半夏酚酸類化感物質(zhì)積累規(guī)律研究

萬子玉，李巧，賴月月，劉佳靈，敬勇，李敏

成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)作為流通廣泛的大宗藥材，近年來需求量不斷增加，但野生的半夏資源不斷衰減，使得栽培半夏所占的比重越來越大。連作障礙(continuous cropping obstacles; replant problems; replant disease)，即在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科作物時，即使在正常的栽培管理狀況下，也會出現(xiàn)生長勢變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降和病蟲害嚴(yán)重的現(xiàn)象，連作障礙在早期研究中被稱為“土壤病”。連作障礙是藥用植物栽培中的一種常見現(xiàn)象，尤以根或根莖入藥的藥材生產(chǎn)中表現(xiàn)最為突出，如半夏、人參、地黃、三七和丹參等[1-4]都存在著嚴(yán)重的連作障礙問題，表現(xiàn)為輕則減產(chǎn)，重則絕收。引起作物連作障礙的主要因素可以歸納為化感自毒作用、土壤微生態(tài)發(fā)生改變，土傳病蟲害嚴(yán)重、土壤理化性質(zhì)改變等[5-8]，其中化感自毒作用是目前連作障礙研究熱點之一。李培棟等[9]分析花生(ArachishypogaeaLinn.)連作土壤中酚酸類化感物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、香豆素和苯甲酸會抑制花生幼苗生長并提高花生的發(fā)病率。杜家方等[10]在研究連作地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)根際土壤中酚酸類物質(zhì)的動態(tài)變化過程中發(fā)現(xiàn)阿魏酸、香豆酸、丁香酸和對羥基苯甲酸酚酸類物質(zhì)會抑制地黃塊根生長，引發(fā)連作效應(yīng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)半夏連作土壤中含有對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸，這6種酚酸均是文獻(xiàn)中經(jīng)常報道的酚酸類化感物質(zhì)，且對半夏的生長發(fā)育具有較強(qiáng)的化感作用[10-11]，故推測半夏的連作障礙現(xiàn)象也與以上酚酸類物質(zhì)所引起的化感自毒作用有關(guān)。目前，對半夏酚酸類化感物質(zhì)的積累和分泌少有研究，半夏的酚酸類化感物質(zhì)在不同時期的分泌和積累的研究更是缺乏。實驗針對連作土壤中已分離鑒定的6種酚酸類化感物質(zhì)，對不同生長時期的半夏植株、根際土壤中的酚酸類成分進(jìn)行分析研究，探究半夏植株中6種酚酸類成分的積累規(guī)律，為緩解半夏化感自毒作用和消減連作障礙、為提高其產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

半夏種莖來源于四川省南充市龍門鎮(zhèn)的野生種莖，直徑1.5～2.0 cm。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)的李敏教授鑒定，為天南星科植物半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)的塊莖。

方形花盆、河沙、珍珠巖、蛭石和配方全營養(yǎng)液購于廣東天禾農(nóng)資股份有限公司。

1.2 試劑與儀器1.2.1 試劑

98%對羥基苯甲酸(批號：wkq17060502)、99%丁香酸(批號：wkq17112307)、98%香草酸(批號：wkq17112206)、98%香草醛(批號：wkq17052406)、99%對香豆酸(批號：wkq17081114)和98%阿魏酸(批號：wkq17112004)均購自成都維克奇生物科技有限公司，上述各對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。水為蒸餾水，乙腈和磷酸為色譜純，濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯和甲醇等均為分析純，均購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2.2 儀器

WATERS E2695高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)，Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱(島津公司)；Allegra 64R Centrifuge型冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)；DUG-9070B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實驗設(shè)備有限公司)；SQP萬分之一天平(賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)；PHS-3E型pH劑(雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；HY-BⅡ回旋振蕩器(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

1.3 方法1.3.1 實驗設(shè)計

取半夏種莖，用蒸餾水反復(fù)沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡5 h，消毒，取出瀝干備用。將半夏整齊放置于鋪有潔凈石英砂的育苗盤中，置于溫度為20～23 ℃的生化培養(yǎng)箱中催苗。待半夏發(fā)芽后，取生長情況一致的半夏移栽至含河沙、珍珠巖和蛭石的混合配方基質(zhì)中，置于20～25 ℃玻璃人工氣候室中培養(yǎng)，期間每隔4 d澆一次0.075%的全營養(yǎng)液(以保證半夏植株正常生長)。半夏出苗后15 d開始取樣，之后每隔半個月對半夏植株進(jìn)行取樣，每個育苗盤每次取5株，共取6次。將半夏植株分為須根、塊莖(去皮)、塊莖皮和葉4個部分，50 ℃烘干備用；收集半夏根際土壤(半夏植株取出后小心抖掉粗沙，用軟毛刷刷下附著在須根上面的少量沙子，除去殘根等雜質(zhì))自然風(fēng)干備用。

取半夏種莖，用清水反復(fù)沖洗，除去泥沙雜質(zhì)。浸泡5 h，取出瀝干備用。稱取300 g經(jīng)消毒的潔凈石英砂置于發(fā)芽盒中，移取0、0.0016、0.0162、0.0812、0.1624和0.6496 mg·L-1的對香豆酸脅迫液各50 mL，加入石英砂中并充分拌勻，同時設(shè)置空白對照，每個處理設(shè)置3組平行實驗。處理后石英砂中酚酸含量分別為0.00、0.27、2.73、13.67、27.33和109.33 μg·g-1。取36顆已消毒的半夏種莖種整齊植入處理好的發(fā)芽盒中。將布置好的發(fā)芽盒放入(20±1) ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。

1.3.2 色譜條件

色譜條件參考吳立潔等[12]建立的測定6種酚酸的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。WATERS E2695高效液相色譜儀，Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示；流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL；檢測波長為275 nm；柱溫為25 ℃。

1.3.3 半夏酚酸含量測定

供試品溶液的制備：根際土壤制備方法參考吳立潔等[12]的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。稱取土樣(過4號篩)100 g，置于500 mL錐形瓶中，加入1 mol·L-1NaOH溶液100 mL，振搖6 h，靜置18 h，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5左右，8 000 r·min-1離心5 min，取上清20 mL，加乙酸乙酯40 mL萃取5次。合并乙酸乙酯層，減壓濃縮干燥。準(zhǔn)確吸取2 mL甲醇溶解殘渣，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

半夏植株各部位半夏酚酸提取參考饒國棟和張建國[13]的方法，并進(jìn)行優(yōu)化。稱取樣品粉末(過4號篩)2 g，置150 mL錐形瓶中，加1 mol·L-1NaOH 50 mL，振搖6 h，靜置18 h，離心，取上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，8 000 r·min-1離心5 min，取上清10 mL，用乙酸乙酯萃取5次，每次20 mL，合并萃取液，減壓干燥。準(zhǔn)確吸取2 mL甲醇溶解殘渣，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液的制備：分別精密稱取對羥基苯甲酸、香草醛、香草酸、對香豆酸、丁香酸和阿魏酸對照品，置于10 mL容量瓶中，以甲醇制成每1 mL含羥基苯甲酸100 μL、香草醛100 μL、香草酸100 μL、對香豆酸100 μL、丁香酸400 μL和阿魏酸100 μL混合對照品溶液。

1.3.4 發(fā)芽指標(biāo)測定

待半夏種莖開始發(fā)芽時，每天記錄半夏種莖的發(fā)芽數(shù)，共記錄14 d。待實驗結(jié)束，用刻度尺測定各處理半夏植株的根長。

1.3.5 評價方法

發(fā)芽率(%)=(萌發(fā)終期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(萌發(fā)高峰期正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，萌發(fā)高峰期指發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰的時期；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，式中：Gt為在td時的種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相對應(yīng)的發(fā)芽時間(d)；

化感效應(yīng)指數(shù)(response index, RI)采用Bruce Wiliamson和Richardson[14]的方法：RRI=1-C/T(當(dāng)T≥C時)或RRI=C/T-1(當(dāng)T0時，表示促進(jìn)作用，當(dāng)RRI<0時，表示抑制作用，

表1 高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of high performance liquid chromatography (HPLC)

RRI絕對值代表化感作用強(qiáng)度。

1.3.6 分析方法

試驗數(shù)據(jù)整理采用Excel2016，分析作圖采用GraphPad6，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析采用SPSS21.0。

2 結(jié)果(Results)

吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，對半夏根際土及半夏各部位所含酚酸進(jìn)行定性和定量分析。從半夏植株的須根、塊莖(去皮)、塊莖皮和葉中均鑒定出6種相同的酚酸類成分，分別為對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸和阿魏酸(圖1)；根際土的鑒定結(jié)果與半夏植株的相同(圖2)。

2.1 不同生長時間的半夏須根中酚酸含量的積累變化

不同生長時間的半夏須根中酚酸含量測定結(jié)果如表2所示，半夏須根中總酚酸含量范圍為238.59～

578.65 μg·g-1，不同生長時間總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長時間的延長，總酚酸含量呈波動上升的趨勢，當(dāng)生長時間為90 d時達(dá)到最高，約為生長15 d含量的2.4倍。同一時期各酚酸的含量均有所差異，具體表現(xiàn)為對香豆酸>香草醛>對羥基苯甲酸>香草酸>阿魏酸>丁香酸，含量最高的對香豆酸約為含量最低的丁香酸63倍。隨生長時間的延長，須根中的6種酚酸的含量皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異(P<0.05)，除丁香酸在60 d時含量達(dá)到最高外，其余5種酚酸均在90 d時含量達(dá)到最高。

圖1 對照品及供試品HPLC色譜圖注：A.對照品，B.須根，C.塊莖(去皮)，D.塊莖皮，E.葉；1.對羥基苯甲酸，2.香草酸，3.丁香酸，4.香草醛，5.對香豆酸，6.阿魏酸。Fig. 1 HPLC chromatogram of reference substance and sampleNote: A. Control, B. Fibrous root, C. Tuber (peeled), D. Tuber skin, E. Leaf; 1. p-hydroxybenzoic acid, 2. Vanillic acid, 3. Syringic acid, 4. Vanillin, 5. p-coumaric acid, 6. Ferulic acid.

圖2 對照品(A)及根際土樣品(B)HPLC色譜圖注：1.對羥基苯甲酸；2.香草酸；3.丁香酸；4.香草醛；5.對香豆酸；6.阿魏酸。Fig. 2 HPLC chromatogram of reference substance (A) and rhizosphere soil sample (B)Note: 1. p-hydroxybenzoic acid; 2. Vanillic acid; 3. Syringic acid; 4. Vanillin; 5. p-coumaric acid; 6. Ferulic acid.

2.2 不同生長時間的半夏塊莖(去皮)中酚酸含量的積累變化

不同生長時間的半夏塊莖(去皮)中酚酸含量測定結(jié)果如表3所示，半夏塊莖(去皮)中總酚酸含量范圍為9.86～16.58 μg·g-1，不同生長時間總酚酸含量之間存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長時間的延長，總酚酸呈先升后降的趨勢，當(dāng)生長時間為60 d時達(dá)到最高，約為生長15 d含量的1.7倍。在同一時期半夏塊莖中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>丁香酸>阿魏酸>對香豆酸，香草醛含量約為對香豆酸的11倍。隨生長時間的延長，塊莖(去皮)中除丁香酸呈逐漸升高的趨勢外，其余5種酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢，且存在顯著性差異(P<0.05)，對羥基苯甲酸和香草醛在45 d時含量達(dá)到最高，香草酸和阿魏酸在45 d時含量達(dá)到最高，對香豆酸和丁香酸分別在75 d和90 d時含量達(dá)到最高。

2.3 不同生長時間的半夏塊莖皮中酚酸含量的積累變化

不同生長時間的半夏塊莖皮中酚酸含量測定結(jié)果如表4所示，半夏塊莖皮中總酚酸含量范圍為324.58～399.91 μg·g-1，不同生長時間總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長時間的延長，總酚酸含量呈波動上升的趨勢，當(dāng)生長時間為90 d時含量達(dá)到最高，約為生長60 d時含量的1.2倍。半夏塊莖皮中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>阿魏酸>對香豆酸>丁香酸，香草醛含量約為丁香酸的31倍。隨生長時間的延長，塊莖皮中除對羥基苯甲酸外，其余5種酚酸皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 不同生長時間半夏須根中酚酸含量變化Table 2 Changes of phenolic acids contents in fibrous roots of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表3 不同生長時間半夏塊莖(去皮)中酚酸含量變化Table 3 Changes of phenolic acids contents in Pinellia ternata (Thunb.) Breit. tubers (peeled) at different growth times n=3) (μg·g-1)

2.4 不同生長時間的半夏葉中酚酸含量的積累變化

不同生長時間的半夏葉中酚酸含量測定結(jié)果如表5所示。總酚酸含量范圍為18.94～70.04 μg·g-1，不同生長時間總酚酸之間存在顯著性差異(P<0.05)，隨生長時間的延長，總酚酸呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)生長時間為90 d時達(dá)到最高，約為生長15 d含量的3.7倍。葉中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>對香豆酸>丁香酸、阿魏酸，香草醛含量約為丁香酸的6倍。隨生長時間的延長，葉中除阿魏酸含量呈先升高后降低的趨勢外，其余5種酚酸含量皆呈波動上升的趨勢，且存在顯著性差異(P<0.05)，除香草酸、阿魏酸分別在60 d和75 d時含量達(dá)到最高外，其余酚酸均在90 d時含量達(dá)到最高。

2.5 不同生長時間的半夏根際土中酚酸含量的積累變化

不同生長時間的半夏根際土中酚酸含量測定結(jié)果如表6所示，半夏根際土中總酚酸含量范圍為0.5773～1.2694 μg·g-1，不同生長時期總酚酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，隨時間的延長總酚酸含量呈先升后緩慢下降的趨勢，當(dāng)生長時間為75 d時達(dá)到最高，約為生長15 d含量的2.2倍。根際土中各酚酸的含量有所差異，具體表現(xiàn)為對香豆酸>對羥基苯甲酸>香草醛>香草酸>丁香酸>阿魏酸，對香豆酸含量約為阿魏酸含量的22倍。隨生長時間的延長，根際土中除對香豆酸含量呈逐漸升高的趨勢外，其余酚酸的含量皆呈先升后降的趨勢，且存在顯著性差異(P<0.05)，除丁香酸和對香豆酸分別在60 d和90 d時含量達(dá)到最高外，其余酚酸均在75 d時含量達(dá)到最高。

2.6 半夏植株不同部位酚酸最終積累量

半夏植株不同部位酚酸最終積累量測定結(jié)果如表7所示，半夏植株不同部位酚酸除丁香酸和對香豆酸外，其余酚酸的最終積累量均存在顯著性差異(P<0.05)，總酚酸積累量以半夏須根最高，塊莖(去皮)最低，大小規(guī)律為：須根>莖皮>葉>塊莖(去皮)(P<0.01)，須根約為塊莖(去皮)的42倍。半夏植株中6種酚酸的積累規(guī)律為：對香豆酸>香草醛>香草酸>對羥基苯甲酸>阿魏酸>丁香酸，其中對香豆酸積累量以須根最高，達(dá)410.92 μg·g-1，塊莖(去皮)最低，須根積累量約為塊莖(去皮)積累量的708倍。對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸則均以塊莖皮積累量最高，塊莖(去皮)最低。

表4 不同生長時間半夏塊莖皮中酚酸含量變化Table 4 Changes of phenolic acids contents in tuber skin of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表5 不同生長時間半夏葉中酚酸含量變化Table 5 Changes of phenolic acids contents in leaf of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

2.7 對香豆酸對半夏種莖萌發(fā)的影響

由表8可知，半夏種莖在對香豆酸脅迫下，除根長隨脅迫濃度的升高呈下降的趨勢外，其余3個指標(biāo)皆隨脅迫濃度的升高呈先升后降的趨勢。其中，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到0.6496 mg·L-1，即石英砂中濃度為109.33 μg·g-1時，半夏的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和根長皆顯著低于對照組(P<0.05)，分別較對照組(0.00 mg·L-1)降低了13.93%、17.31%、45.00%和24.43%，化感指數(shù)分別為-0.14、-0.17、-0.21和-0.24。

3 討論(Discussion)

半夏植株各部位總酚酸最終積累量的規(guī)律為須根>塊莖皮>葉>塊莖(去皮)；隨生長時間的延長，半夏植株不同部位中6種酚酸不斷積累，均在60～90 d時達(dá)到最高，其中對香豆酸含量最高，且大部分存在于須根中，此時半夏根際土中對香豆酸和總酚酸含量達(dá)到最高。實驗所用根際土為石英砂，故最終半夏根際土中對香豆酸和總酚酸均來自半夏植株，推測半夏分泌的酚酸類物質(zhì)對香豆酸占主要地位。半夏塊莖(去皮)的對香豆酸和總酚酸均是先增加后降低，但最終塊莖(去皮)的對香豆酸和總酚酸較初始時有所增加的。第75天半夏塊莖(去皮)中對香豆酸和總酚酸開始降低，而第75天時半夏須根和塊莖皮中的對香豆酸和總酚酸開始急劇增加，推測半夏塊莖(去皮)中的對香豆酸和總酚酸均向半夏的須根和塊莖皮中轉(zhuǎn)移。

表6 不同生長時間半夏根際土中酚酸含量變化 Table 6 Changes of phenolic acids contents in rhizosphere soil of Pinellia ternata (Thunb.) Breit. at different growth times n=3) (μg·g-1)

表7 半夏植株不同部位酚酸最終積累量Table 7 Final accumulation of phenolic acids in different parts of Pinellia ternate (Thunb.) (μg·g-1)

表8 對香豆酸對半夏種莖萌發(fā)的影響Table 8 Effect of p-coumaric acid on seed stem germination of Pinellia ternate n=3)

當(dāng)對香豆酸濃度達(dá)到109.33 μg·g-1時，能顯著降低半夏種莖的發(fā)芽率，而在第90天時半夏須根中的對香豆酸含量為410.92 μg·g-1，遠(yuǎn)大于脅迫的濃度。據(jù)此可以推測半夏植株會向土壤中釋放酚酸，使得半夏土壤中總酚酸和對香豆酸達(dá)到脅迫的閾值，從而使得半夏在連作過程中產(chǎn)生化感自毒作用。何志貴[11]的研究表明，化感自毒物質(zhì)是引起半夏連作障礙的重要因素，其中酚酸是其重要的組成成分。張丹等[15]的研究表明栽培過程中隨黃連生長年限的增加，連作地土壤中總酚酸的含量均表現(xiàn)為增加。吳立潔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三七根際土壤中對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸和苯甲酸6種酚酸類物質(zhì)是由三七植物須根殘體腐解產(chǎn)生。徐小軍等[16]的研究表明，隨著阿魏酸質(zhì)量濃度的提高，西瓜根和莖中的超氧陰離子濃度及膜質(zhì)過氧化程度顯著增加；張恩平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸和肉桂酸會破壞番茄根部保護(hù)酶系統(tǒng)的平衡，造成了根系的膜質(zhì)過氧化，沈玉聰?shù)萚18]在研究酚酸類物質(zhì)對三七幼苗的化感影響時發(fā)現(xiàn)，外源性添加對香豆酸會降低幼苗根系活力和株高。有研究表明，對香豆酸處理幼苗后，植株體內(nèi)可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性以及超氧化物歧化酶活性均有所降低，從而抑制了小麥的地下根的生長[19]。對香豆酸處理大豆后會顯著降低干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片膨脹、高度、葉片產(chǎn)量、凈同化率(單位葉面積干物質(zhì)產(chǎn)量的比率)和葉面積持續(xù)時間(處理間隔期間存在的總?cè)~面積)[20]。據(jù)此分析，本研究中當(dāng)半夏植株的須根中的對香豆酸濃度≥109.33 μg·g-1時，須根的抗氧化酶系統(tǒng)皆開始遭到破壞，無法抵抗對香豆酸引起的自毒作用，最終抑制了半夏幼苗的生長發(fā)育，乃至通過影響半夏根系的生長發(fā)育和植株葉片的化合作用引起半夏長期連作的提前倒苗，進(jìn)而導(dǎo)致減產(chǎn)和土壤病的發(fā)作。推測半夏產(chǎn)地的連作障礙可能是每年半夏采收后殘留的須根殘體經(jīng)腐解后產(chǎn)生了對香豆酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸等酚酸類物質(zhì)，對其產(chǎn)生了毒害作用。

Bai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，煙草的連作降低土壤pH，促進(jìn)酚酸積累，從而改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，最終影響煙草生長。有研究發(fā)現(xiàn)，對香豆酸通過增加鐮刀菌型等有害菌群，減少有益菌群，改變了黃瓜根際細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)和組成，導(dǎo)致黃瓜發(fā)生自毒效應(yīng)[22-23]。據(jù)此分析，在半夏產(chǎn)地長期連作過程中，土壤中的對香豆酸不斷積累，在這個過程中對香豆酸可能會改變半夏土壤中的微生物平衡，通過促進(jìn)有害微生物增加，抑制有益型微生物的生長，從而導(dǎo)致半夏的化感自毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)對香豆酸濃度達(dá)到較高濃度時能顯著抑制半夏種莖的萌發(fā)，在不同時間段半夏植株各部位酚酸最終積累量均是以半夏須根中對香豆酸含量最高，可以推測半夏植株特別是半夏須根可能是連作土壤中酚酸類化感物質(zhì)的潛在來源，對香豆酸為重要的酚酸類化感物質(zhì)，對香豆酸可能為半夏植株中重要的次生代謝產(chǎn)物，其對半夏植株生長的意義還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，半夏植株不同部位均含相同的6種酚酸類成分，分別為對香豆酸、香草醛、香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸，其總酚酸含量以半夏的須根最高，規(guī)律為須根>塊莖皮>葉>塊莖(去皮)。隨生長時間的延長，半夏的塊莖皮、須根、葉和根際土中的對香豆酸和總酚酸呈波動上升的趨勢，不斷積累，最終在第90天時達(dá)到最高；而半夏塊莖(去皮)中的對香豆酸和總酚酸在75 d時達(dá)到最高，但此時半夏塊莖(去皮)的對香豆酸和總酚酸開始向半夏的須根和根際土壤中轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步使半夏須根和根際土在第90天時積累的對香豆酸和總酚酸含量達(dá)到更高。而其他5種酚酸均在60～90 d時達(dá)到最高。第75天時半夏須根中對香豆酸含量達(dá)410.92 μg·g-1，是引發(fā)半夏自毒作用而抑制半夏幼苗生長發(fā)育所需濃度的2倍。