尾加壓素Ⅱ促進毛乳頭細胞增殖及分泌血管內(nèi)皮生長因子的實驗研究

廖叢娟，張旭升，樊小容，譚小青，黃戰(zhàn)軍，蔡博治

近來研究發(fā)現(xiàn)，毛乳頭細胞通過分泌許多生物活性因子如血管內(nèi)皮生長因子（ VEGF ）等調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長，在毛囊的周期性循環(huán)和毛發(fā)生長中起重要作用[1,2]。尾加壓素Ⅱ（ urotensin Ⅱ，UⅡ）是一種最初發(fā)現(xiàn)于硬骨魚尾部下垂體的活性肽，其分布具有種屬普遍性，不同物種UⅡ的活性中心都是一個高度保守的環(huán)形六肽結構[3]。研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ是一種內(nèi)源性絲裂原，可促進多種細胞增殖，同時UⅡ還具有內(nèi)分泌效應，可影響血漿催乳素、促甲狀腺素、VEGF 等生物活性因子的分泌[4]。本實驗觀察了UⅡ對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞增殖及分泌VEGF的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑

SPF級雄性SD大鼠（汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心）。DMEM 高糖培養(yǎng)基、標準胎牛血清（Gibco公司）。胰蛋白酶（Sigma公司）。Urotensin Ⅱ（Rat，200 μg）（康肽生物有限公司）。CCK-8（碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將大鼠處死，于無菌環(huán)境下取大鼠觸須皮膚，用顯微剪分離大鼠觸須毛囊至生理鹽水中，再將觸須毛囊毛球部剪下，用Ⅰ膠原酶消化分離出毛球部的毛乳頭細胞。將毛乳頭細胞放入T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。貼壁后第1天細胞開始遷出呈現(xiàn)放射狀生長，2周后細胞絕大部分融合?？梢姷降湫偷拿轭^細胞凝集性生長的特性（圖1）。

圖1 毛乳頭細胞培養(yǎng)2周后的細胞形態(tài)鏡下所見（×100）

1.2.2 UⅡ對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞增殖的影響將第2～4代細胞消化、臺盼藍染活細胞計數(shù)，以每孔3×103的密度接種于96孔板內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，每孔加入100 μl含不同濃度UⅡ的DMEM培養(yǎng)基，UⅡ的濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L，對照孔加入不添加UⅡ的培養(yǎng)基，每個濃度設3個復孔。以鋪板24 h記為測量的0 h，分別于 0、24、48和72 h采用CCK-8法測量各孔的A值。測量時去除每孔的原培養(yǎng)液，懸空滴加含10% CCK8的新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中放置1 h后，在酶標儀上測量波段為450 nm的A值。增殖率=（含UⅡ實驗孔A值-空白對照孔A值）/（不含UⅡ對照孔A值-空白對照孔A值）×100%。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測上清液中VEGF水平 取2～4代毛乳頭細胞進行實驗。將細胞消化、臺盼藍染色計數(shù)后調(diào)節(jié)為105個/ml細胞懸液，接種于24孔板內(nèi)，每孔500 μl。將24孔板放置于5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后細胞穩(wěn)定貼壁，分別加 入 含10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L UⅡ的DMEM培養(yǎng)基各500 μl。對照組僅加入500 μl DMEM培養(yǎng)基。每個濃度3個復孔。培養(yǎng)72 h后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，用 VEGF ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中的VEGF 水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.0軟件進行方差分析和t檢驗，統(tǒng)計變量以均數(shù)±標準差表示。

2 結果

2.1 毛乳頭細胞的培養(yǎng)

新鮮分離的毛乳頭接種于 DMEM 培養(yǎng)液中, 放置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周后絕大部分融合生長，形狀似長梭形的成纖維細胞，呈凝集性生長特性（圖1）。

2.2 UⅡ對毛乳頭細胞增殖的影響

UⅡ10-6、10-7、10-8mol/L 可顯著促進毛乳頭細胞增殖（與對照組比較P＜0.05），說明UⅡ對毛乳頭細胞具有促增殖作用（圖2a）。隨著時間延長，濃度為10-6mol /L的UⅡ對毛乳頭細胞的促增殖作用明顯升高，48 h及72 h毛乳頭細胞的增殖率與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2b）。

圖2 CCK8 法檢測UⅡ對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞增殖的影響

2.3 不同濃度UⅡ對毛乳頭細胞上清中VEGF水平的影響

10-6、10-7mol /L UⅡ組毛乳頭細胞上清中分泌的VEGF水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同濃度U II對毛乳頭細胞上清中VEGF水平的影響 （n=3，ˉx ±s）

3 討論

毛乳頭細胞是一種生長于毛囊基底部的真皮源性細胞，通過分泌許多生物活性因子形成信號分子網(wǎng)絡，對毛囊的生長周期和毛發(fā)生長起重要調(diào)控作用[5]。VEGF是毛乳頭細胞分泌的多種生物活性因子中的一種，體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞能高水平表達VEGF。VEGF 及其受體的表達與毛細血管的形成有關，是與血管新生有關的最重要的靶基因之一[6]。在毛發(fā)生長周期中，VEGF 的表達和消失與毛球部血管的生成和消失保持一致[7]。有研究報道，VEGF通過誘導毛囊周圍血管形成而調(diào)控毛囊的周期性循環(huán)和促進毛發(fā)生長[8]。因此，對促進毛乳頭細胞分泌VEGF的研究是值得關注的。

UⅡ具有許多生理學效應，例如刺激平滑肌細胞、心肌成纖維細胞、腎系膜細胞等增殖，促進心肌成纖維細胞分泌纖維連接蛋白以及Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白[9]。文獻報道，UⅡ可誘導缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達VEGF，誘導外膜成纖維細胞分泌VEGF[10,11]，提示UⅡ很可能是促進毛乳頭細胞分泌VEGF的重要因子。

本實驗采用體外分離培養(yǎng)的大鼠毛乳頭細胞，檢測不同濃度UⅡ對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞分泌VEGF水平的影響。研究結果表明，10-6、10-7、10-8mol /L UⅡ可顯著促進毛乳頭細胞增殖，說明UⅡ對毛乳頭細胞具有促增殖作用，且呈時間依賴性。但UⅡ對毛乳頭細胞的促增殖作用沒有劑量依賴性，其原因可能是高濃度的UⅡ對毛乳頭細胞有一定毒性，影響了毛乳頭細胞的凋亡，因此只有適當濃度的UⅡ可促進毛乳頭細胞增殖。同時，10-6、10-7mol /L UⅡ處理毛乳頭細胞可明顯地干預VEGF表達，提示UⅡ被開發(fā)為一種新的促進毛發(fā)生長藥物的潛在可能性，其機制可能與促進毛乳頭細胞分泌 VEGF 從而促毛發(fā)生長有關。

毛乳頭細胞上可表達多種生長因子受體，如表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、肝細胞生長因子受體（HGF）、VEGF 受體等。下一步筆者將檢測UⅡ對其他生長因子受體分泌水平的影響，并集中研究UⅡ具體是通過哪一種信號通路對毛乳頭細胞的生長和增殖進行調(diào)節(jié)。