨乳人妻| 国产视频首页在线观看| 伦理电影大哥的女人| 婷婷色综合www| 日韩人妻高清精品专区| 欧美 日韩 精品 国产| 又爽又黄无遮挡网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久热这里只有精品99| 一级毛片久久久久久久久女| 国产男女超爽视频在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕亚洲精品专区| 黑人高潮一二区| 久久久欧美国产精品| 日本av手机在线免费观看| 黄色日韩在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 只有这里有精品99| 高清毛片免费看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲,欧美,日韩| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品aⅴ在线观看| a级毛色黄片| 亚洲av成人精品一二三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久久国产网址| 毛片女人毛片| 日日啪夜夜撸| 免费看av在线观看网站| 免费看a级黄色片| 久久99热6这里只有精品| 欧美高清性xxxxhd video| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲伊人久久精品综合| 内地一区二区视频在线| 欧美bdsm另类| 美女视频免费永久观看网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产视频内射| 久久99精品国语久久久| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 乱系列少妇在线播放| 欧美精品一区二区大全| 一本一本综合久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 免费人成在线观看视频色| 国产综合精华液| 99视频精品全部免费 在线| 最近的中文字幕免费完整| 少妇丰满av| 中文字幕久久专区| 91在线精品国自产拍蜜月| 天堂中文最新版在线下载 | av在线蜜桃| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产高潮美女av| 免费看日本二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲av福利一区| 99re6热这里在线精品视频| 男插女下体视频免费在线播放| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 搡老乐熟女国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产美女午夜福利| 草草在线视频免费看| 成人午夜精彩视频在线观看| 69av精品久久久久久| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕亚洲精品专区| 精品久久久久久久久av| 国产成人精品福利久久| 精品人妻熟女av久视频| 日韩伦理黄色片| 可以在线观看毛片的网站| av在线播放精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人福利小说| 一个人看的www免费观看视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 91久久精品电影网| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久伊人网av| 成人美女网站在线观看视频| 日韩人妻高清精品专区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| videos熟女内射| 亚洲精品乱久久久久久| 99热这里只有是精品50| 在线观看三级黄色| 久久久精品免费免费高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 女人久久www免费人成看片| av国产精品久久久久影院| 国产男女超爽视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品久久久久久久电影| 国产 精品1| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲高清免费不卡视频| 国产老妇女一区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲最大成人中文| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 黄色一级大片看看| 日韩免费高清中文字幕av| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美成人精品欧美一级黄| 日日撸夜夜添| 日韩欧美一区视频在线观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品一区二区免费观看| 联通29元200g的流量卡| av在线天堂中文字幕| 久久女婷五月综合色啪小说 | 高清在线视频一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美最新免费一区二区三区| 春色校园在线视频观看| 大陆偷拍与自拍| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 老司机影院成人| 亚洲精品视频女| 一级av片app| 97超视频在线观看视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 免费电影在线观看免费观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜激情福利司机影院| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲色图av天堂| 久久久久性生活片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 大香蕉久久网| 免费黄色在线免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 看十八女毛片水多多多| 久久精品久久久久久久性| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品伦人一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 制服丝袜香蕉在线| 日本三级黄在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 男人舔奶头视频|