雞大腸桿菌噬菌體生物特性的研究及臨床應(yīng)用

許方方，李鳳華，王玉霞，李梁梁

（山東迅達(dá)康獸藥有限公司，山東濟(jì)南250316）

耐藥性的加劇，無抗養(yǎng)殖的實(shí)施，噬菌體作為細(xì)菌的“天敵”發(fā)揮著不可替代的作用。噬菌體（bacteriophage，phage）是能夠侵染細(xì)菌的病毒，但對非靶向的細(xì)菌是無毒的，針對目標(biāo)菌株，可以滲透或者破壞生物膜[1]。生物圈中普遍存在著噬菌體，既可以特異性的靶向裂解細(xì)菌，也可以通過基因突變的技術(shù)拓展噬菌體的宿主譜。噬菌體分為毒性噬菌體和溫和型噬菌體。能與對應(yīng)的宿主細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)完成吸附、侵入、合成、成熟和釋放復(fù)制周期的噬菌體，稱為烈性噬菌體；溫和噬菌體能感染宿主菌，但并不能增殖，不引起細(xì)胞的裂解，但其基因整合于細(xì)菌染色體從而復(fù)制給子代[2]。大量研究表明，腸道內(nèi)的噬菌體與細(xì)菌存在微生物菌群動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)系，毒性噬菌體能夠保護(hù)宿主抵抗外來病原菌的入侵，維持腸道健康[3-6]。

噬菌體可以侵染細(xì)菌，治療很多細(xì)菌性疾病。研究表明，噬菌體可以治療是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染引起的仔豬腹瀉，并且取得了顯著的療效[7-8]。Tanji等[9]用3株廣譜噬菌體做成混合制劑，成功裂解了E.coliO157∶H7菌；同樣混合制劑治療被E.coliO157∶H7感染的小鼠，小鼠腸道的感染菌完全裂解。此外，使用噬菌體和生理鹽水分組治療經(jīng)大腸桿菌感染的小鼠，結(jié)果顯示，噬菌體治療組全部存活，而生理鹽水組全部死亡[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期從養(yǎng)雞場采集糞便，分離的大腸桿菌噬菌體已對噬菌譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌血清型O1和O2有裂解能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證噬菌體治療禽大腸桿菌發(fā)揮的作用，本試驗(yàn)選取分離的噬菌體對其生物特性和臨床治療進(jìn)行研究，為噬菌體臨床治療禽大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 宿主菌和噬菌體

實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌血清型O1購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（保藏號(hào)：CVCC1343）；所用噬菌體為雞場糞便分離純化的噬菌體。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（1 L）：Tryptone 10 g、Yeast E tract 5 g、NaCl 10 g。

LB半固體和LB固體（1 L）培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再分別加Agar 7.5 g和15 g、生理鹽水、HCl試液、1 mol/L NaOH溶液和過氧乙酸等。

1.1.3 儀器設(shè)備

YXQ-75S11自動(dòng)蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SW-CJ-1F超凈操作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、HZQ-X300C恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、H1750R離心機(jī)（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、微量移液器、培養(yǎng)皿、一次性0.45μm和0.22μm微孔針式過濾器、灌胃針、雞籠等。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

1日齡白羽肉雞購自山東泰安孵化場；日糧購自新希望六和禹城分公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物學(xué)特征

利用雙層瓊脂平板法研究噬菌體的pH值、熱穩(wěn)定性、生長曲線和最佳感染復(fù)數(shù)的生物學(xué)特征。下層板：滅菌的LB固體培養(yǎng)基冷卻至55℃，使用10 mL注射器吸取10 mL LB至平板中冷卻凝固。上層板：100μL稀釋的噬菌體、500μL宿主菌于試管（二者37℃水浴5 min混合后）中再加入45°C的5 mL LB半固體培養(yǎng)基，三者混合后，到入鋪有培養(yǎng)基的平板內(nèi)，凝固，倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

噬菌體pH值穩(wěn)定性：取滅菌后的20 mL LB液體培養(yǎng)基9瓶，用HCl試液和1 mol/L NaOH溶調(diào)pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11。從每瓶中分別取0.9 mL至無菌的EP管中，放入37°C恒溫水浴鍋中8 min，在加入0.1 mL噬菌體（109PFU/mL），再放37°C水浴鍋恒溫作用45 min。再從各EP管中取0.1 mL做10倍梯度稀釋，用雙層板法測定噬菌體效價(jià)。

噬菌體熱穩(wěn)定性：各取噬菌體原液1 mL分裝于無菌EP管中，分別置于15、25、30、40、50、60℃恒溫水浴鍋中，保溫靜置90 min，分別在30、60、90 min時(shí)間點(diǎn)取0.1 mL，液體冷卻至室溫后，做10倍梯度稀釋，用雙層板法檢測噬菌體效價(jià)。

噬菌體感染復(fù)數(shù)：分別取宿主菌O1培養(yǎng)至OD值為0.6菌懸液0.5 mL，再取稀釋不同倍數(shù)的噬菌體裂解液各0.5 mL，使其感染復(fù)數(shù)（MOI）分別為0.001、0.01、0.1、1、10和100，混合均勻，從各混合液中取0.5 mL加入50 mL LB培養(yǎng)液中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，4°C、8 000 r/min離心20 min，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得到噬菌體裂解液利用雙層板法測其效價(jià)。

噬菌體一步生長曲線：指定量記載噬菌體生長規(guī)律所繪制的曲線，從曲線中清晰地看出噬菌體的潛伏期、裂解期和平穩(wěn)期。加入MOI為0.1的噬菌體液和O1宿主菌至LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫水浴15 min，10 000 r/min離心5 min，取沉淀使用37℃LB液體培養(yǎng)基洗滌2次，取離心的沉淀加入37℃LB液體培養(yǎng)基10 mL，混勻，37℃恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)，從0 min開始每隔15 min采集液體測效價(jià)，直到135 min。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，效價(jià)為縱坐標(biāo)繪制噬菌體的一步生長曲線。

攻毒菌液的制備：取25%甘油保存的大腸桿菌血清型O1 0.5 mL加入滅菌后的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)12 h。采用平板計(jì)數(shù)法測定菌液的濃度。根據(jù)菌液的濃度，使用生理鹽水將菌懸液稀釋為4個(gè)梯度，分別為5.0×107、1.0×108、3.0×108、5.0×108PFU/mL。

攻毒方式：參考文獻(xiàn)[11]選擇腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒。選取50只健康、7日齡817肉雞，平均分為Gl、G2、G3、G4和對照組，每組8只。每只肉雞分別注射0.3 mL/只制備好的菌液，對照組注射0.3 mL生理鹽水。攻毒前，禁食、禁水12 h。攻讀期間，正常飼喂，周期為7 d。7 d后統(tǒng)計(jì)雞的狀態(tài)[12]（疾病評分標(biāo)準(zhǔn)：0=正常，1=蹲臥、精神不振、采食下降等，2=死亡）。

1.2.3 噬菌體的治療試驗(yàn)

噬菌體的安全性檢測：取制備好的噬菌體裂解液0.1 mL用涂布棒均勻涂在LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)18～24 h，檢測有無細(xì)菌生長。

噬菌體的毒性檢測：選取20只雛雞，分成A和B兩組，每組10只，A組每只雛雞口服1 mL噬菌體（l×1010PFU/mL），B組為空白對照。觀察雛雞是否發(fā)病，試驗(yàn)持續(xù)至雛雞10日齡。

噬菌體的防治作用：選取160只7日齡雛雞隨機(jī)分為8組，每組20只。攻毒之前，禁食、禁水12 h。試驗(yàn)期間正常飼喂和飲水，定時(shí)通風(fēng)換氣、更換墊料。攻毒腹腔注射0.3 mL菌液（菌濃度為2×l08PFU/mL），給藥采用攻毒后立即飲水灌喂法0.5 mL和注射法0.2 mL，7 d后記錄每組雛雞發(fā)病、治死亡情況及得分。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體生物活性2.1.1 噬菌體pH值穩(wěn)定性結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，噬菌體在pH值4～9時(shí)，均保持較高的活性，效價(jià)結(jié)果變動(dòng)不大。

圖1 噬菌體pH值穩(wěn)定性結(jié)果Fig.1 Results of pH stability of phage

2.1.2 噬菌體熱穩(wěn)定性結(jié)果（見表2）

野外采樣在設(shè)計(jì)點(diǎn)位的引導(dǎo)下實(shí)地根據(jù)地形和GPS結(jié)合的方法進(jìn)行定點(diǎn)，采用化探采樣航跡監(jiān)控系統(tǒng)對主點(diǎn)、副點(diǎn)、副副點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控[17]，確保采樣到位率。

由表2可知，噬菌體在37℃以下生物活性基本保持不變。但在50℃作用60 min后，原有的活性下降明顯，特別是在60℃作用90 min后，只能看到個(gè)別噬菌斑，說明噬菌體不易在高溫下儲(chǔ)存。

表2 噬菌體熱穩(wěn)定性結(jié)果Tab.2 Stability of phage under different temperature 單位：PFU/mL

2.1.3 噬菌體感染復(fù)數(shù)結(jié)果（見圖2）

圖2 噬菌體感染復(fù)數(shù)結(jié)果Fig.2 Results of phage multiplicity of infection

由圖2可知，通過雙層板瓊脂平板法測定大腸桿菌噬菌體的MOI是1，測得滴度是3.0×1011PFU/mL。

2.1.4 噬菌體一步生長曲線結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，在0～15 min內(nèi)噬菌體數(shù)量無增長，在15～75 min內(nèi)噬菌體的滴度達(dá)到2.7×1011PFU/mL處于裂解期，在75～150 min噬菌體的數(shù)量幾乎未發(fā)生改變。由此可知，噬菌體的潛伏期很短，為0～15 min，裂解期很長，為15～75 min。根據(jù)這一生物特性能更好地被臨床實(shí)踐所利用。

圖3 噬菌體一步生長曲線Fig 3 One-step growth curve phage

2.2 攻毒預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

由表3可知，7 d后G3組死亡率50%，統(tǒng)計(jì)分?jǐn)?shù)9分，G4組死亡率高，且其他雞精神不振，統(tǒng)計(jì)得分11分，綜合判斷選G3組為攻毒的劑量。

表3 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Pretest result

2.3 大腸桿菌噬菌體的防治結(jié)果

2.3.1 噬菌體的安全性結(jié)果

噬菌體安全性檢測是用噬菌體裂解液涂在LB平板上，培養(yǎng)3 d無菌落，平板呈透明狀。

2.3.2 噬菌體的毒性試驗(yàn)結(jié)果

口服噬菌體1 mL的雛雞1 w內(nèi)未出現(xiàn)患大腸桿菌病的任何不適癥狀，且雛雞存活率是100%。因此，噬菌體裂解液安全可靠，可以用于大腸桿菌病防治試驗(yàn)。

2.3.3 噬菌體的防治試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

由表4可知，預(yù)防組口服噬菌體對雞感染大腸桿菌病預(yù)防效果不明顯。原因可能是噬菌體的特異性決定的，提前進(jìn)入機(jī)體的噬菌體在體內(nèi)無特定的目標(biāo)菌株可以裂解，不能大量增殖而凋亡，達(dá)不到防控的效果[11-12]。口服組對雞感染大腸桿菌的有一定的治療效果。口服組隨著滴度增加，治療效果越好，C組、D組和E組的治療率分別為60%、75%和80%。原因可能是大腸桿菌在雞體內(nèi)存留，噬菌體侵入后可以快速繁殖，進(jìn)而將宿主菌裂解，保護(hù)機(jī)體免受大腸桿菌的進(jìn)一步侵害。注射組噬菌體優(yōu)于口服組治療，同滴度噬菌體注射組和口服組的治療率分別是85%和75%。原因可能是攻毒和治療都采用注射方式，機(jī)體吸收的快，二者繁殖過程中相互作用，一定程度上阻止了雞大腸桿菌病的發(fā)生?？股亟M的治療效果不如口服組和注射組，原因可能是攻毒的大腸桿菌本身攜帶的耐藥性有關(guān)。

表4 噬菌體防治試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of phage prevention and treatment

3 討論

目前，噬菌體的開發(fā)和應(yīng)用得到業(yè)界的肯定，并且在治療方面取得顯著的療效。本試驗(yàn)首先對噬菌體的生物特性進(jìn)行研究，生物學(xué)特性試驗(yàn)是對噬菌體進(jìn)行應(yīng)用性研究的基礎(chǔ)，通過對其溫度穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、最佳感染復(fù)數(shù)以及一步生長曲線的測定，掌握生長特性，在后期的噬菌體治療雞感染大腸桿菌病的臨床試驗(yàn)中起關(guān)鍵性作用。在噬菌體的防治試驗(yàn)中，通過預(yù)防、口服和注射3種途徑對雞大腸桿菌病進(jìn)行防治試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)噬菌體預(yù)防對雞大腸桿菌病所起的效果不大，口服和注射治療雞感染大腸桿菌病有很好的治療效果，明顯降低了死亡率，并且注射治療優(yōu)于口服治療。另外，在口服治療試驗(yàn)中，設(shè)置不同的滴度進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)隨著滴度的升高，降低死亡率的效果越顯著，臨床試驗(yàn)結(jié)論與其他研究人員得出的結(jié)論相符[13-14]。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌噬菌體的防治效果與給藥時(shí)間、給藥方式和給藥劑量有關(guān)。雖然噬菌體的治療效果顯著，但是具體治療機(jī)制還需繼續(xù)研究，而且噬菌體作為一種病毒和生物性治療劑，可能導(dǎo)致某些毒性基因與耐藥基因的擴(kuò)散等問題[15]。

4 結(jié)論

大腸桿菌噬菌體對禽病大腸桿菌預(yù)防作用不大，口服和注射對禽病大腸桿菌治療效果顯著，并且注射治療效果優(yōu)于口服效果，口服高劑量組比低劑量組治療效果好。