外泌體在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的研究進展與應(yīng)用

劉小柳，吳柏?zé)簦瑥?鑫，曾曉嫚 綜述，鄭 磊△ 審校

1.深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518001；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510515；3.廣州三九腦科醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510510

中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤在臨床上是預(yù)后最差的腫瘤疾病之一，其中惡性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率約占腦部腫瘤的1/2,臨床上惡性膠質(zhì)瘤患者的中位生存期只有14～17個月[1]。目前，臨床上GBM的治療手段主要為手術(shù)切除、放療和化療等方法，但仍有約2/3的患者在治療10個月內(nèi)復(fù)發(fā)，5年生存率僅為5%[2]。GBM是一種高突變率、高異質(zhì)性、高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)的腫瘤，通常患者確診時已處于中晚期，此外由于血腦屏障、手術(shù)造成大腦創(chuàng)傷等原因?qū)е屡R床上GBM的治療效果不佳[3]，因此，針對GBM尋找疾病早期的生物標志物具有重要臨床意義。

細胞外囊泡(EVs)是一種由多種細胞分泌的雙層膜性囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，可介導(dǎo)細胞間物質(zhì)/信息傳遞、細胞增殖分化、血管形成、免疫調(diào)節(jié)等過程，廣泛存在于細胞上清液及多種體液(尿液、唾液、腹水、羊水、母乳、腦脊液、關(guān)節(jié)液)中，相較于循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)與循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，EVs具有穩(wěn)定性高、數(shù)量級大、取材方便等特點，有望成為一種新型的疾病診斷標志物[4-6]。EVs主要分為外泌體(補充)、微囊泡和凋亡小體三大類[4]。其中，外泌體是由多囊泡體與細胞膜融合形成，呈杯狀/雙凹碟狀，直徑為30～150 nm，浮力密度為1.11～1.18 g/mL，研究表明這一類小粒徑的EVs被認為與多種疾病(如腫瘤、心血管疾病、阿爾茨海默病等)有關(guān)[5]。

目前，檢測外泌體的相關(guān)技術(shù)主要包括外泌體的分離富集與鑒定，分離富集方法主要有差速超速離心法、密度梯度超速離心法、免疫分離法、聚合沉淀法、切向流超濾法、尺寸排阻色譜法和微流控芯片分離法等[7]。差速超速離心法是提取EVs的“金標準”[6]，微流控技術(shù)憑借其所需樣品量小，分離和檢測集成化，靈敏度高等優(yōu)勢開始被臨床使用。外泌體的鑒定包括通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡及隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡等對其形態(tài)學(xué)表征進行鑒定；利用納米粒子追蹤分析與動態(tài)光散射對其濃度/徑粒進行實時分析[7]；利用免疫蛋白印跡法對其特異性蛋白分子進行鑒定；利用拓撲技術(shù)對其累加組分進行鑒定[8]。

腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤中具有自我更新和異質(zhì)性分化能力的細胞亞群[9]，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療后復(fù)發(fā)中扮演重要角色。CSCs功能的執(zhí)行依賴其周圍微環(huán)境的信號刺激，CSCs微環(huán)境的破壞可損傷其自我更新功能，從而抑制腫瘤的生長，CSCs的存在是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的主要原因；外泌體及其內(nèi)包含的生物信號分子，被認為是GSCs與腫瘤微環(huán)境間的“信息通訊使者”，是重要的生物標志物和治療載體[10-12]。因此，探討外泌體在CSCs微環(huán)境中信息交流的作用，以及其產(chǎn)生的生物學(xué)后果對神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷與治療至關(guān)重要。本文將對外泌體在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的作用和在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究進展進行簡要綜述。

1 外泌體在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的作用

膠質(zhì)瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、血管周細胞、細胞外基質(zhì)、固有免疫細胞(小膠質(zhì)細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞)、T淋巴細胞、神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞等多種類型細胞組成的。其中膠質(zhì)瘤細胞來源的外泌體可以“馴化”其他鄰居細胞，誘導(dǎo)其自身特性發(fā)生改變，從而促進腫瘤細胞的生長[10]。GBM與周圍的非癌細胞相互作用，以維持有利于腫瘤增殖、腫瘤侵襲、血管生成、免疫抑制及腫瘤耐藥的微環(huán)境，涉及多種通信模式，例如可溶性因子，間隙連接通信。

由腫瘤細胞外泌體攜帶和釋放的生物分子不但包括可溶性蛋白，還包括可改變受體細胞中基因表達的多種編碼和非編碼RNA[11]，蛋白質(zhì)和miRNA可以誘導(dǎo)受體細胞表型修飾和細胞外基質(zhì)重塑[12]，從而在腫瘤細胞的生長中發(fā)揮作用。

1.1外泌體與細胞外基質(zhì) 膠質(zhì)瘤的形成和侵襲遷移的主要生物學(xué)過程與細胞外基質(zhì)重塑有關(guān)[13]。細胞外基質(zhì)是一種高度動態(tài)的結(jié)構(gòu)，其重塑受融合素樣金屬蛋白酶(MMP)與基質(zhì)MMP的調(diào)節(jié)，后者有助于基底膜的降解并通過細胞內(nèi)骨架重排，致使細胞外基質(zhì)降解、重塑，MMP表達變化與膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)分級相關(guān)[14]。據(jù)研究顯示，由膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的EVs含有MMP-2明膠酶、pro-MMP-9和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子2，具有促進血管生成的作用[15-20]。

1.2外泌體對單核細胞和巨噬細胞的影響 浸潤性單核細胞是GBM微環(huán)境中是最普遍的細胞類型，也被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞[15]，GBM引起的血腦屏障破壞導(dǎo)致單核細胞浸潤，隨后可分化為巨噬細胞，在膠質(zhì)母細胞瘤的炎性反應(yīng)中，巨噬細胞所占比例為20%，分為M1和M2 2種表型[21]，具有經(jīng)典M1表型的巨噬細胞具有吞噬、促進抗原表達和促炎作用，M2型則失去其促炎和抗腫瘤作用，具有促進腫瘤侵襲和腫瘤內(nèi)血管生長的作用，從而使環(huán)境有利于腫瘤細胞生長[22]。研究表明，在GBM細胞系U87和GSCs釋放的EVs中分離出的外泌體，主要靶向單核細胞以誘導(dǎo)肌動蛋白細胞骨架的重組和免疫抑制性M2表型，并分泌單核細胞趨化蛋白3、趨化因子CXC基序配體1(CXCL1)，以及程序性死亡配體1(PD-L1)[16]。單核細胞PD-L1的表達可能是癌癥誘導(dǎo)的免疫逃逸的表型改變，PD-L1的存在可與活化T淋巴細胞的程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)結(jié)合以抑制T淋巴細胞功能[23-24]，也可參與巨噬細胞的激活，導(dǎo)致巨噬細胞在異常條件下的過度增殖[25]。

1.3外泌體對星形膠質(zhì)細胞的影響 星形膠質(zhì)細胞作為大腦中固有的先天免疫細胞，可有助于防御病原體的刺激[26]，腫瘤周圍的星形膠質(zhì)細胞可促進GBM的進展。有研究表明，由GBM釋放的EVs可驅(qū)動星形膠質(zhì)細胞的腫瘤支持作用，源于患者的GBM的EVs培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞可促進腫瘤生長，同時表皮成長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子，趨化因子(CXCL1、CXCL19、CXCL110、CXCL111)、趨化因子CC基序配體、MMP9、可以誘導(dǎo)免疫抑制的細胞因子(CSF-2、CSF-3)、白細胞介素(IL)-4、IL-10和IL-13等在體內(nèi)也可促進GBM的入侵和擴增[27-28]。研究表明GBM的EVs可以修飾周邊星形膠質(zhì)細胞以誘導(dǎo)腫瘤支持功能，還可以驅(qū)動星形膠質(zhì)細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化從而致癌[27-28]。

1.4外泌體對GBM干細胞的影響 KIM等[19]指出間充質(zhì)干細胞對多種惡性腫瘤生長具有明顯的抑制作用。經(jīng)間充質(zhì)干細胞移植后，可趨向腦內(nèi)膠質(zhì)瘤部位，進而通過旁分泌MSC-EVs等因子來調(diào)節(jié)腫瘤細胞微環(huán)境，從而抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。直接MSC-EVS靜脈注射可以代替間充質(zhì)干細胞移植，對膠質(zhì)瘤起到抑制生長的作用。

GBM包含類似于間充質(zhì)干細胞的基質(zhì)細胞，其通過依賴于IL-6分泌的機制參與了GSCs致瘤性，F(xiàn)IGUEROA[20]等研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)標本中的GBM間充質(zhì)干細胞可釋放EVs，通過轉(zhuǎn)移miR-1587來增加GSC的增殖和克隆性，這反過來又導(dǎo)致腫瘤抑制因子NCOR1(核激素)的表達下降，PALUMBO等[21]證明GSCs釋放了可以誘導(dǎo)GBM細胞成瘤作用的EVs，由GSC釋放的EVs對黏附的GBM細胞系U87MG的細胞生長和遷移具有刺激作用。用細胞黏附分子L1CAM修飾的GSC衍生的EVs也能夠誘導(dǎo)不同類型的GBM細胞系的運動性，增殖和侵襲性。RICKLEFS等[22]證明了由GSCs釋放的EVs保留了腫瘤亞型特征，并且它們在GSC亞型之間的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致靶GSC的致瘤性改變。

GBM相關(guān)的人間充質(zhì)干細胞外泌體中的miR-1587被受體CSCs攝取后通過下調(diào)腫瘤抑制基因NCOR1的表達來提高CSCs的致瘤性[23]。綜上所述，外泌體在GSCs微環(huán)境中對CSCs與腫瘤細胞動態(tài)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，維持GSCs群的穩(wěn)定，為腫瘤的生存和發(fā)展提供有效保障。

1.5外泌體與腫瘤血管生成 周圍血管中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供給有利于腫瘤的生長，腫瘤可以改造其微環(huán)境至有利于創(chuàng)建自己的血管系統(tǒng)。其中，CSCs可以通過分泌促血管生成因子如VEGF、SDF-1α、IL-8和CXCR-4來誘導(dǎo)血管的生成[24]，也可通過分泌外泌體被內(nèi)皮細胞攝取促進新血管生成。在膠質(zhì)母細胞瘤中，SUN等[25]發(fā)現(xiàn)GSCs的外泌體中的miR-21通過激活內(nèi)皮細胞miR-21/VEGF/VEGFR2信號通路促進血管生成，膠質(zhì)瘤干細胞來源的外泌體可以提高血管內(nèi)皮細胞的增殖能力，促進內(nèi)皮細胞遷移，表明在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中膠質(zhì)干細胞可利用外泌體實現(xiàn)其與血管內(nèi)皮細胞之間生物學(xué)信息的交流。

2 外泌體在腦膠質(zhì)瘤診斷和治療中的應(yīng)用

2.1外泌體作為抗腫瘤靶向藥物載體 受治療腦腫瘤藥物在體內(nèi)的不穩(wěn)定性和血腦屏障的限制，其療效甚差，研發(fā)能夠透過血腦屏障，使藥物可直接靶向作用于原發(fā)腫瘤的新型給藥系統(tǒng)將有效提高抗腫瘤藥物的效能。外泌體是人體分泌的膜性囊泡，具有穩(wěn)定性高、生物相容性好、免疫源性低，血腦屏障透過性好等特性，是藥物靶向投遞的最佳載體，借助超聲波和室溫孵育將紫杉醇組裝于膠質(zhì)瘤細胞系U87來源的外泌體中，可見載有紫杉醇的外泌體對U87細胞的毒性明顯增加[26]。外泌體miR-34a能夠特異性負向調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤n-Myc基因的表達，鑒于人骨髓間充質(zhì)干細胞可遷移至腫瘤部位的特性，利用人骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體將過表達的外源性miR-34a遞送至腫瘤細胞，使n-Myc基因沉默，提高膠質(zhì)母細胞瘤細胞對替莫唑胺的化療敏感性，以達到抑制腫瘤細胞生長的目的，NIE等[27]發(fā)現(xiàn)藥物敏感性腫瘤細胞來源的外泌體可逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細胞的耐藥性。因此，外泌體除能夠靶向傳遞抗腫瘤藥物、促進其吸收等功能外，還可在逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性方面發(fā)揮作用，也為外泌體在各種腫瘤的無創(chuàng)診斷、預(yù)后判斷及治療中提供新的方法思路[28-29]。

2.2外泌體作為免疫療法的介入靶點 膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因即是其免疫逃避。DOMENIS等[30]針對膠質(zhì)瘤干細胞外泌體對不同外周免疫細胞群的免疫調(diào)節(jié)特性進行觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞外泌體處理的外周血單核細胞具有抑制T淋巴細胞活化、增殖和輔助性T細胞1(Th1)細胞因子產(chǎn)生的能力，同時不影響細胞活力或抑制T淋巴細胞功能。膠質(zhì)瘤外泌體主要通過作用于單核細胞，抑制T淋巴細胞的免疫應(yīng)答，外泌體在選擇性靶向治療膠質(zhì)瘤時對免疫細胞產(chǎn)生效應(yīng)，從而減緩或阻止腫瘤進展。而且，膠質(zhì)母細胞瘤來源的外泌體還可將免疫調(diào)節(jié)分子轉(zhuǎn)移到免疫細胞，形成對應(yīng)的腫瘤免疫微環(huán)境[31]。因此，通過抑制外泌體的分泌，改變膠質(zhì)母細胞瘤組織中的微環(huán)境，可能是未來控制其侵襲、遷移的策略之一。

3 結(jié) 論

EVs是GBM細胞與腫瘤微環(huán)境通訊的重要信號載體，GBM衍生的EVs可被腫瘤環(huán)境的不同組成部分例如TAMs，內(nèi)皮細胞，星形膠質(zhì)細胞和GSCs吸收，從而參與腫瘤生長、腫瘤侵襲、新血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)化、腫瘤耐藥和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等。來自腫瘤周圍的細胞也釋放出針對GBM的EVs，參與GBM的進展，未來治療策略可能旨在阻斷GBM細胞與基質(zhì)間質(zhì)之間建立的這種EVs介導(dǎo)的信息交流。綜上所述，EVs具有傳遞信號分子、調(diào)節(jié)細胞及周圍微環(huán)境的作用，作為疾病標志物，在疾病“液體活檢”中具有巨大的前景，不僅可以作為監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)測患者預(yù)后的生物學(xué)標志物，還有望成為攜帶靶向藥物的載體。