miR-106b對(duì)肝癌細(xì)胞放療敏感性的影響及其作用機(jī)制

王正 陳闖 丁志龍 徐震 呂春陽(yáng)

作者單位：223002 淮安 淮安市第二人民醫(yī)院肝膽外科

肝癌是全世界發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，且近年來(lái)呈逐年遞增趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類生命健康［1］。手術(shù)是肝癌首選的治療方式，但大多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，且即使可手術(shù)的患者術(shù)后5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍較高，因此總體治療效果并不理想［2-3］。隨著放療設(shè)備和技術(shù)的不斷發(fā)展，放療在不可切除肝癌患者中的作用凸顯，但是放療抵抗成為極大影響療效的一大問(wèn)題［4］。微小RNA（miRNA）是一類可調(diào)節(jié)并修飾不同靶點(diǎn)的單鏈非編碼小分子RNA。既往研究顯示，miRNA在調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感性中發(fā)揮重要作用［5］，其中miR-106b在肝癌HepG2細(xì)胞中表現(xiàn)出增強(qiáng)細(xì)胞遷移、侵襲功能［6］，在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放療抵抗作用［7］，但在肝癌放療中miR-106b的作用及機(jī)制并不清楚。本研究旨在構(gòu)建miR-106b下調(diào)的肝癌HepG2細(xì)胞模型，探討miR-106b對(duì)肝癌細(xì)胞放療敏感性的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人肝癌細(xì)胞株 HepG2、SMMC-7721、SK-HEP-1、Huh7及正常肝細(xì)胞株QSG7701購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自澳大利亞AusGeneX公司；CCK-8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；PI3K、AKT、PCNA、Bax及 GAPDH 抗體購(gòu)自 Abcam公司；p-PI3K抗體購(gòu)自Bioworld公司；p-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Omnimabs公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Santa公司；無(wú)序siRNA、miR-106b siRNA、miR-106b引物、U6引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將 HepG2、SMMC-7721、SK-HEP-1、Huh7、QSG7701細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素各100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制備成1×105/mL的單細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-106b下調(diào)組，其中空白對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組分別為使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染無(wú)序siRNA、miR-106b siRNA的HepG2細(xì)胞。

1.3 qRT-PCR 法檢測(cè) PI3K、AKT、miR-106b mRNA的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常肝細(xì)胞QSG7701及肝癌細(xì)胞 HepG2、SMMC-7721、SK-HEP-1、Huh7 分別制備成1×105/mL單細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板。用6 Gy 6 MV-X射線處理轉(zhuǎn)染后的各組HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-106b、PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 2 min，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。miR-106b 上游引物：5′-CCTGCCGGGGCTAAAGTGCT-3′，下游引物：5′-CCTGCTGGAGCAGCAAGTAC-3′；PI3K 上游引物：5′-AGATGCTTTCAAACGCTAT-3′，下游引物：5′-GCTGTCGCTCACTCCA-3′；AKT 上游引物：5′-TCTATGGCGCTGAGATTGTG-3′，下游引物：5′-CTTAATGTGCCCGTCCTTGT-3′；內(nèi)參 U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內(nèi)參 β-actin 上游引物：5′-ACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物：5′-GCCACCAATCCACACAGAGT-3′。采用 2-ΔΔCt法，以 U6 為內(nèi)參計(jì)算miR-106b mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算PI3K、AKT mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞的克隆形成率和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制備成3×103/mL單細(xì)胞懸液，以2 mL/孔接種于6孔細(xì)胞板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日，室溫下分別接受不同劑量（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）6 MV-X 射線照射，射野覆蓋全細(xì)胞培養(yǎng)板；繼續(xù)培養(yǎng)14 d，PBS洗滌，每孔用3 mL甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，在顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)各孔單個(gè)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)并計(jì)算克隆形成率（plating efficiency，PE）及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）。PE=（克隆數(shù)/細(xì)胞數(shù)）×100%；SF=（受照射組細(xì)胞PE/對(duì)照組細(xì)胞PE）×100%。

1.5 CCK-8法檢測(cè)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖情況

轉(zhuǎn)染后的各組HepG2細(xì)胞接受6 Gy 6 MV-X射線處理，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡情況

轉(zhuǎn)染后的各組HepG2細(xì)胞接受6 Gy 6 MV-X射線處理，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗滌后，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液調(diào)整成細(xì)胞濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸浮液；按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書步驟，分別加入Annexin V-FITC、PI各 5 μL，避光孵育 1 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測(cè)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PCNA、Bax蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后的各組HepG2細(xì)胞接受6 Gy 6 MV-X射線處理，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的總蛋白，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量。各組取等量蛋白質(zhì)，經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)至PDVF膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，分別加入 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、PCNA、Bax、GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶500），4℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，根據(jù)免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106b在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ，QSG7701、HepG2、SMMC-7721、SK-HEP-1、Huh7 細(xì)胞中 miR-106b 表達(dá)水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.363，P<0.001），其中肝癌細(xì)胞系中miR-106b表達(dá)水平均高于 QSG7701細(xì)胞（均 P＜0.05），且 HepG2細(xì)胞中miR-106b表達(dá)水平最高，故選用HepG2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-106b在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-106b in liver cancer cell lines detected by qRT-PCR

2.2 不同照射劑量對(duì)HepG2細(xì)胞PE、SF水平的影響

采用不同劑量（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）照射后，與0 Gy相比，隨劑量升高HepG2細(xì)胞的PE、SF水平均降低（均P＜0.05），其中6 Gy與8 Gy照射的PE、SF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見圖 2。因此，本研究選擇6 Gy進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同劑量照射后HepG2細(xì)胞的PE和SF水平Fig.2 PE and SF levels of HepG2 cells treated with different irradiation doses

2.3 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中miR-106b mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，6 Gy照射后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組HepG2細(xì)胞中miR-106b mRNA表達(dá)水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.366，P=0.001），其中miR-106b下調(diào)組miR-106b mRNA表達(dá)水平較其余兩組均降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中miR-106b mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of miR-106b mRNA in HepG2 cells after transfection detected by qRT-PCR

2.4 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy照射后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組HepG2細(xì)胞OD值組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.047，P<0.001），其中miR-106b下調(diào)組OD值較其余兩組降低（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of down-regulation of miR-106b on the proliferation of HepG2 cells induced by radiation

2.5 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy照射后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組HepG2細(xì)胞凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.224，P<0.001），其中miR-106b下調(diào)組細(xì)胞凋亡率較其余兩組升高（均 P＜0.05）。見圖 5。

圖5 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of down-regulation of miR-106b on the apoptosis of HepG2 cells induced by radiation

2.6 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中PI3K、AKT mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy照射后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組HepG2細(xì)胞中PI3K和AKT mRNA表達(dá)水平組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.212，55.207，均 P<0.001），其中與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，miR-106b下調(diào)組PI3K和AKT mRNA表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中PI3K、AKT mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effect of down-regulation of miR-106b on the expression of PI3K、AKT mRNA in HepG2 cells induced by radiation

2.7 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PCNA、Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)6 Gy照射后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-106b下調(diào)組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PCNA、Bax蛋白水平組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相 比，miR-106b 下調(diào) 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PCNA蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05），而Bax蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖 7。

圖7 下調(diào)miR-106b對(duì)輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PCNA、Bax蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of down-regulation of miR-106b on the expression of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,PCNA and Bax proteins in HepG2 cells induced by radiation

3 討論

miRNA是一類長(zhǎng)度為17～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。近年來(lái)，隨著生物分子機(jī)制研究的不斷深入，miRNA被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)與靶基因特定區(qū)域結(jié)合，干擾靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起原癌或抑癌基因作用［8］。miR-106b屬于miRNA家族的一員，既往研究發(fā)現(xiàn)miR-106b在多種腫瘤中高表達(dá)，且可能參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等進(jìn)程，還可影響化療敏感性［9］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-106b在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，進(jìn)一步采用不同劑量射線照射HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PE、SF水平隨著照射劑量升高逐漸降低；在經(jīng)6 Gy照射的HepG2細(xì)胞中下調(diào)miR-106b表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力受抑制，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)也下調(diào)，而細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，提示下調(diào)miR-106b表達(dá)可在放療基礎(chǔ)上抑制細(xì)胞增殖能力并誘導(dǎo)凋亡。

PI3K/AKT信號(hào)通路是致癌基因與多種受體聯(lián)系的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、血管生成過(guò)程中均扮演重要角色［10］。有研究報(bào)道，PI3K/AKT信號(hào)通路激活可致使肺癌細(xì)胞耐藥性和放療抵抗性［11］。阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路也被發(fā)現(xiàn)抑制肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［12］。miR-106b也可通過(guò)靶向PTEN而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)垂體腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲［13］。SHI等［14］同樣發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p 通過(guò)靶向PTEN途徑激活PI3K/AKT通路而促進(jìn)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞維持與轉(zhuǎn)移。本研究在輻射誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中同時(shí)下調(diào)miR-106b，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平均降低，提示下調(diào)miR-106b表達(dá)可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT通路活化從而增強(qiáng)放療敏感性，抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，miR-106b在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可以增強(qiáng)放療對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且可能通過(guò)阻斷PI3K/AKT通路活化增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的放療敏感性。miR-106b可能是肝癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，但這一結(jié)論需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。