25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)水生無脊椎動(dòng)物的毒性效應(yīng)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

曾兆華，湯保華，林濤，林嶺虹，楊廣，金菁，朱珍珍，方慧玲，游泳,*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013 2. 蘇州華測安評(píng)技術(shù)服務(wù)有限公司，蘇州 215121 3. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002

水稻是我國重要的糧食作物。近年來，千金子、馬唐和旱稗等是我國南方稻田主要為害雜草[1]，主要依賴除草劑進(jìn)行防治。隨著除草劑使用量不斷加大，稻田附近水域中農(nóng)藥的檢出率也隨之增高。因此，需要對(duì)農(nóng)藥的使用進(jìn)行監(jiān)測和控制，并加強(qiáng)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是農(nóng)藥登記不可缺失的環(huán)節(jié)[2]，傳統(tǒng)的生態(tài)危害評(píng)估通常是基于室內(nèi)化學(xué)品對(duì)單一物種的急、慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果，而無法對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)中的種內(nèi)、種間關(guān)系進(jìn)行有效反映[3]。在2017年11月起施行的《農(nóng)藥登記資料要求》中，增加了化學(xué)農(nóng)藥制劑產(chǎn)品需提供環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告的要求[4]，運(yùn)用環(huán)境暴露模型評(píng)估化學(xué)農(nóng)藥制劑應(yīng)用后對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)是國際通行做法[5]。目前，國際上已建立了用于評(píng)估農(nóng)藥對(duì)地表水污染風(fēng)險(xiǎn)的初級(jí)模型[6-7]和高級(jí)模型[8-12]；在2010年，我國與荷蘭科研人員合作研發(fā)出可用于我國農(nóng)藥暴露模擬的TOP-RICE模型[6,13]，但國內(nèi)外構(gòu)建的模型通常是基于實(shí)驗(yàn)室單一物種毒性測試結(jié)果而顯得過于保守，相反采用物種敏感度分布(SSD)研究等高級(jí)效應(yīng)分析方法能最大程度地接近實(shí)際環(huán)境條件，并確定初級(jí)評(píng)估中所識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)存在的可能性[14]。

大型溞(Daphniamagna)因?qū)Νh(huán)境中的多種化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出高度敏感性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境污染的檢測和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中[15-17]，但其主要分布在我國北方，南方少見[18]，以其作為評(píng)價(jià)南方水田除草劑的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有一定局限性。發(fā)頭裸腹溞(Moinairrasa)分布于我國各地，尤其是南方各省[11]，其內(nèi)稟增長率(rm)為大型溞等溞屬動(dòng)物2倍～3倍以上[19]，是一種新的較為理想的試驗(yàn)材料[20]，但有關(guān)將發(fā)頭裸腹溞應(yīng)用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的報(bào)道還很少。

五氟磺草胺是一種三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑，通過抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)發(fā)揮對(duì)雜草的控制作用[21-23]，可有效防除稗草、千金子等禾本科雜草以及一年生莎草科雜草，并對(duì)眾多闊葉雜草有效[24]，在世界各地水稻田中廣泛使用[25]。2004年9月24日五氟磺草胺在美國環(huán)境保護(hù)局(US EPA)正式注冊(cè)登記，2005年在美國南部稻區(qū)推廣應(yīng)用，2008年該藥在我國獲得登記。2014年在全球的銷售額達(dá)到2.6億美元，在我國也達(dá)到億元[26]；截至目前國內(nèi)已有180項(xiàng)含有五氟磺草胺有效成分的農(nóng)藥制劑獲得登記[27]，主要用于防治稻田一年生雜草。因ALS不存在于人和哺乳動(dòng)物中，導(dǎo)致人們不太關(guān)注五氟磺草胺對(duì)非靶標(biāo)生物的影響[28]。有研究報(bào)道，五氟磺草胺制劑對(duì)斑馬魚3月齡幼魚毒性等級(jí)中等，且對(duì)斑馬魚胚胎和初孵幼魚均有一定的影響[29]；對(duì)黃河鯉仔魚、泥鰍幼魚均表現(xiàn)為高毒[30-31]等。與國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)報(bào)道的五氟磺草胺原藥對(duì)大型溞幼溞毒性等級(jí)為低毒，存在差異，而關(guān)于五氟磺草胺制劑對(duì)溞類毒力研究的報(bào)道還很少。因此，有必要探究五氟磺草胺制劑暴露對(duì)溞類存活、發(fā)育的影響。為進(jìn)一步開展五氟磺草胺對(duì)水生無脊椎動(dòng)物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

本文以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑為例，通過急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)和繁殖試驗(yàn)，比較其對(duì)大型溞和發(fā)頭裸腹溞的毒力；并利用TOP-RICE暴露模型和SSD法對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。旨在比較25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)模式生物大型溞與南方常見物種發(fā)頭裸腹溞毒力差異，尋找較適合評(píng)價(jià)南方稻區(qū)農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)檢測的指示生物，為農(nóng)藥環(huán)境安全管理提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)生物

本研究采用的受試大型溞(Daphniamagna)由中國科學(xué)院水生生物所提供，實(shí)驗(yàn)室自行保種繁育；發(fā)頭裸腹溞(Moinairrasa)采自福建省福州市閩侯縣南通鎮(zhèn)洲頭村小河，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化，純系培養(yǎng)。取一頭健康親溞孤雌生殖3代以上形成室內(nèi)種群，選取出生24 h內(nèi)健康、活潑、大小一致的非頭胎健康溞作為實(shí)驗(yàn)材料。大型溞長期穩(wěn)定地培養(yǎng)于ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中，1 L燒杯中飼養(yǎng)20～30頭大型溞，培養(yǎng)溫度(20±2) ℃；發(fā)頭裸腹溞長期穩(wěn)定地培養(yǎng)于M4培養(yǎng)液中，1 L燒杯中飼養(yǎng)50～60頭發(fā)頭裸腹溞，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，兩者培養(yǎng)液均每周更換3次，pH 7.0～9.0，光暗比16 h∶8 h，定期投放羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)作為餌料，每天于1 L燒杯中飼喂密度為5.00×105個(gè)·mL-1的藻液5～10 mL。

1.2 供試藥劑

五氟磺草胺(化學(xué)分子式為C16H14F5N5O5S，CAS號(hào)219714-96-2可分散油懸浮劑，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技(中國)有限公司生產(chǎn)，有效成分含量25 g·L-1。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)

參照OECD 202標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行48 h急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)[32]。大型溞設(shè)0.19、0.42、0.93、2.05和4.50 mg a.i.·L-15個(gè)系列濃度，均用ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制；發(fā)頭裸腹溞設(shè)4.90×10-2、0.15、4.44、1.33和4.00 mg a.i.·L-15個(gè)系列濃度，均用M4培養(yǎng)液配制。并設(shè)置不加藥劑的對(duì)照，每個(gè)處理和對(duì)照重復(fù)4次，實(shí)驗(yàn)時(shí)，在100 mL燒杯中裝入50 mL配制好的不同濃度藥液，每個(gè)燒杯中放入5頭幼溞，分別于24 h和48 h后記錄2種溞的中毒癥狀和受抑制數(shù)，輕晃試驗(yàn)燒杯，實(shí)驗(yàn)溞在15 s內(nèi)不能游動(dòng)視為活動(dòng)受抑制。在實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料，不更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h的人工氣候箱內(nèi)開展。

1.3.2 繁殖試驗(yàn)

參照OECD 211標(biāo)準(zhǔn)方法中21 d繁殖試驗(yàn)[33]。根據(jù)大型溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)結(jié)果，獲得供試農(nóng)藥對(duì)大型溞48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，設(shè)3.82×10-4、1.22×10-3、3.91×10-3、1.25×10-2和4.00×10-2mg a.i.·L-15個(gè)系列濃度；根據(jù)發(fā)頭裸腹溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)結(jié)果，獲得供試農(nóng)藥對(duì)發(fā)頭裸腹溞48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)，設(shè)1.91×10-4、3.38×10-4、7.66×10-4、1.53×10-3、3.06×10-3和6.13×10-3mg a.i.·L-16個(gè)系列濃度；另設(shè)置不加藥劑的對(duì)照。每個(gè)處理和對(duì)照重復(fù)10次。試驗(yàn)時(shí)，用量筒量取不同濃度藥液各50 mL，放入100 mL燒杯中，在每個(gè)燒杯中放入1頭健康活潑的幼溞，分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)，大型溞試驗(yàn)時(shí)間持續(xù)21 d；發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)時(shí)間持續(xù)到所有受試個(gè)體全部死亡。試驗(yàn)期間采用半靜態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)，每隔1 d更換1次試驗(yàn)溶液，以保證試驗(yàn)期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄2種溞的生存、蛻皮、懷卵和產(chǎn)子情況，及時(shí)移出蛻皮和新產(chǎn)幼溞，每天喂食羊角月芽藻。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別統(tǒng)計(jì)平均首次蛻皮時(shí)間、首胎時(shí)長、平均產(chǎn)幼溞數(shù)量和產(chǎn)幼溞胎數(shù)、平均存活時(shí)間及死亡率等。

1.3.3 供試物真實(shí)濃度檢測

在大型溞、發(fā)頭裸腹溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)中，于試驗(yàn)開始0、24和48 h分別取最低濃度組(處理1)、最高濃度組(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度；在大型溞繁殖試驗(yàn)中，所測得新舊溶液為試驗(yàn)開始0 h、第5天換水前后、第12天換水前后、第19天換水前后、第21天分別取濃度為3.82×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、4.00×10-2mg a.i.·L-1(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度；在發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)中，所測得新舊溶液為試驗(yàn)開始0 h、第2天換水前后、第6天換水前后、第12天換水前后、第14天分別取1.91×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、6.13×10-3mg a.i.·L-1(處理6)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度。

對(duì)于大型溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)水樣的前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，0.19 mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.50 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對(duì)于發(fā)頭裸腹溞急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)水樣前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，4.90×10-2mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.00 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對(duì)于大型溞繁殖試驗(yàn)取處理1、處理5水樣；發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)取處理1、處理6水樣皆用0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)待測。

五氟磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：稱取99.47%的五氟磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品2.50×10-3g，用乙腈定容至25 mL，得濃度為99.470 mg·L-1的母液，將母液用乙腈分別稀釋得到3.00×10-5、1.00×10-4、3.00×10-4、1.00×10-3、2.00×10-3、5.00×10-3、2.00×10-2和5.00×10-2mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

添加回收：在對(duì)照樣品中添加一定量的乙基多殺菌素標(biāo)樣溶液，按照水樣檢測條件測定回收率。設(shè)1.00×10-4、1.00×10-3和1.00×10-2mg·L-13個(gè)添加濃度，每個(gè)添加濃度重復(fù)5次。

1.3.4 試驗(yàn)條件與濃度分析

本研究中對(duì)于五氟磺草胺在水溶液中的濃度分析采用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S micro)，液相色譜條件：色譜柱為Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=50∶50，流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，五氟磺草胺保留時(shí)間約為0.95 min。

質(zhì)譜條件：多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描，電噴霧正離子模式(ESI+)，毛細(xì)管電壓1.0 kV，錐孔電壓42 V，離子源溫度150 ℃，錐孔反吹氣流量50 L·h-1，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L·h-1，五氟磺草胺定量離子對(duì)m/z為 483.97/195.25，定性離子對(duì)m/z為483.97/164.23，定量離子碰撞能25 eV，定性離子碰撞能30 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件中的Probit(概率單位法)進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算出25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞、發(fā)頭裸腹溞的半效應(yīng)濃度(EC50)及其95%置信限。根據(jù)繁殖試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差(LSD法)分析各種指標(biāo)的組間差異。采用Excel 2007對(duì)各濃度組之間大型溞、發(fā)頭裸腹溞死亡率進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用OriginPro 9.1軟件中的Line+symbol功能進(jìn)行制圖。

1.5 五氟磺草胺對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生態(tài)效應(yīng)分析

對(duì)五氟磺草胺進(jìn)行農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估所需要的參數(shù)值主要來自農(nóng)藥性質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Pesticide Properties Database, PPDB)[34]、EFSA Journal數(shù)據(jù)庫[35](表1)。通過本研究獲得溞類急、慢性試驗(yàn)的EC50、無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)值，并根據(jù)相應(yīng)的不確定因子(UF)，計(jì)算出溞類(急性)預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=EC50/UF)，溞類(慢性)預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=NOEC/UF)。其中，溞類急、慢性不確定因子(UF)分別選擇100和10[36]。

用TOP-RICE模型[13,37]分析得到連平、南昌預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)中，選取PECmax數(shù)值最大的場景進(jìn)行初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)溞類急、慢性試驗(yàn)周期，選擇相應(yīng)的時(shí)間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(PECtwa)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，分別計(jì)算相應(yīng)的溞類急、慢性風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ=PEC/PNEC)。將本試驗(yàn)計(jì)算的RQ與US EPA建立的水生生物關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)(levels of concerns, LOCS)中RQ等級(jí)劃分進(jìn)行比較。若RQ≤1，表明風(fēng)險(xiǎn)可接受；若RQ>1，表明風(fēng)險(xiǎn)不可接受，則需要進(jìn)行更高級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1.6 五氟磺草胺對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的高級(jí)生態(tài)效應(yīng)分析

當(dāng)五氟磺草胺對(duì)溞類的初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不接受時(shí)，可收集多個(gè)物種的毒性數(shù)據(jù)采用SSD法進(jìn)行高級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。通過US EPA的ECOTOX數(shù)據(jù)庫[38]、高產(chǎn)量物質(zhì)信息系統(tǒng)(HPVIS)[39]和EFSA Journal[35]數(shù)據(jù)庫等獲取五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物急、慢性毒性數(shù)據(jù)(表2)，對(duì)于同一物種有多個(gè)數(shù)據(jù)的情況，采用其所用濃度數(shù)據(jù)的幾何平均值。采用荷蘭國家公共衛(wèi)生與環(huán)境研究所(National Institute of Public Health and the Environment, RIVM)的RIVM研究小組開發(fā)的ETX 2.1模型構(gòu)建SSD曲線。以SSD計(jì)算出的5%物種危害濃度(HC5)，選擇3為不確定因子，計(jì)算預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=HC5/3)。

通過TOP-RICE模型分析得到連平、南昌預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，分別計(jì)算這2種場景下相應(yīng)的無脊椎動(dòng)物風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ=PEC/PNEC)。如果RQ≤1，表明風(fēng)險(xiǎn)可接受；RQ>1，表明風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

2 結(jié)果(Results)

2.1 供試物實(shí)測濃度

由表3可知，理論添加濃度≤1.00×10-2，回收率在60%～120%范圍內(nèi)，說明該方法能夠較為準(zhǔn)確地對(duì)25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑的含量進(jìn)行定量。

大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)中，測得實(shí)測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(nèi)(表4)，其試驗(yàn)結(jié)果符合OECD 202標(biāo)準(zhǔn)[33]規(guī)定的試驗(yàn)要求，說明理論濃度是可重復(fù)且穩(wěn)定的，則以理論濃度計(jì)算本試驗(yàn)結(jié)果。

大型溞、發(fā)頭裸腹溞的繁殖試驗(yàn)中，測得實(shí)測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(nèi)(表5和表6)，其試驗(yàn)結(jié)果符合《化學(xué)品 大型溞繁殖試驗(yàn)》(GB/T21828—2008)[40]規(guī)定的試驗(yàn)要求，說明理論濃度是可重復(fù)且穩(wěn)定的，則以理論濃度計(jì)算本試驗(yàn)結(jié)果。

表1 TOP-RICE模型所需參數(shù)值Table 1 Parameter values for TOP-RICE model

表2 五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物毒性數(shù)據(jù)Table 2 Toxicity data of penoxsulam to invertebrates

表3 分析方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of the accuracy of the test results

表4 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞、發(fā)頭裸腹溞急性毒性試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 4 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in acute toxicity test to Daphnia magna and Moina irrasa

表5 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞繁殖試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 5 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Daphnia magna

2.2 五氟磺草胺對(duì)大型溞和發(fā)頭裸腹的急性毒性

25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞和發(fā)頭裸腹溞的48 h-EC50分別為0.81 mg a.i.·L-1和0.52 mg a.i.·L-1(表7)。參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[41]中農(nóng)藥對(duì)溞類的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，該藥對(duì)大型溞及發(fā)頭裸腹溞的毒性等級(jí)皆為高毒。在試驗(yàn)過程中，對(duì)照組的大型溞及發(fā)頭裸腹溞死亡率<10%，生長狀況良好；不同濃度處理組的大型溞及發(fā)頭裸腹溞在接觸25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑后均受到不同程度抑制，抑制表現(xiàn)狀態(tài)為游動(dòng)不積極、反應(yīng)遲鈍、沉底。

2.3 五氟磺草胺對(duì)溞類的慢性毒性效應(yīng)2.3.1 五氟磺草胺暴露對(duì)大型溞生長發(fā)育和繁殖的影響

由表8所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞的體長、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)及蛻皮次數(shù)有顯著的影響，隨著濃度提高，大型溞的體長、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)逐漸縮短或減少。當(dāng)高于濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1時(shí)，大型溞的體長顯著縮短(P<0.05)。當(dāng)高于濃度3.91×10-3mg a.i.·L-1時(shí)，大型溞的產(chǎn)幼溞數(shù)顯著減少(P<0.05)。當(dāng)高于濃度1.25×10-2mg a.i.·L-1時(shí)，蛻皮次數(shù)顯著降低(P<0.05)。在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞首次蛻皮時(shí)間、首胎時(shí)長、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)影響均不顯著。大型溞產(chǎn)幼溞數(shù)隨濃度提高逐漸減少。由圖1可知，前10 d，各濃度與對(duì)照中未出現(xiàn)大型溞的死亡；第10天時(shí)，僅濃度為1.25×10-2mg a.i.·L-1和4.00×10-2mg a.i.·L-1組開始出現(xiàn)大型溞的死亡；當(dāng)21 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照與濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1組未出現(xiàn)大型溞的死亡，高于濃度1.22×10-3mg a.i.·L-1處理組大型溞死亡率為10%～30%。綜合考慮本研究各項(xiàng)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo)，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞的繁殖量(平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù))影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到大型溞21 d-NOEC值為1.22×10-3mg a.i.·L-1。

2.3.2 五氟磺草胺暴露對(duì)發(fā)頭裸腹溞生長發(fā)育和繁殖的影響

如表9所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)發(fā)頭裸腹溞的首胎時(shí)長、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)和平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)都有顯著的影響，隨著濃度升高，發(fā)頭裸腹溞的首胎時(shí)長、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)和平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)呈縮短或減少趨勢。當(dāng)濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時(shí)，與3.38×10-4mg a.i.·L-1和1.53×10-3mg a.i.·L-1相比，發(fā)頭裸腹溞首胎時(shí)長顯著縮短(P<0.05)；當(dāng)濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時(shí)，平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)顯著降低(P<0.05)。當(dāng)高于濃度1.53×10-3mg a.i.·L-1時(shí)，平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)顯著降低(P<0.05)。在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露對(duì)發(fā)頭裸腹溞首次蛻皮時(shí)間、平均存活時(shí)間影響不顯著。由圖1可知，前10 d，除對(duì)照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中未見到有發(fā)頭裸腹溞的死亡，其他各處理組皆存在死亡現(xiàn)象且死亡率較低；第10天時(shí)，對(duì)照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中開始出現(xiàn)發(fā)頭裸腹溞死亡現(xiàn)象，10 d后，隨作用濃度的增加存活率呈下降趨勢，存活時(shí)間也隨著濃度的增加而縮短。第14天時(shí)，濃度為3.06×10-3mg a.i.·L-1和6.13×10-3mg a.i.·L-1組的死亡率為100%，第16天，對(duì)照和其余處理組全部死亡。綜合考慮本研究各項(xiàng)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo)，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)發(fā)頭裸腹溞的繁殖量(平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù))影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1。

表6 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 6 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Moina irrasa

表7 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性毒性Table 7 Acute toxicity of 25 g·L-1 penoxsulam OD to Daphnia magna and Moina irrasa

2.4 五氟磺草胺對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)分析2.4.1 五氟磺草胺對(duì)溞類的初級(jí)效應(yīng)分析

通過TOP-RICE模型分析得到2種不同場景下的五氟磺草胺預(yù)測環(huán)境濃度峰值和時(shí)間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(表10)。結(jié)果顯示，連平-苗期場景與南昌-苗期場景相比，連平-苗期場景的預(yù)測環(huán)境濃度峰值最高，為8.11 μg·L-1，則選擇該場景下的時(shí)間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(PECtwa)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，大型溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和4.53 μg·L-1；發(fā)頭裸腹溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和5.74 μg·L-1，用于下一步的急、慢性初級(jí)暴露分析。本研究獲得的大型溞48 h-EC50為0.81 mg a.i.·L-1，21 d-NOEC為1.22×10-3mg a.i.·L-1；發(fā)頭裸腹溞48 h-EC50為0.52 mg a.i.·L-1，14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1，計(jì)算出大型溞急、慢性PNEC分別為8.10 μg·L-1和0.12 μg·L-1；發(fā)頭裸腹溞急、慢性PNEC分別為5.20 μg·L-1和7.66×10-2μg·L-1。由表11可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞急、慢性的RQ分別為0.88、37.13；對(duì)發(fā)頭裸腹溞急、慢性的RQ分別為1.38、74.93，故25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞(急性)風(fēng)險(xiǎn)可接受，但對(duì)發(fā)頭裸腹溞(急性)風(fēng)險(xiǎn)不可接受，且對(duì)溞類(慢性)風(fēng)險(xiǎn)不可接受。因此，該藥需要進(jìn)一步高級(jí)效應(yīng)分析驗(yàn)證。

表9 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)發(fā)頭裸腹溞生長發(fā)育和繁殖的影響Table 9 Effects of 25 g·L-1 penoxsulam OD on growth and reproduction of Moina irrasa

2.4.2 五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物的高級(jí)效應(yīng)分析

以TOP-RICE模型分析得到的連平-苗期、南昌-苗期這2種場景下的五氟磺草胺預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)分別為8.11 μg·L-1和4.00 μg·L-1作為進(jìn)一步無脊椎動(dòng)物(急、慢性)高級(jí)效應(yīng)分析的預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)(表10)。通過ECOTOX、HPVIS和EFSA Journal數(shù)據(jù)庫等獲取五氟磺草胺對(duì)8種無脊椎動(dòng)物毒性數(shù)據(jù)(表2)，構(gòu)建了物種敏感性分布曲線，計(jì)算出該藥劑對(duì)無脊椎動(dòng)物急、慢性的5%物種危害濃度(HC5)分別為37.89 μg·L-1和3.24 μg·L-1，因此無脊椎動(dòng)物急、慢性PNEC分別為12.63 μg·L-1和1.08 μg·L-1。由表12可知，在連平-苗期五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物急、慢性的RQ分別為0.64和7.51；在南昌-苗期五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物急、慢性的RQ分別0.32和3.70，故五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物(急性)風(fēng)險(xiǎn)可接受，但對(duì)無脊椎動(dòng)物(慢性)風(fēng)險(xiǎn)不可接受。由圖2可知，同物種的無脊椎動(dòng)物(急、慢性)對(duì)五氟磺草胺的敏感性排序存在明顯差異，大型溞(急、慢性)相對(duì)于其他物種而言對(duì)五氟磺草胺的敏感性較高。

圖1 25g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露條件下大型溞和發(fā)頭裸腹溞的存活率變化注：(a) 大型溞；(b) 發(fā)頭裸腹溞。Fig. 1 The survival rate of Daphnia magna and Moina irrasa exposed to 25 g·L-1 penoxsulam ODNote: (a) Daphnia magna; (b) Moina irrasa.

表10 五氟磺草胺初級(jí)暴露分析的峰值和時(shí)間加權(quán)平均濃度Table 10 Environmental exposure concentrations of penoxsulam by junior exposure analysis

3 討論(Discussion)

截至2017年，南方稻區(qū)約占我國水稻播種面積的94%，相應(yīng)地水稻種植期間農(nóng)藥的大規(guī)模使用對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的可能風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注[42]。尋找更加適合評(píng)價(jià)南方稻區(qū)農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的指示生物，為稻田系統(tǒng)精準(zhǔn)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更可靠的科學(xué)依據(jù)十分重要。在生態(tài)毒理學(xué)測試中，國際上最常用的無脊椎動(dòng)物有鉤蝦、大型溞等[43]。大型溞作為一種模式生物，一直被我國廣泛應(yīng)用，卻忽視了我國幅員遼闊、南北地區(qū)地理和氣候差異、水環(huán)境中物種分布情況不一致等特點(diǎn)，因此在選擇稻區(qū)農(nóng)藥毒理學(xué)檢測指示生物要因地制宜，以便提供更加準(zhǔn)確的技術(shù)支持。

本研究對(duì)發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)采用25 ℃的試驗(yàn)條件，因有研究表明發(fā)頭裸腹溞的最適生殖溫度為25～30 ℃，25 ℃時(shí)累積生殖量最大[44]，且水稻生長發(fā)育最適溫度為25～30 ℃，綜合考慮采用25 ℃的試驗(yàn)條件能夠準(zhǔn)確體現(xiàn)發(fā)頭裸腹溞在自然水環(huán)境中受農(nóng)藥作用后的反應(yīng)，更符合田間實(shí)際情況。通過急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)結(jié)果可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性毒性均為高毒，其對(duì)發(fā)頭裸腹溞的48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)低于對(duì)大型溞的48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，表明對(duì)同一污染物發(fā)頭裸腹溞比大型溞更為敏感。

OECD 211標(biāo)準(zhǔn)[33]方法中規(guī)定了大型溞的繁殖試驗(yàn)為21 d，而對(duì)發(fā)頭裸腹溞的繁殖試驗(yàn)未見詳細(xì)規(guī)定。發(fā)頭裸腹溞與大型溞屬于2個(gè)溞屬，其生長和繁殖存在差異(表8和表9)。由圖1可知，發(fā)頭裸腹溞僅16 d就完成一個(gè)世代，其繁殖速度遠(yuǎn)快于大型溞，因第15天、第16天存活的母溞數(shù)量少且不產(chǎn)溞，故選擇14 d作為發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)周期，其更能反映出發(fā)頭裸腹溞在25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露水環(huán)境中的整個(gè)生長、繁殖周期情況。繁殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞及發(fā)頭裸腹溞的首次蛻殼時(shí)間、蛻皮數(shù)影響均不顯著，甲殼類動(dòng)物等正常蛻皮是由蛻皮激素類生長調(diào)節(jié)劑所誘導(dǎo)，而五氟磺草胺主要是造成合成植物新組織所必需的支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)代謝障礙而致效[21-23]，并未對(duì)蛻皮激素起到抑制作用，從而未影響溞的蛻殼時(shí)間、蛻皮數(shù)。但本研究發(fā)現(xiàn)，濃度高于1.25×10-2mg a.i.·L-1時(shí)，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞的蛻皮數(shù)影響顯著，可能是因?yàn)樵囼?yàn)過程中大型溞存在死亡現(xiàn)象，導(dǎo)致濃度組的脫殼次數(shù)顯著下降。發(fā)頭裸腹溞的首胎時(shí)長比大型溞短，可能是因?yàn)榘l(fā)頭裸腹溞培養(yǎng)溫度高于大型溞。有研究表明，溫度升高可加快枝角類性成熟，從而縮短首胎時(shí)長[45]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞首胎時(shí)長影響不顯著，卻對(duì)發(fā)頭裸腹溞首胎時(shí)長影響顯著，發(fā)頭裸腹溞暴露在1.53×10-3～6.13×10-3mg a.i.·L-1的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑下，首胎時(shí)長隨著濃度提高逐漸縮短，可能是由于低劑量農(nóng)藥刺激性腺發(fā)育所致[46]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)影響顯著，但對(duì)平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)、壽命影響不顯著；對(duì)發(fā)頭裸腹溞的平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)、平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞胎數(shù)和首胎時(shí)長影響顯著，但對(duì)壽命影響不顯著。綜合結(jié)果可知，大型溞等溞類的繁殖能力是比壽命更加敏感的評(píng)價(jià)指標(biāo)[47-49]，而繁殖能力通常以首胎時(shí)長、產(chǎn)胎數(shù)和平均存活個(gè)體產(chǎn)幼溞數(shù)等端點(diǎn)值來考察[47,50]。而25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露作用下，發(fā)頭裸腹溞所表現(xiàn)出繁殖能力的敏感性指標(biāo)比大型溞多。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑雖對(duì)大型溞、發(fā)頭裸腹溞的平均存活時(shí)間影響不顯著，但在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨作用濃度增加發(fā)頭裸腹溞存活率逐漸下降，存活時(shí)間也隨著濃度的提高而縮短，說明25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)溞類存在慢性致死性(圖1)。如果溞類長期生存在本試驗(yàn)濃度的自然環(huán)境中，其種群數(shù)量將受到影響。

表11 五氟磺草胺初級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)商值(RQ)(連平-苗期)Table 11 Risk quotient (RQ) of penoxsulam by junior exposure analysis (Lianping-seedling)

表12 五氟磺草胺高級(jí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)商值Table 12 Risk quotient of penoxsulam by advanced exposure analysis

圖2 五氟磺草胺暴露下無脊椎動(dòng)物的物種敏感性分布注：(a) 無脊椎動(dòng)物急性毒性；(b) 無脊椎動(dòng)物慢性毒性。Fig. 2 Species sensitivity distribution of invertebrates exposed to penoxsulamNote: (a) Acute toxicity of invertebrates; (b) Chronic toxicity of invertebrates.

本研究經(jīng)TOP-RICE暴露模型初級(jí)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)大型溞的急性風(fēng)險(xiǎn)可接受，但對(duì)發(fā)頭裸腹溞的急性、對(duì)無脊椎動(dòng)物(慢性)風(fēng)險(xiǎn)不可接受；進(jìn)一步采用SSD法高級(jí)評(píng)估可知，五氟磺草胺對(duì)無脊椎動(dòng)物的急性風(fēng)險(xiǎn)可接受，但對(duì)無脊椎動(dòng)物的慢性風(fēng)險(xiǎn)仍然不可接受，表明五氟磺草胺對(duì)南方溞種發(fā)頭裸腹溞的繁殖水平，即種群規(guī)模的發(fā)展有潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)?？赡苁且?yàn)樵谒锘虻咎镏?，五氟磺草胺主要通過光解作用和生物方式降解[51]，其代謝產(chǎn)物主要有11種，其中有一些代謝物在環(huán)境中具有更長的殘留時(shí)間，并比母體更難被檢測[52]。Cattaneo等[53]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚長時(shí)間暴露于含五氟磺草胺的稻田水后，其腦和肝會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，但在水中卻未檢測到五氟磺草胺，推測可能是緣于五氟磺草胺形成的代謝物。建議在稻田苗期施用五氟磺草胺時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書的用藥量，切不可過量；應(yīng)較好地控制水稻在各時(shí)期的稻田用水量，以免農(nóng)藥在土壤中隨水快速下滲遷移，對(duì)無脊椎動(dòng)物產(chǎn)生不良影響。

綜上可知，本研究通過急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)考察25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)溞類的毒性致死效應(yīng)，并通過繁殖試驗(yàn)深入評(píng)價(jià)其對(duì)溞類的毒性強(qiáng)度，結(jié)果顯示發(fā)頭裸腹溞比大型溞繁殖速度更快、敏感性更高，而從worst-case原則出發(fā)，在對(duì)廣泛分布于我國南方的稻區(qū)進(jìn)行水環(huán)境污染檢測和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)，建議采用分布于南方各省并對(duì)化學(xué)物質(zhì)更為敏感的發(fā)頭裸腹溞作為指示生物，但由于本研究僅采用稻田用量最大的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對(duì)模式生物大型溞和南方常見物種發(fā)頭裸腹溞進(jìn)行毒力差異比較，而不同作用機(jī)理的農(nóng)藥品種繁多，該推論可靠性還有待進(jìn)一步研究，以為今后開展不同氣候帶環(huán)境生物安全的精準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。