梅花鹿體外胚胎生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究進(jìn)展

李 寧，黃承俊

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng)110032）

梅花鹿是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。由于梅花鹿季節(jié)性發(fā)情、繁殖周期較長(zhǎng)、單產(chǎn)、自然繁殖率低，人們不得不借助新的繁殖技術(shù)。其中，需求最為廣泛的是體外胚胎生產(chǎn)。該技術(shù)能有效利用淘汰資源[1]、活體卵巢[2]、未成熟個(gè)體等[3]快速擴(kuò)大良種覆蓋率，提高鹿群整體水平。

文章涉及的體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）和體外培養(yǎng)（IVC）是體外胚胎生產(chǎn)的3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)對(duì)該環(huán)節(jié)的了解，不僅能掌握國(guó)內(nèi)外梅花鹿體外胚胎的生產(chǎn)現(xiàn)狀，對(duì)資源庫(kù)的建設(shè)也有一定的幫助。

1 梅花鹿的生殖生理

梅花鹿是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，通常集中在9～11月份發(fā)情，周期為12～16 d。梅花鹿的生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)與牛、羊等反芻動(dòng)物相似，子宮呈典型綿羊角狀，子宮角內(nèi)妊娠[4]。梅花鹿發(fā)情前后，血漿中促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮黃體酮（P4）含量的變化模式也與牛、羊等反芻動(dòng)物的相似，排卵發(fā)生在發(fā)情或LH峰后2 d內(nèi)[5]。因此，梅花鹿的生殖調(diào)控或可借鑒牛、羊等反芻動(dòng)物的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)技術(shù)。

2 卵母細(xì)胞的體外成熟

梅花鹿卵母細(xì)胞的體外成熟主要參照牛、羊等反芻動(dòng)物的相關(guān)技術(shù)。成熟條件為5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)法。溫度多為38.5℃，也有38.8℃[6]。尚未見(jiàn)三氣培養(yǎng)法的報(bào)道。基礎(chǔ)液均為M199培養(yǎng)基。成熟時(shí)間為20～24 h，其中24 h的效果要優(yōu)于20 h，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[7]，與牛、羊等反芻動(dòng)物的結(jié)果相同。

成熟液的添加物主要有血清、卵泡液、FSH、LH、E2、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、半胱胺酸等，不同的添加物組合，效果差異很大。胎牛血清（FBS）和羊卵泡液（FF）的添加量多為10%、FSH為10μg/mL、LH為1μg/mL、E2為1μg/mL、EGF為50μg/L、HEPES為25 mmol/L、半胱胺酸為100μmol/L。卵母細(xì)胞的核成熟率在51%～80%[6,8]，EGF、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒可有助于核的成熟[9]。研究報(bào)道，F(xiàn)SH和E2是鹿卵母細(xì)胞體外成熟的必要激素[9-10]。但是，在繁殖季節(jié)，E2的效果并不明顯，反而0.2 mmol/L半胱氨酸能夠有效促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟。基礎(chǔ)液中添加10%FBS、10μg/mL FSH、1μg/mL LH、0.2 mmol/L半胱氨酸和50μg/L EGF，具有較好的成熟效果。非繁殖季節(jié)時(shí)，添加10%FBS、20μg/mL FSH、2 mg/L LH、0.4 mmol/L半胱胺酸和100μg/L EGF，成熟效果較好[7]。

繁殖季節(jié)卵母細(xì)胞的體外成熟率極顯著高于非繁殖季節(jié)的體外成熟率。原因是梅花鹿為短日照動(dòng)物，非繁殖季節(jié)的內(nèi)分泌和黃體自然性循環(huán)受限，導(dǎo)致激素分泌不足，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育[7]。但是，完整且致密的高質(zhì)量卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟，并不受季節(jié)的限制[6]。

另外，卵巢對(duì)保存時(shí)間和溫度也有一定的要求。短時(shí)運(yùn)輸時(shí)，時(shí)間不得超過(guò)6 h，保存溫度為30℃；長(zhǎng)時(shí)運(yùn)輸時(shí)，時(shí)間為6～12 h，保存溫度為20～25℃；當(dāng)運(yùn)輸超過(guò)12 h時(shí)，保存溫度應(yīng)控制在10～15℃[8,11]，否則會(huì)極大降低卵母細(xì)胞的體外成熟率。

3 成熟卵母細(xì)胞的體外受精

研究發(fā)現(xiàn)，20%發(fā)情羊血清（SS）是各種鹿類體外獲能的關(guān)鍵[9,12]。牛經(jīng)典的肝素獲能機(jī)理也符合鹿類[13]。鹿的體外受精程序可參照牛、羊的進(jìn)行。因此，梅花鹿體外受精的研究分為血清和肝素兩個(gè)方面。由于梅花鹿相關(guān)方面的研究相對(duì)較少，其中使用血清的報(bào)道居多，而肝素的多見(jiàn)于其他鹿類[14]。

受精條件有飽和濕度的CO2（5%）培養(yǎng)法和飽和濕度的三氣培養(yǎng)法（5%O2、5%CO2、90%N2）。溫度多為38.5℃，也有38.8℃[6]。據(jù)馬鹿相關(guān)試驗(yàn)顯示，溫度在38～39℃之間，精子的體外獲能效果差異并不顯著，但以38.5℃最佳[14]。梅花鹿體外受精溫度的選擇或可參照馬鹿的使用?；A(chǔ)受精液多為SOFaa液，也有用TALP液的[9]。受精時(shí)間均為18 h，尚未見(jiàn)BO液的報(bào)道。

精子體外獲能的方法為Percoll梯度離心法，尚未有上浮法和孵育法的報(bào)道，可能與使用血清有關(guān)。在馬鹿方面，以BO液為受精媒介進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，Percoll梯度離心法的精子頂體反應(yīng)率和活力均顯著低于其他兩種[14]，表明梅花鹿體外獲能方面仍有很大的研究空間。

受精液的添加物基本均是20%的發(fā)情羊血清（SS）。精子用Percoll梯度離心法處理后，直接用受精液進(jìn)行稀釋備用。使用SOFaa液時(shí)，也有用SOFaa+10 mmol/L Hepes進(jìn)行精子洗滌，再用SOFaa+20%SS+5 mg/L肝素進(jìn)行稀釋備用[6]。在血清和肝素的使用上，有學(xué)者曾對(duì)TALP液+20%SS、TALP液+2%SS、TALP液和TALP液+10 mg/L肝素的受精效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，TALP液+10 mg/L肝素的受精率最低，與TALP液組一樣，顯著低于TALP液+2%SS，極顯著低于TALP液+20%SS組[15]。上述研究表明，在梅花鹿的體外受精方面，也曾有研究人員對(duì)肝素進(jìn)行探索，只是結(jié)果不理想，不如Berg等的研究結(jié)果[16]。

受精時(shí)，精子的使用濃度多為1×106/mL，也有3×106/mL[6]。據(jù)報(bào)道，1×106/mL濃度的精子受精率要顯著高于0.5×106/mL濃度，多精入卵率可達(dá)22%[9]。馬鹿也有多精入卵的現(xiàn)象，使用最佳濃度0.4×106/mL時(shí)，多精入卵率可達(dá)15%[12]。尚未見(jiàn)其他鹿類的相關(guān)研究。但多精入卵是否是鹿類的共性，對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生的影響，還需進(jìn)一步探索。

4 受精卵的體外培養(yǎng)

培養(yǎng)條件主要為飽和濕度的三氣培養(yǎng)法（5%O2、5%CO2、90%N2）[6]。溫度多為38.5℃，也有38.8℃[6]?；A(chǔ)培養(yǎng)液均為SOFaa，培養(yǎng)時(shí)間為7～8 d，尚未見(jiàn)其他培養(yǎng)液的報(bào)道。培養(yǎng)方式有SOFaa+10%FCS[9]、SOFaaBSA+10%FCS+輸卵管上皮細(xì)胞單層共培養(yǎng)[6,16-17]、DSOF+10%FBS[18]、改良SOF液[19]等。據(jù)報(bào)道，鹿類胚胎與其他反芻動(dòng)物一樣，也有發(fā)育阻滯現(xiàn)象，而輸卵管上皮細(xì)胞單層，能有效促進(jìn)胚胎的進(jìn)一步發(fā)育[17,20]。當(dāng)采用輸卵管上皮細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，能顯著提高梅花鹿的桑囊胚率[6]，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致；但該試驗(yàn)中，未采用共培養(yǎng)的組，桑囊胚率均為零，與那些未用共培養(yǎng)方法卻仍獲得桑囊胚的研究不相符[9,19]。卵母細(xì)胞成熟時(shí)的質(zhì)量也決定胚胎未來(lái)的發(fā)育程度[21]。生產(chǎn)中，鹿體內(nèi)胚已步入應(yīng)用階段[22]，體外胚的發(fā)展已迫在眉睫。體外胚胎生產(chǎn)各環(huán)節(jié)間的復(fù)雜聯(lián)系，仍是研究的一大難題。

5 結(jié)論

綜上所述，梅花鹿的桑囊胚率比較低，整個(gè)生產(chǎn)體系還不是很完善，仍需進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。