全反式維甲酸與肝臟疾病的關(guān)系及其分子機(jī)制研究進(jìn)展

許召君，陳小彬，才保加，王成，喬文杰，劉光照，王鑫樂(lè)，劉韜，馬曉明

（1.青海大學(xué)研究生院，青海西寧810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，青海西寧810001）

1995年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)了全反式維甲酸（ATRA）藥物在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）中的應(yīng)用。迄今為止，通過(guò)口服ATRA 治療APL 仍作為標(biāo)準(zhǔn)療法[1]。自20世紀(jì)70年代分化治療概念提出后[2-3]，被逐步運(yùn)用于癌癥治療，其中包括ATRA 在內(nèi)的分化治療藥物，也被越來(lái)越多地運(yùn)用于腫瘤疾病的治療[4]。此外，ATRA在多個(gè)系統(tǒng)中顯示出抗血管生成的作用，抑制了血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖并顯現(xiàn)出對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗炎作用。不僅如此，肝臟疾?。ㄖ饕ǚ蔷凭灾拘愿尾　⒏卫w維化、肝細(xì)胞癌）作為全球流行性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來(lái)，ATRA 亦被廣泛應(yīng)用于肝病的防治，國(guó)內(nèi)外研究員就ATRA 的保肝機(jī)制和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究發(fā)現(xiàn)，ATRA 參與調(diào)控肝臟疾病的發(fā)展進(jìn)程，如調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲以及凋亡等。本文歸納了ATRA 與肝臟疾病相關(guān)的研究文獻(xiàn)，從多個(gè)角度闡述了ATRA 與肝臟疾?。ǚ蔷凭灾拘愿尾?、肝纖維化、肝細(xì)胞癌）的關(guān)系及其涉及的相關(guān)分子機(jī)制，為臨床試驗(yàn)ATRA 治療肝臟疾病提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 ATRA的代謝

ATRA 做為維生素A 的主要生物活性形式，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。由胃腸道吸收的視黃醇通過(guò)兩步反應(yīng)氧化為ATRA，第一步，視黃醇主要通過(guò)乙醇脫氫酶（ADH）或視黃醇脫氫酶（RDH）與視黃醛發(fā)生可逆氧化，RDH 能夠?qū)⒁朁S醛轉(zhuǎn)化回視黃醇，醛酮還原酶（AKR）也可以進(jìn)行相同的反應(yīng)；第二步，視黃醛被視黃醛脫氫酶（RALDHs 或ALDHs）不可逆地氧化為ATRA。ATRA 通過(guò)單純彌散進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)維甲酸結(jié)合 蛋 白（cellular retinoic acid binding protein，CRABP）結(jié)合后有兩種去路：一是由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的細(xì)胞色素P450 氧化還原酶（細(xì)胞色素CYP 酶）降解[5]，另一種通過(guò)異構(gòu)酶的作用，轉(zhuǎn)化為其立體異構(gòu)體，如13-順式維甲酸（13-cisRA）和9-順式維甲酸（9-cisRA）[6]。ATRA 或其異構(gòu)體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核維甲酸受體（RAR）或維甲類X 受體（RXR）結(jié)合形成異二聚體RAR/RXR 或同二聚體RXR-RXR，后者進(jìn)一步結(jié)合特定DNA 序列-維甲酸反應(yīng)元件（RAREs），從而影響目的基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生類維甲酸反應(yīng)。ATRA 通過(guò)與維甲酸受體（RARs）結(jié)合，后者可與視黃醇類受體（RXRs）形成二聚體，該二聚體與目的基因的調(diào)控序列結(jié)合并通過(guò)招募輔助激活因子啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]；在缺乏配體的情況下，RAR/RXR 異二聚體與維甲酸靶基因的維甲酸反應(yīng)元件（RAREs）結(jié)合并招募輔助抑制子如NCoR 和SMRT 抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。由ATRA 或其異構(gòu)體激活的RAR 和RXR 途徑是經(jīng)典途徑，在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。

2 ATRA 對(duì)非酒精性脂肪性肝病調(diào)控機(jī)制研究

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎，指由單純脂肪變性向進(jìn)展性脂肪變性的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而演變?yōu)楦窝?、肝硬化、肝?xì)胞癌[11]。NAFLD 是導(dǎo)致慢性肝病的主要原因，已成為社會(huì)公共健康問(wèn)題，其發(fā)病率逐年升高，據(jù)統(tǒng)計(jì)其全球發(fā)病率高達(dá)25.2%，與地區(qū)和社會(huì)條件有關(guān)[12]。NAFLD 具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者[13-14]認(rèn)為一些因素如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂、脂肪因子和細(xì)胞因子的生成、線粒體功能失調(diào)等共同參與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展，而線粒體功能失調(diào)是核心因素。

目前許多文獻(xiàn)已報(bào)道多種脂肪因子如adiponectin、leptin、resistin 與NAFLD 發(fā)病密切相關(guān)，chemerin 又名TIG2（tazarotene-induced gene 2）作為一種新的脂肪因子于2007 首次報(bào)道，編碼該蛋白的基因被發(fā)現(xiàn)受維甲酸類藥物他扎羅汀調(diào)控。張強(qiáng)[15]發(fā)現(xiàn)在NAFLD 中，脂肪因子chemerin 在mRNA 水平表達(dá)下降，其受體CMKLR1 在mRNA 水平表達(dá)上調(diào)，RARb 在NAFLD 中的表達(dá)下降，推測(cè)chemerin、CMKLR1、RARb 可能參與了NAFLD 的發(fā)病。同一作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ATRA 可以上調(diào)HepG2 細(xì)胞chemerin 在mRNA 及蛋白水平的表達(dá)。Nagpal 等[16]認(rèn)為chemerin 只可被RARb、RARr的激動(dòng)劑誘導(dǎo)表達(dá)，而非RXR 或VDR 的激動(dòng)劑誘導(dǎo)表達(dá)。Kato 等[17]報(bào)道維甲酸可使大鼠肝臟RARb的表達(dá)上調(diào)，因此NAFLD 中肝臟脂肪酸的增加導(dǎo)致視黃醇的酯化增加而活性形式降低且肝臟存在炎癥反應(yīng)及HSCs 的激活導(dǎo)致維甲酸含量的降低，導(dǎo)致RARb 的表達(dá)下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致chemerin 表達(dá)的下降。

3 ATRA對(duì)肝纖維化調(diào)控機(jī)制研究

3.1 ATRA 通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抗肝纖維化

肝纖維化是肝臟中可逆的傷口愈合反應(yīng)，是對(duì)慢性肝損傷（酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、乙型肝炎病毒、和丙型肝炎病毒）的反應(yīng)，如果不受控制，進(jìn)行性肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化，肝細(xì)胞癌（HCC）和終末期肝病。肝纖維化是由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生和降解的長(zhǎng)期不平衡導(dǎo)致的[18]。肝纖維化發(fā)展過(guò)程中ECM 成分的主要來(lái)源是肝星狀細(xì)胞（HSC），它位于肝細(xì)胞和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的區(qū)域，稱為“Disse 間隙”，約占正常肝細(xì)胞的8%～14%[6,19]。肝損傷后，HSC 由儲(chǔ)存維生素A 的靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨仍鲋车某杉±w維細(xì)胞，從而上調(diào)α-1 I 型膠原蛋白（COL1α1）的合成和α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，從而促進(jìn)傷口閉合[18]。

HSC 激活是肝纖維化的關(guān)鍵，受多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的控制。其中一個(gè)重要機(jī)制是涉及Wnt 信號(hào)通路的活化，Myung 等[20]在體外用Wnt3a處理人的HSC 細(xì)胞，結(jié)果提示COL1α1 和α-SMA 表達(dá)顯著增加，而用Wnt3a 相關(guān)抑制劑分泌型相關(guān)蛋白（sFRP）處理HSC 細(xì)胞，結(jié)果提示COL1α1 和α-SMA 顯著降低，表明Wnt 信號(hào)通路通過(guò)激活HSC參與了肝纖維化的形成。其中涉及的機(jī)制：通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路使胞質(zhì)中的β-catenin 穩(wěn)定性和表達(dá)水平顯著提升并促使β-catenin 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中與包括與肝纖維化密切相關(guān)的靶基因（COL1α1、α-SMA、cyclin D1、uPAR 以及基質(zhì)金屬蛋白酶家族如MMP-1，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-13 等）。ATRA 可通過(guò)誘導(dǎo)RORα 磷酸化，抑制Wnt/βcatenin 的信號(hào)傳遞，進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化的作用[21]。

3.2 ATRA通過(guò)TGF-β-Smad信號(hào)通路抗肝纖維化

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）對(duì)從最初的肝損傷到炎癥和纖維化以及慢性肝病進(jìn)展的所有階段都有貢獻(xiàn)[22]。肝損傷誘導(dǎo)受損的肝細(xì)胞和炎性細(xì)胞釋放活性TGF-β，從而上調(diào)了涉及纖維生成的幾種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的合成和釋放，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CCN2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和各種白介素（ILs）（IL-1β 和IL-6）[23]。此外，TGF-β 的上調(diào)促進(jìn)了肝細(xì)胞破壞（死亡）并介導(dǎo)了HSC 的活化，從而導(dǎo)致傷口愈合反應(yīng)，這暗示著成肌纖維細(xì)胞的生成和ECM 的沉積[24]。CCN2 與肝損傷的發(fā)展有關(guān)，其過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致纖維化加重，TNF-α 參與膽汁淤積性肝纖維化，IL-1β 刺激ECM 的合成，而IL-6誘導(dǎo)膠原蛋白的合成并加劇肝炎[25-28]。越來(lái)越多的研究表明，HSC 的激活是由復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)協(xié)調(diào)的。相關(guān)研究也提示ATRA 可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β-Smad 信號(hào)通路抑制系膜細(xì)胞環(huán)氧化酶-2 的表達(dá)，顯示其具有良好的抗纖維化作用[29]。陳珂等[30]通過(guò)ATRA 對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)探討相關(guān)機(jī)制，結(jié)果提示ATRA 能夠通過(guò)抑制HSC-T6 細(xì)胞中TGF-β1 的下游信號(hào)蛋白Smad2/3 的表達(dá)來(lái)影響TGF-β1/Smad 信號(hào)通路，從而發(fā)揮其抗肝纖維化作用。

4 ATRA對(duì)肝癌調(diào)控機(jī)制研究

肝癌在2018年的死亡人數(shù)超過(guò)781 000，被列為全球第三大致命性實(shí)體癌。在肝癌中，肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的惡性肝腫瘤（90%）[31]，HCC 的癥狀大多發(fā)生在晚期，這時(shí)HCC 極易侵入門靜脈而引起門靜脈腫瘤血栓。其他較不常見(jiàn)的亞型包括膽管癌，肝母細(xì)胞瘤以及纖維板層型癌。盡管近年來(lái)在診斷和治療方式上取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但5年生存率仍為5%～10%[32-33]。2007年，靶向小分子藥物索拉非尼被批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌并且在隨后的10年中，索拉非尼一直是晚期HCC的唯一一線治療靶向藥物。但是，許多臨床研究表明，相當(dāng)一部分肝癌患者對(duì)索拉非尼不敏感。實(shí)際上從索拉非尼治療中顯著受益的患者人數(shù)非常有限，索拉非尼的總體療效遠(yuǎn)不能令人滿意，這引起了研究人員的注意。近年來(lái)，一些研究將ARTA 用于肝癌的治療也取得了一定的成果，徐益語(yǔ)等[34]在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用維甲酸對(duì)66 例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行治療，結(jié)果提示有效率達(dá)15.2%、病情穩(wěn)定率達(dá)74.1%、41.8%的患者甲胎蛋白下降。而且相關(guān)研究也利用維甲酸提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性的特點(diǎn)，與其他抗癌藥物聯(lián)合使用，極大地提高了治療效果，大大降低了藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)，為肝癌的治療開(kāi)辟了新的途徑。

4.1 ATRA相關(guān)代謝酶與肝癌細(xì)胞的關(guān)系

Kropotova 等[35]發(fā)現(xiàn)ATRA 生物合成的每個(gè)步驟都存在失調(diào)，編碼視黃醇氧化/還原成視黃醛相關(guān)酶mRNA 的水平顯著降低（ADH1B，ADH1C，RDHL，AKR1B10 存在于兩種類型的癌癥中，RDH5 僅存在于大腸癌中，而ADH4，AKR1B 和RDH12 僅存在于胃癌中）。相關(guān)研究報(bào)道表明，HCC 細(xì)胞中AKR1B10 處于高表達(dá)，主要涉及的機(jī)制為AKR 過(guò)表達(dá)的酶通過(guò)視黃醛轉(zhuǎn)化為視黃醇引起ATRA 細(xì)胞內(nèi)剝奪，這種情況通過(guò)阻止細(xì)胞分化并促進(jìn)細(xì)胞增殖來(lái)誘導(dǎo)癌變[36]。為了支持這一假設(shè)，一些學(xué)者進(jìn)行肝癌的相關(guān)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了AKR酶的上調(diào)，因此，一些專家建議將它們作為診斷，分期和預(yù)后的早期檢測(cè)標(biāo)記[37]。部分研究提示，細(xì)胞色素CYP26A1 與腫瘤密切相關(guān)，其過(guò)表達(dá)在一定程度上可協(xié)助腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，CYP26A1 在結(jié)腸直腸癌、42%的原發(fā)性乳腺癌中均處于高表達(dá)水平，且在HCC 細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了CYP26A1 與CYP26B1 一起處于上調(diào)水平[38]。

4.2 ATRA對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)分子機(jī)制

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的一種程序性細(xì)胞死亡，腫瘤細(xì)胞消除的主要途徑，已知ATRA 通過(guò)不同的機(jī)制可以抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化從而導(dǎo)致死亡。盡管對(duì)ATRA 的研究已開(kāi)展許久，但ATRA 促凋亡作用的機(jī)制仍不完全清楚。其中公認(rèn)的途徑包括內(nèi)源性和外源性凋亡途徑。ATRA 可通過(guò)上調(diào)TNF-α、caspase-8 和死亡受體Fas激活外源性凋亡途徑[39-41]，ATRA 可以下調(diào)一些抗凋亡分子的表達(dá)，如Bcl-2，cdk2，cyclin D1[42]。主要機(jī)制是ATRA 通過(guò)抑制Bcl-2 和Bcl-x 蛋白表達(dá)并激活caspase-6、7、8、9，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到胞漿中，同時(shí)細(xì)胞色素C 在dATP 作用下激活caspase，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[43-44]。周青等[45]通過(guò)用1 μmol/L 和10 μmol/L 濃度的ATRA 處理HepG2 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ATRA 處理的HepG2 可導(dǎo)致其細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目減少、細(xì)胞增殖降低、遷移能力減弱、凋亡小體增多等，提示ATRA 作為誘導(dǎo)分化劑，可抑制HepG2 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡。

4.3 通過(guò)介導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）促生存作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖

胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）是一組具有促生長(zhǎng)作用的多肽類物質(zhì)，IGF 族有IGF-I 和IGF-II 兩種，IGF I 和II 以及胰島素可刺激多種癌細(xì)胞系的增殖。其中涉及的機(jī)制涉及IGF-I/-II 與I 型IGF 受體（IGFIR）結(jié)合，主要激活銜接胰島素受體底物-1（IRS-1），IRS-1 與p85 的相互作用誘導(dǎo)PI3-激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT 的激活，從而引發(fā)抗凋亡途徑，而0.1-100 μM 劑量的ATRA 抑制了該途徑[46]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MCF-7 細(xì)胞系中IGF 結(jié)合蛋白3（IGFBP-3）的表達(dá)不足，提示IGFBP-3 是生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，而ATRA 可通過(guò)誘導(dǎo)RAR β 的表達(dá)直接參與IGFBP-3 的表達(dá)，表明ATRA 對(duì)IGF 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制作用[47]。同樣，研究[47]發(fā)現(xiàn)RARα 參與肝癌細(xì)胞中IGFBP-3 的上調(diào)。Dokmanovic 等[48]在后來(lái)的研究中也證實(shí)了ATRA 治療后，IGFBP-3 處于高表達(dá)的狀態(tài)。

4.4 通過(guò)介導(dǎo)維甲酸誘導(dǎo)基因1（RIG1）甲基化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖

RIG1 被稱為視黃酸受體3（RARRES3）或他扎羅汀誘導(dǎo)基因1（TIG1）。正常組織與中度和低分化腫瘤相比，正常組織中RIG1 的水平更高[49]。在人類HCC 組織中發(fā)現(xiàn)RIG-1 被下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RIG-1 缺乏會(huì)促進(jìn)HCC 癌變，涉及機(jī)制為RIG-1 通過(guò)下MMP-9 抑制HCC 的增殖、遷移和侵襲的能力，RIG1 表達(dá)的降低與RIG1 啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)，在53%的原發(fā)性惡性腫瘤中甲基化密度>30%，與鄰近的非癌組織相比，HCC 組織中也發(fā)現(xiàn)了異常的甲基化，并且與肝臟和膽道的致癌事件有關(guān)[50]。一篇2017年的論文將RIG1 的表觀遺傳沉默與肝癌中上調(diào)的G9a 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的過(guò)表達(dá)相關(guān)[51]。隨后的研究確定了RIG1 啟動(dòng)子中的視黃酸反應(yīng)元件[52]。也證實(shí)了ATRA 可以誘導(dǎo)RIG1 表達(dá)增加，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。

5 總結(jié)與展望

肝臟在維生素A 的吸收、貯存以及代謝過(guò)程中扮演著重要的角色，其中肝細(xì)胞主要參與維生素A 的代謝，HSCs 將維生素A 以脂蛋白的形式進(jìn)行貯存[53]。綜上所述，NAFLD 中維甲酸的含量明顯降低，chemerin、CMKLR1、RARb 可能參與了NAFLD 的發(fā)病，而ATRA 可以上調(diào)chemerin 的表達(dá)，筆者認(rèn)為可以通過(guò)補(bǔ)充維甲酸來(lái)延緩NAFLD疾病的進(jìn)展，還需大量研究進(jìn)一步證實(shí)；目前也有不少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其具有抗肝纖維化的作用，補(bǔ)充維生素A 可有效減輕肝纖維化；ATRA 在臨床上多用于白血病的治療，近年來(lái)也將其應(yīng)用于肝癌的治療，本文從多個(gè)途徑闡述了ATRA 抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，盡管在臨床前階段發(fā)現(xiàn)了新療法，但在臨床試驗(yàn)中缺乏療效，只有弄清ATRA 對(duì)肝癌治療的相關(guān)機(jī)制，才有可能設(shè)計(jì)出協(xié)同克服關(guān)鍵步驟的聯(lián)合療法。在過(guò)去的幾年中，進(jìn)行了一些組合試驗(yàn)，但結(jié)果并非預(yù)期的，表明仍需詳細(xì)了解其分子機(jī)制，同時(shí)還需在臨床前階段中圍繞肝癌細(xì)胞系研究ATRA 的毒性，ATRA 為肝病治療提供了一個(gè)新的策略，值得進(jìn)一步深入研究。