細(xì)胞因子檢測在急性移植物抗宿主病診治中的臨床應(yīng)用

細(xì)胞因子是一組激素樣多肽介體，在介導(dǎo)宿主免疫防御中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子可由不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，起到細(xì)胞間信號傳遞、增強或抑制目標(biāo)細(xì)胞增殖、分化、活化和運動的作用。

造血干細(xì)胞移植(HSCT)是治療血液系統(tǒng)疾病的重要手段之一。移植物抗宿主病(GVHD)是移植后的常見并發(fā)癥，是引起HSCT后死亡的重要原因。GVHD是指患者在接受造血干細(xì)胞移植后，由于供體移植物中的免疫活性細(xì)胞T淋巴細(xì)胞與體內(nèi)組織間發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致受體的靶組織或靶器官受損。臨床上GVHD可分為移植后100 d以內(nèi)及100 d之后的急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)。研究發(fā)現(xiàn),輔助T淋巴細(xì)胞中Th1和Th2亞群所分泌的細(xì)胞因子失衡會導(dǎo)致GVHD的發(fā)生，從而對該疾病的分層診斷、預(yù)后判斷及靶向治療產(chǎn)生影響。因此，對于患者體內(nèi)特異性細(xì)胞因子的檢測分析可能會為GVHD的防治提供線索和思路[1]。

由于GVHD不僅會引起全身性免疫疾病，而且還會影響皮膚、胃腸道和肝臟等的功能。aGVHD引起的不同靶器官受損的臨床癥狀缺乏特異性，需要與感染、藥物等其他原因相鑒別。血清生物學(xué)標(biāo)志物檢查是一種簡便易行的aGVHD診斷和評估的重要手段，其生理學(xué)研究也有利于進(jìn)一步了解aGVHD的發(fā)病機(jī)制。因此，利用生物標(biāo)志物，特別是具有特異性的細(xì)胞因子在aGVHD的診斷、預(yù)后評估及靶向治療方面值得深入探索。目前，關(guān)于aGVHD的細(xì)胞因子研究相對較多，本文對此進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞因子檢測在aGVHD診斷中的價值

aGVHD按3個靶器官受損程度分為Ⅰ～Ⅳ度。aGVHD首先出現(xiàn)的免疫反應(yīng)發(fā)生在移植后的幾周內(nèi)，對于重度的aGVHD若能進(jìn)行早期診斷和干預(yù)，會減輕靶器官的損傷，并提高移植成功率。病理活檢是一項有創(chuàng)檢查，雖然作為診斷GVHD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是臨床上大多數(shù)患者無法耐受該項檢查，所以能篩選出早期診斷aGVHD及預(yù)測aGVHD發(fā)生嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物尤為重要。目前研究集中在具有預(yù)測性的生物標(biāo)志物上，但生物標(biāo)志物能否替代進(jìn)行診斷還需臨床研究的不斷佐證，以下幾種細(xì)胞因子目前比較受關(guān)注。

1.1腫瘤壞死因子α(TNF-α) TNF-α在aGVHD的作用機(jī)制是通過一連串的放大效應(yīng)，激活供體T細(xì)胞，引起一系列“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，從而對宿主靶組織或靶器官產(chǎn)生直接殺傷毒性，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體的損傷。MIR等[2]通過對比aGVHD的患者與移植后未表現(xiàn)aGVHD患者之間的內(nèi)皮損傷程度并檢測TNF受體1(TNFR1)后發(fā)現(xiàn)，從移植后的第7天開始，TNFR1水平能夠預(yù)測該并發(fā)癥的發(fā)生。在發(fā)生aGVHD的患者中，若TNFR1持續(xù)高表達(dá)，可考慮行TNF-α預(yù)防性的阻斷治療，以降低重度aGVHD的發(fā)生率。同時，研究表明，TNFR1對提示患者是否存在激素耐藥狀態(tài)有一定的參考價值[3]。但單獨的TNFR1作為診斷aGVHD的依據(jù)尚不足以準(zhǔn)確預(yù)測疾病的發(fā)生，而將其與其他生物標(biāo)志物組合之后的系統(tǒng)評估可能會增強其作為診斷依據(jù)的能力[1]。

1.2白細(xì)胞介素2受體(IL-2R) 研究表明，aGVHD的發(fā)生是由于預(yù)處理引起的腸道黏膜損傷，使脂多糖(LPS)從腸道進(jìn)入外周并誘發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，造成受者體內(nèi)產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子釋放，受者體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞(APC細(xì)胞) 激活，并為供者T淋巴細(xì)胞的激活提供共刺激信號，進(jìn)而增強供者T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，形成組織炎癥，最終導(dǎo)致靶器官損傷[4]。由于炎性細(xì)胞因子在激活T淋巴細(xì)胞中起重要作用，激活的T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R。有研究顯示，IL-2和可溶性IL-2R(sIL-2R)在GVHD的發(fā)病機(jī)制中均起著核心作用，在移植后出現(xiàn)疾病的患者中，其血液中早期的sIL-2R水平與Ⅱ～Ⅳ級GVHD和移植相關(guān)死亡的發(fā)生率密切相關(guān)[5]。同時，BERGER等[6]研究證明，IL-2R和肝細(xì)胞生長因子(HGF)與Ⅱ～Ⅳ級和Ⅲ～Ⅳ級aGVHD發(fā)生相關(guān)，大多數(shù)發(fā)展為重度aGVHD的患者在其移植后早期即可顯示出高水平的sIL-2R，表明移植早期sIL-2R水平可以作為aGVHD嚴(yán)重程度的預(yù)判指標(biāo)。

1.3腫瘤抑制素2 (ST2) ST2是IL-1 受體家族的新成員，也稱為IL-33受體(IL-33R)，目前其唯一已知的配體是IL-33[7]。而ST2基因通過交替剪接產(chǎn)生2種不同的產(chǎn)物,即膜結(jié)合型(mST2)和可溶型(sST2)。mST2主要表達(dá)于造血細(xì)胞中，特別在Th2介導(dǎo)的疾病(如哮喘)中起重要作用。sST2可作為IL-33的誘騙受體，驅(qū)動Th2細(xì)胞向Th1細(xì)胞變化，這些機(jī)制能更加清晰地解釋aGVHD的病理、生理發(fā)展過程[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，ST2可進(jìn)一步在不同嚴(yán)重程度的aGVHD患者中不受其他因素影響而表現(xiàn)出獨特的差異性[7]。因此，MCDONALD等[9]將發(fā)生aGVHD的患者，以sST2的不同表達(dá)水平分為4組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有較高表達(dá)水平的sST2患者和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD患者的非復(fù)發(fā)死亡(NRM)顯著增高，同時，高表達(dá)水平的sST2患者NRM也顯著高于低表達(dá)水平的sST2患者。VANDER等[8]研究顯示，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，將高ST2水平鑒定為與難治性aGVHD最相關(guān)的生物標(biāo)志物。所以，sST2可以作為確診重度aGVHD和預(yù)測NRM的重要生物標(biāo)志物。

1.4干細(xì)胞生長因子(HGF) HGF最初被鑒定為是一種可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的有絲分裂原。HGF是受體酪氨酸激酶c-met原癌基因產(chǎn)物的配體，是一種多功能生長因子，可影響多種細(xì)胞。同時，HGF也具有多種生物學(xué)作用，包括促進(jìn)有絲分裂、抗凋亡、血管生成等[10]。通過對不同嚴(yán)重程度的GVHD患者的血清進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不僅在發(fā)生aGVHD的患者中HGF存在顯著差異，而且血清HGF可預(yù)測aGVHD的發(fā)病嚴(yán)重程度及1年NRM[11]。所以通過對移植后患者HGF水平的連續(xù)檢測，可以有效預(yù)測患者GVHD的發(fā)病嚴(yán)重程度，便于進(jìn)行及時干預(yù)。

1.5皮膚源性彈性蛋白酶抑制劑(SKALP) SKALP是由介導(dǎo)GVHD的炎性因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的。最早被發(fā)現(xiàn)在發(fā)炎的表皮過表達(dá)。MAHABAL等[12]研究顯示，利用免疫組織化學(xué)法檢測技術(shù)，通過連續(xù)6個月對行HSCT的患者進(jìn)行診斷分析關(guān)于皮膚相關(guān)aGVHD的SKALP水平變化后發(fā)現(xiàn)，SKALP預(yù)測aGVHD的靈敏度和特異度分別為100%和75%。SKALP也是區(qū)分皮膚相關(guān)aGVHD與其他皮疹疾病(如病毒、藥物等引起)的最優(yōu)鑒別因子[13]。而且，SKALP在皮膚相關(guān)aGVHD患者中的水平會隨著其臨床診斷評分的增加而上升[14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在接受移植后100 d內(nèi)的相同時間點，對是否有aGVHD表現(xiàn)的患者血清進(jìn)行分析，其血清中的SKALP水平并未發(fā)現(xiàn)顯著差異，該研究認(rèn)為SKALP是皮膚相關(guān)aGVHD的特定生物標(biāo)志物，因為并非所有aGVHD患者都有皮膚癥狀，并且一些沒有aGVHD的皮疹患者也顯示SKALP高表達(dá)[3]。說明SKALP在皮膚相關(guān)aGVHD患者血漿中的水平可以較特異地預(yù)示患者的嚴(yán)重程度。

1.6轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β) 研究發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者血液TGF-β水平有所降低[15]。有研究通過對不同GVHD分級的患者血漿進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者TGF-β總水平下降，其中Ⅲ～Ⅳ級aGVHD患者的TGF-β水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ級 aGVHD患者，表明TGF-β可作為aGVHD嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)[3]。在患者造血干細(xì)胞移植早期，供體T淋巴細(xì)胞中的Treg是TGF-β的主要來源，并且能夠以TGF-β依賴性的方式減弱aGVHD的臨床表現(xiàn)。但尚不清楚較低水平的TGF-β是否由aGVHD中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的減少引起，因為供體來源的Treg不是TGF-β的唯一來源[15]，所以，一般不將TGF-β作為aGVHD診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物使用。

1.7內(nèi)毒素受體Toll 樣受體4(TLR4) Toll樣受體(TLR)是表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)表面的一系列跨膜蛋白。TLR4是內(nèi)毒素LPS識別多種類型的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的生物分子，可誘導(dǎo)核因子κB(NF-κB)信號通路，是T淋巴細(xì)胞活化和分化所必需的刺激分子(如促炎性細(xì)胞因子TNF-α)，最終可觸發(fā)GVHD的發(fā)生[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在不同程度的aGVHD患者中有顯著差異，可作為評價aGVHD嚴(yán)重程度的指標(biāo)[3]。通過對激素耐藥型aGVHD患者和激素敏感型aGVHD患者進(jìn)行對比研究發(fā)現(xiàn)，TLR4也有顯著差異。所以，TLR4作為生物標(biāo)志物對aGVHD患者的診斷可能具有較大意義。

2 細(xì)胞因子檢測在GVHD預(yù)后評估中的作用

HSCT是血液腫瘤最有效的治療方法之一，雖然HSCT可以誘導(dǎo)移植物抗腫瘤/白血病(GVT/L)效應(yīng)，但GVHD是患者整體生存(OS)的不利因素，甚至導(dǎo)致死亡，GVHD是移植患者非復(fù)發(fā)死亡的重要原因。由于生物標(biāo)志物在GVHD的診斷中具有重要的參考價值，生物標(biāo)志物研究也成為評估預(yù)后的研究方向之一。

有研究收集492例aGVHD患者，使用競爭風(fēng)險回歸等統(tǒng)計學(xué)方法，將TFNR1、ST2和再生胰島衍生蛋白3α(REG3α)的表達(dá)水平模擬分為3種預(yù)測分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)可以有效預(yù)測出不同患者在完全緩解(CR)或部分緩解(PR)情況下對治療的反應(yīng)、NRM及OS[19]。但其研究的局限為當(dāng)評分處于極端值時(評分為1或3)，該算法對疾病預(yù)后相關(guān)評估的可靠性受到限制。

對于上述預(yù)后評估算法中涉及的細(xì)胞因子，均涉及胃腸道相關(guān)癥狀的部分發(fā)生機(jī)制。其中TNF-α參與機(jī)制在上一部分的描述中已有提及，由于移植或預(yù)處理等因素介導(dǎo)受體產(chǎn)生促炎因子，其中也包括抗原呈遞細(xì)胞(APC)的生成增多，繼而供體T淋巴細(xì)胞于宿主APC反應(yīng)后激活，使得細(xì)胞內(nèi)生化級聯(lián)反應(yīng)增強而導(dǎo)致TNF-α等大量的Th1細(xì)胞因子增加。最后這些細(xì)胞因子進(jìn)一步與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等發(fā)生協(xié)同作用而對局部組織產(chǎn)生損傷。在這類細(xì)胞因子中，TNF-α對胃腸道形成特異性損傷，通過對TNF-α的抑制可以明顯減輕GVHD小鼠模型中胃腸道相關(guān)癥狀的嚴(yán)重程度。sST2的分泌水平在胃腸道相關(guān)癥狀中的表現(xiàn)多與炎癥性腸病的發(fā)病水平類似[20]，sST2可以作為IL-33誘騙受體從而阻斷IL-33在其相關(guān)疾病中的信號傳導(dǎo)。而Treg在腸道中大量存在，并且可以防止在自身和環(huán)境中對炎性反應(yīng)失調(diào)。但在慢性腸道炎癥期間，大量存在的sST2可能通過抑制IL-33參與的信號傳導(dǎo)來抑制Treg的產(chǎn)生，并將進(jìn)一步減弱對疾病的自身調(diào)控作用[21]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，參與aGVHD病理、生理變化過程的細(xì)胞因子在一定程度上可以反映疾病的預(yù)后情況。但是由于樣本量或多因素相關(guān)分析的相互干擾，使得單一種類的細(xì)胞因子對疾病的診斷或預(yù)后評價受到限制。因此，應(yīng)用細(xì)胞因子組合來提高特異度是一種有效的解決方法。采用TFNR1、ST2和REG3α相關(guān)的算法作為評分來預(yù)測疾病的NRM，不僅可以區(qū)分GVHD患者的嚴(yán)重程度，還可以預(yù)測是否有相關(guān)的靶器官損傷[19]。有研究通過對40例接受異源性HSCT治療的患者，分別在表現(xiàn)出aGVHD(n=20)和無aGVHD(n=20)的2組患者血清中比較發(fā)現(xiàn)，由SKALP、TLR4、TGF-β和TNFR1組成的評估小組不僅可用于aGVHD診斷及患者臨床表現(xiàn)分級，也可以預(yù)測表現(xiàn)出aGVHD的患者在接受激素治療后是否表現(xiàn)為靈敏[19]。未來對于細(xì)胞因子等生物標(biāo)志物的研究，可以聚焦提高診斷的特異度，提前預(yù)測疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和指導(dǎo)疾病靶向治療，最終推動精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

3 細(xì)胞因子作為靶點在aGVHD的治療現(xiàn)狀

糖皮質(zhì)激素是aGVHD的一線治療方案，而糖皮質(zhì)激素治療失敗后產(chǎn)生激素耐藥型的aGVHD(SR-aGVHD)尚無統(tǒng)一的二線治療方案。在一項GVHD效應(yīng)相關(guān)的多種細(xì)胞因子靶向單抗或免疫抑制劑進(jìn)行aGVHD治療的報道中，緩解率約為60%[22]，表明SR-aGVHD的治療取得了進(jìn)展。

當(dāng)患者發(fā)生aGVHD時，供體的T淋巴細(xì)胞與其體內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合導(dǎo)致供體的反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞被激活并增殖，然后轉(zhuǎn)移至靶器官和靶組織，同時伴隨著大量的細(xì)胞因子釋放從而加重aGVHD的過程。IL-2是Th1細(xì)胞因子中的“骨干”，其作用主要包括免疫反應(yīng)的擴(kuò)增、T細(xì)胞及NK細(xì)胞的活化、巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌和皮膚、胃腸道的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，使用高劑量IL-2治療的aGVHD小鼠較低劑量治療小鼠的病死率更高。KENNEDY-NASSER等[23]研究發(fā)現(xiàn),如果使用超低計量(10×104/U)IL-2進(jìn)行治療可明顯增加體內(nèi)的CD4+CD25+FoxP3+Treg，而不會引起GVHD或使細(xì)胞介導(dǎo)的對病毒或白血病抗原的反應(yīng)能力喪失，而同時擴(kuò)增的Treg細(xì)胞可產(chǎn)生有效的免疫抑制作用，降低供體反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活化引發(fā)的aGVHD損傷[24]。作為另外一種Th1細(xì)胞因子，IL-10可通過下調(diào)IL-2來調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞的功能，影響GVHD的發(fā)病過程。WEBER等[25]研究發(fā)現(xiàn)，IL-10敲除的宿主小鼠的生存時間較對照組更短。在對GVHD進(jìn)行治療時，已有研究證明使用TNF-α拮抗劑可減弱炎性反應(yīng)，不會影響植物抗白血病效應(yīng)[26]。同時，在使用抗TNF-α單克隆抗體英夫利昔單抗時，有研究發(fā)現(xiàn)，英夫利昔單抗治療類固醇難治性aGVHD的療效，總體反應(yīng)率為15%～100%，在胃腸道和皮膚aGVHD中觀察到最高的反應(yīng)率[27]。所以，SR-aGVHD的患者接受抗TNF-α單克隆抗體治療可以起到不錯的效果[28]。

sST2作為GVHD的預(yù)后生物標(biāo)志物可預(yù)測SR-aGVHD的非復(fù)發(fā)死亡率[8]。RAMADAN等[29]研究發(fā)現(xiàn)，使用人源性T淋巴細(xì)胞注入經(jīng)過300 cGy全身照射(TBⅠ)預(yù)處理的NSG小鼠模型中，檢測人sST2在血清中的水平。通過使用不同計量的小分子ST2抑制劑(ⅠST2)與使用二甲基亞砜的對照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除了高水平(40 mg/kg)實驗組及對照組外，低、中水平(5、10 mg/kg)實驗組使用ⅠST2后可降低sST2的水平。并且，GVHD評分可同時降低，存活率顯著提高，可以維持移植物抗白血病效應(yīng)。同時，該研究小組在另一項研究中也發(fā)現(xiàn)，在建立aGVHD的小鼠模型中，對比只接受輻射或接受同源T淋巴細(xì)胞的對照組，其血清sST2水平與人類患者相似[20]。他們使用了針對鼠類ST2(抗ST2單抗,CNT03914)和適當(dāng)?shù)膶φ胀N型Ab(ⅠgG)的單克隆抗體同時對建立aGVHD的小鼠模型進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)在抗ST2 單抗治療的小鼠中，小腸、大腸和肝臟(主要aGVHD靶器官)的組織病理學(xué)評分均顯著改善，同時其存活率也顯著提高。

通過將轉(zhuǎn)染了人類HGF cDNA的HVJ脂質(zhì)體(HGF-HVJ脂質(zhì)體)反復(fù)注入出現(xiàn)aGVHD的小鼠模型，HGF基因表達(dá)后，aGVHD的表現(xiàn)可受到抑制。通常認(rèn)為，HGF對于預(yù)防腸道GVHD發(fā)揮重要作用，主要通過以下機(jī)制來影響aGVHD的進(jìn)展：IL-2作為誘導(dǎo)GVHD中Th1相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在移植期間阻斷IL-12的產(chǎn)生，降低供體移植物的排異反應(yīng)。而最初來自于供體的同種反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞會誘導(dǎo)胃腸道上皮的損傷，這將引發(fā)腸腔的內(nèi)毒素進(jìn)入黏膜和黏膜下層組織并進(jìn)入全身循環(huán)。釋放入血的內(nèi)毒素將進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞分泌IL-12，進(jìn)而刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素。同時，γ干擾素也使受到內(nèi)毒素刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-12。而研究表明， HGF通過抑制GVHD小鼠IL-12水平發(fā)揮對腸上皮細(xì)胞的抗凋亡作用來防止胃腸道aGVHD損傷[30]。

4 展 望

細(xì)胞因子作為特異性生物標(biāo)志物已經(jīng)被應(yīng)用于aGVHD的診斷、預(yù)后評估及靶向治療。因其檢測便利性和技術(shù)手段不斷提升，可以利用細(xì)胞因子的優(yōu)勢來彌補傳統(tǒng)方法診斷的滯后性，減少誤診、漏診率。但是，也應(yīng)該看到，細(xì)胞因子檢測在aGVHD上還需要提升其特異度和靈敏度，與感染等疾病進(jìn)行有效鑒別；尋找更加簡便易行的細(xì)胞因子組合等。同時，由于統(tǒng)計學(xué)手段的提升，可以很大程度地推進(jìn)現(xiàn)階段對疾病診療模式的探索，在疾病發(fā)展的早期進(jìn)行診斷，通過提前干預(yù)減緩或終止疾病的進(jìn)展，從而減輕因疾病帶來的損傷。細(xì)胞因子作為具有前景的研究方向，值得在aGVHD領(lǐng)域進(jìn)一步深入研究。