基于代謝組學的食管鱗狀細胞癌生物標志物篩選研究

朱海靜，許英，周娟，楊潔，李娜，徐冬云，朱斌

(1.火箭軍特色醫(yī)學中心藥劑科，北京 100088； 2.陸軍第七十一集團軍醫(yī)院 a.藥劑科，b.腫瘤科，江蘇 徐州 221004)

食管癌是一種常見惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高[1]。由于缺乏早期診斷的臨床生物標志物，食管癌確診時多為晚期，患者生存率低[2]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌的主要類型之一，與營養(yǎng)、不良飲食習慣等因素相關，已成為威脅我國人民健康的主要疾病之一[3]。高流通量、高分辨率技術主要對全球范圍內變化的代謝組進行定性或定量分析，并將其應用于各研究領域[4]。代謝組學旨在捕獲不同生物樣品中低分子量代謝物的生物信息，以提供生物體的詳細信息和當前狀態(tài)，已成為篩選有價值生物標志物或評價藥物毒性、藥效的有力工具[5-7]。質譜和核磁共振質譜是最常用的代謝分析儀，其中液相色譜-質譜具有良好的分離復雜生物樣品的能力，且靈敏度高[8-11]。超高效液相色譜綜合高分辨率軌道分析質譜(ultra-high performance liquid chromatography coupled with high resolution orbitrap mass spectrometry，UPLC-Orbitrap-MS)的代謝組學是尋找ESCC潛在生物標志物的可靠且有用的方法，是未來對生物標志物進行深入研究的基礎。本研究旨在篩選基于代謝組學的ESCC生物標志物，以期為ESCC的早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年5月陸軍第七十一集團軍醫(yī)院腫瘤科收治的12例ESCC患者的臨床病理標本作為研究對象，其中男10例、女2例，年齡56～78歲，平均(66.4±6.1)歲；病理分級：中等分化10例，低分化2例；臨床分期：Ⅱ期9例，Ⅲ期3例；患者均無吸煙、飲酒史。依據(jù)美國食管癌聯(lián)合委員會[12]確認所有組織標本的臨床病理分期，12例患者的臨床病理分期及基本情況見表1。本研究經解放軍陸軍第七十一集團軍醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 試劑包括HPLC級甲醇、乙腈、氯仿和甲酸(德國默克公司)，組織裂解液Ⅱ(德國Dusseldorf公司)，去離子水由純水儀(美國Millipore公司，型號Milli-Q50SP)制備。靜電場軌道阱質譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)，UPLC 3000系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2.2樣品收集和制備 經食管切除術獲得腫瘤及癌周組織，并經組織病理學確診ESCC。手術切除的腫瘤和癌周組織經液氮冷凍后，在-80 ℃固態(tài)二氧化碳條件下保存轉運至南京醫(yī)科大學。在代謝組學分析前，室溫下解凍所有樣品，將每個樣品組織各20 mg轉移到2 mL離心管中，向其中加入去離子水-乙腈-氯仿(2∶5∶2，v/v/v)萃取液1 mL，旋渦混合，隨后將組織裂解液Ⅱ在50 Hz頻率下混合15 min后，以離心加速度10 000×g離心10 min，取600 μL上清液用于分析。

表1 ESCC患者基本信息

1.2.3UPLC-Orbitrap-MS分析 代謝譜在配備有加熱電噴霧源的靜電場軌道阱質譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)上進行。分辨率設為7 000，采用全掃描模式(70～1 050 amu)，同時以正負模式采集。

代謝產物用UPLC 3000系統(tǒng)[美國Thermo Fisher Scientific公司，色譜柱為1.9 μm Hypersile GoldC18柱(100.0 mm×2.1 mm)]分離，樣品量5 μL。采用0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B)組成的多步梯度洗脫，15 min內將溶劑B從5%線性增加到95%，流速為0.4 mL/min。95%溶劑B洗滌洗脫柱2 min，在5%溶劑B中重新平衡。UPLC和OrbitRAP質譜儀系統(tǒng)均使用Xcalibur 2.2軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行數(shù)據(jù)分析。

1.3數(shù)據(jù)分析 對UPLC-Orbit RAP MS系統(tǒng)中的原始數(shù)據(jù)進行預處理。使用SIEVE軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)分析原始數(shù)據(jù)，包括同位素質量、保留時間、峰強度和可能的元素組成。生成的數(shù)據(jù)集導入SIMCA-P 13.0軟件(瑞典Umetrics公司)進行多變量統(tǒng)計分析和模式識別。利用主成分分析(principal component analysis，PCA)法將高維光譜簡化為包含大部分生物信息的2個或3個主成分，實現(xiàn)分類趨勢的可視化。運用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)得到變量重要性，反映每個變量對分類的相對貢獻，從而尋找腫瘤與相應正常組織之間的可鑒別變量[13-14]。

2 結 果

2.1代謝組學分析 對UPLC-Orbitrap-MS獲得的原始數(shù)據(jù)進行預處理，從腫瘤及相應正常組織中獲得5 172個特征(3 795為正離子模式，1 377為負離子模式)，對質量控制樣本進行PCA分析，根據(jù)樣本第一主成分得分繪制質量控制圖(圖1)，每個樣本的聚集結果(<2s)均可接受，分析過程的總體情況良好。對結果進行PCA和PLS-DA分析(圖2)，結果顯示組間明顯分離，表明腫瘤與正常組織代謝模式的差異顯著。得分圖顯示，在更復雜的多變量模型中，PLS-DA模型的分類和分離效果較PCA更佳。采用R2Y反映擬合優(yōu)度，Q2反映模型的可預測性，本研究PLS-DA模型的擬合度和預測值分別為0.990、0.763，兩者均>0.5。

2.2尋找判別變量 將多元統(tǒng)計分析的變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值與單因素統(tǒng)計分析的P值相結合，應用于顯著性差異變量的選擇。將VIP>1.0且P<0.05的變量作為候選判別變量，確定潛在生物標志物。

2 s為控制線，3 s為警戒線

2.3代謝物鑒定 以判別變量質荷比(m/z)和保留時間(tR)的形式進行定性分析，并確定為潛在的生物標志物。在代謝組學研究前建立一個內部代謝物庫，以便于后續(xù)鑒別代謝組學。本研究所建立的文庫包含493個真實的化學標準，在相同色譜和質譜條件下分析，所獲得數(shù)據(jù)與文庫中化學標準具有可比性。對已獲得的數(shù)據(jù)進行分析，候選生物標志物見表2，代謝物的保留時間變化見表3。應用代謝譜熱圖像顯示相應正常組織和腫瘤組織之間各候選生物標志物的總體趨勢，見圖3。

2a：主成分分析得分圖；2b：偏最小二乘判別分析得分圖

表2 鑒別ESCC和正常黏膜的代謝產物統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析結果

表3 已鑒定代謝物的保留時間偏移

續(xù)表3

2.4潛在的診斷性生物標志物的表征 采用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC曲線)對潛在生物標志物的鑒別能力進行深入

Corresponding normal tissue：相應的正常組織；Tumor tissue：腫瘤組織；Low：低；High：高；Proline：脯氨酸；LysoPC：溶血磷脂膽堿；Creatinine：肌氨酸酐；L-Glutamine：L-谷氨酰胺；Methionine：甲硫氨酸；Choline：膽堿；Citicoline：胞磷膽堿；Decanoylcarnitine：癸酰肉堿；Phenylalanine：苯丙氨酸；β-hydroxybutyrate：β-羥丁酸；Octanoylcarnitine：辛烷酰肉堿；Valine：纈氨酸；Nonanoylcarnitine：壬酰肉堿； Uric acid：尿酸；Undecanoylcarnitine：十一烷基肉堿；Lactulose：乳果糖；Asparagine：天冬酰胺酸；Carnitine：肉毒堿；Oxoglutaric acid：酮戊二酸；Cholic acid：膽酸；Citric acid：檸檬酸；Linoleic acid：亞油酸；LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺；紅色：高水平代謝物；綠色：低水平代謝物

評價分析，根據(jù)曲線下面積(area under curve，AUC)將代謝產物排序，制作熱圖并證明每種潛在生物標志物的辨別能力，將AUC>0.85的代謝物作為簡化組，進一步評價其辨別力，該代謝組學小組的AUC值為0.937，表明鑒別能力優(yōu)于任何單一代謝物，見圖4。

3 討 論

代謝組學在腫瘤診斷及其機制研究中具有重要意義，有助于更好地理解ESCC的代謝組學。研究顯示，與癌周組織相比，腫瘤組織中的溶血素水平異常，通過溶血磷脂酶A1，溶血卵磷脂能被代謝為不同種類的脂肪酸，并通過線粒體中的β氧化水解產生必要的能量[15]。此外，溶血磷脂酶D還可以轉化為溶血磷脂酸，在促進細胞增殖中起重要作用，研究表明，腫瘤的發(fā)生與正常細胞的異常增殖密切相關[16-17]。本研究對12例ESCC患者的活檢標本和相應的正常組織進行非靶向代謝組學研究，并進行模式識別分析對兩組間的代謝譜進行分類，這些潛在的生物標志物主要包括氨基酸代謝、磷脂生物合成、能量代謝和脂肪酸代謝等，根據(jù)溶血磷脂水平下調及其分解代謝作用，推測溶血磷脂酶D過表達引起的溶血磷脂減少，導致溶血磷脂酸增加，進而參與腫瘤的發(fā)生。

ROC：受試者工作特征曲線；AUC:曲線下面積；LysoPC：溶血磷脂膽堿；Carnitine：肉毒堿；Citicoline：胞磷膽堿；L-Glutamine：L-谷氨酰胺；Choline：膽堿；Lactulose：乳果糖；Citric acid：檸檬酸；β-hydroxybutyrate：β-羥丁酸；Phenylalanine：苯丙氨酸；Linoleic acid：亞油酸；Methionine:甲硫氨酸；Proline：脯氨酸；Creatinine：肌氨酸酐；Valine：纈氨酸；Cholic acid：膽酸；Decanoylcarnitine：癸酰肉堿；Oxoglutaric acid：酮戊二酸；LysoPE:溶血磷脂酰乙醇胺；Asparagine：天冬酰胺酸；Uric acid：尿酸；Undecanoylcarnitine：十一烷基肉堿；Octanoylcarnitine：辛烷酰肉堿；Nonanoylcarnitine：壬酰肉堿

與癌周組織相比，腫瘤組織中肉堿水平升高，而腫瘤細胞中的肉堿(去氧基肉堿、辛基肉堿、壬基肉堿、十一烷基肉堿)水平降低。據(jù)報道，肉堿及其分解代謝物(包括酰基肉堿)參與能量代謝，影響細胞能量的分布，并在線粒體脂肪酸轉運中起重要作用[18]。在此過程中，通過?；o酶A的酯化將肉堿分解為?；鈮A，因此，?；o酶A脫氫酶的缺乏或活性降低可引起?；鈮A下調和肉堿上調[19]。另有實驗研究顯示，通過肉堿的代謝紊亂可以進一步研究酰基-輔酶A脫氫酶的活性[20]。

加速細胞增殖可導致膜磷脂代謝紊亂[21]。本研究中，膽堿水平降低，且主要分解代謝產物甲硫氨酸水平也顯著降低。甲硫氨酸作為跨甲基化反應的中間體，是體內的主要甲基供體，能夠為肌酸提供甲基，參與膽堿的代謝[22-23]。膽堿及其主要代謝產物的水平可反映腫瘤組織中的異常磷脂代謝，故推測其具有診斷ESCC的潛在價值。

谷氨酰胺調節(jié)異常與ESCC腫瘤脂質代謝異常有關，在癌細胞增殖中，為滿足細胞代謝的需要，脂肪的需求量增加，由于細胞增殖加速，對膜脂生物合成的需求增加，脂肪酸代謝被激活[24]。本研究中，6種氨基酸代謝產物均與食管癌的代謝紊亂相關，且β-羥丁酸水平異常與上述脂肪酸代謝失調及相關纈氨酸顯著下調有關。腫瘤細胞增殖速率加快可引起機體能量代謝升高，增加檸檬酸和酮戊二酸分解，從而生成更多ATP[25]，本研究結果與其一致。

總之，本研究利用UPLC-Orbitrap-MS平臺進行非靶向代謝組學實驗，通過與內部文庫進行對比，發(fā)現(xiàn)并鑒定出26種代謝產物，并通過UPLC-Orbitrap-MS為基礎的代謝組學方法尋找ESCC潛在生物標志物，為ESCC的臨床診斷及其發(fā)病機制研究提供了相關依據(jù)。