Ang1～7對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡的影響

位印，吳澤勇，黃海華，彭智

1.天津市天津醫(yī)院整形外科，天津 300211；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科，廣東 湛江 524000

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma，IH)是兒童常見的腫瘤，多見于女孩、雙胞胎、早產(chǎn)兒、低出生體質(zhì)量以及白色人種嬰兒[1]。IH 增殖期的持續(xù)時間為8～12個月[2]，一般在5～10年內(nèi)緩慢消退[3]，在組織病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)單個小動脈供血的多結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)[4]，結(jié)節(jié)由增生性內(nèi)皮細胞組成，隨著血管瘤逐漸消退，纖維化變得愈發(fā)明顯[5]。IH 的發(fā)病機理仍未闡明，普遍認(rèn)為與新血管生成相關(guān)，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等在增殖期嬰幼兒血管瘤中高表達[6-7]，而這些因子促進新血管生成。在缺氧時，促血管生成作用相較于抗血管生成作用更強，從而使腫瘤細胞和基質(zhì)細胞表達VEGF、bFGF 等而促進血管生成[8-9]。ITINTEANG等[10]研究表明腎素血管緊張素系統(tǒng)經(jīng)典軸中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和血管緊張素Ⅱ受體2(ATⅡR2)在血管瘤中表達，經(jīng)典軸中的血管緊張素Ⅱ可促使嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞(Hem ECs)的增殖[11]。腎素血管緊張素系統(tǒng)中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)-Ang1～7-Mas受體新軸被認(rèn)為是經(jīng)典軸的反調(diào)節(jié)軸[12-13]。腎素血管緊張素系統(tǒng)已被證實在多種腫瘤中存在[14]，Ang1～7 可發(fā)揮抑制肝癌增殖、抑制血管生成及促進腫瘤凋亡作用，機制可能為下調(diào)AT ⅡR1 和上調(diào) ATⅡR 2 以及 Mas 受體[15]。PEI 等[16]發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)Mas 受體mRNA 和蛋白的表達水平顯著上調(diào)，Ang1～7的增加可明顯抑制細胞的增殖和遷移。在鼻咽癌的異種移植中，Ang1～7顯著減小了鼻咽癌體積，而且顯著降低血管密度。此外，研究發(fā)現(xiàn)Ang1～7 可抑制VEGF 和胎盤生長因子的表達。經(jīng)典軸中ACE 和AT ⅡR2 已被學(xué)者證實在血管瘤中表達，ACE2-Ang1～7-Mas受體新軸是否也存在，是否反向調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對Hem ECs 的作用，為此本課題研究了Ang1～7對Hem ECs的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要實驗試劑 實驗標(biāo)本來自于2016—2017 年廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科經(jīng)手術(shù)切除的未經(jīng)任何治療的增殖期的嬰幼兒血管瘤組織塊3例，患兒家屬知情同意，人臍靜脈內(nèi)皮細胞由廣州萊德爾生物科技有限公司提供，Ang1～7 由MEC公司提供，Ang1～7 Mas 受體兔抗人多克隆抗體購于Alomone 公司，Annexin V-FITC 試劑盒由 Keygen 公司提供，SYBR Green qPCR SuperMix 由 Invitrogen 公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hem ECs 的培養(yǎng)及傳代 超凈臺內(nèi)磷酸鹽緩沖(PBS)液沖洗新鮮嬰幼兒血管瘤組織標(biāo)本，將組織塊剪成1 mm3大小，平鋪在細胞培養(yǎng)瓶壁，緩緩翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入1.5 mL血管瘤內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，4～6 h后翻轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)瓶，48 h后更換細胞培養(yǎng)液，定期更換培養(yǎng)液。輕敲細胞培養(yǎng)瓶，使貼于瓶底的血管瘤組織塊松脫，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入胰酶消化1 min后加入血管瘤內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，1：3接種，用進入對數(shù)增長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 Hem ECs 的鑒定培養(yǎng) 所得細胞經(jīng)多聚甲醛固定0.5 h、山羊血清封閉0.5 h、一抗(1：200)第Ⅷ因子相關(guān)抗原兔抗人抗體4℃孵育過夜、滴加標(biāo)記二抗(1：200)鼠抗兔第二抗體，室溫避光孵育1 h 后加入C液室溫孵育0.5 h，DAB顯色，蘇木素染色(空白對照組滴加PBS液)，封片拍照。

1.2.3 Hem ECs 中 Mas 受體 mRNA 及蛋白質(zhì)的表達 將Hem ECs 和Mas 受體陽性對照人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)分別進行RNA 抽提，檢測RNA 純度和完整性并進行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR，設(shè)計的Mas、18s rRNA引物序列見表1。準(zhǔn)備Hem ECs、HUVEC、等離子水上機，95℃ 5 min，95℃ 15 s，65℃ 15 s，72℃ 32 s，40 個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3 次。ΔΔCt=血管瘤內(nèi)皮細胞組(目標(biāo)基因Ct-內(nèi)參Ct)-HUVEC 組(目標(biāo)基因Ct-內(nèi)參 Ct)，相對表達量=2-ΔΔCt值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。進行Hem ECs 及陽性對照HUVEC 總蛋白抽提及BCA法蛋白溶液濃度測定。SDS-PAGE 電泳用80 V 至指示染料分離膠，繼而用120 V 至染料剛出膠底部，轉(zhuǎn)PVDF 膜，封閉后加入一抗稀釋液(1：200)4℃冰箱過夜，滴加二抗稀釋液(1：20 000)孵育1 h，涂抹化學(xué)發(fā)光液后曝光顯影。

1.2.4 Ang1～7 對 Hem ECs 增 殖 及 Mas 受 體mRNA表達的影響 調(diào)整血管瘤內(nèi)皮細胞懸液濃度為1×105個/mL，每孔接種細胞懸液100 μL，將不同濃度(0、0.01 μmol/L、0.10 μmol/L、5.00 μmol/L及10.00 μmol/L)Ang1～7 加入 Hem ECs 中，分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h后收集各個時間點細胞加入檢測試劑，酶標(biāo)儀讀數(shù)。qRT-PCR 檢測Ang1～7(10 μmol/L)作用于血管瘤內(nèi)皮細胞24 h、48 h的Mas受體mRNA的表達，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參Ct，△△Ct=待測樣品中目的基因△Ct-空白對照組中目的基因△Ct，所得相對表達量=2-ΔΔCt值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

基因Mas-F Mas-R 18s rRNA-F 18s rRNA-R引物序列5"～3′CTTCGCTATGCCCATGAGA AGCCCTGGTCAGAACAACTT CCTGGATACCGCAGCTAGGA GCGGCGCAATACGAATGCCCC

1.2.5 流式細胞儀檢測Ang1～7 對Hem ECs凋亡的影響 實驗分組為空白對照組和Ang1～7(10 μmol/L)組，將Hem ECs懸液調(diào)整細胞密度約1×106個細胞/mL，取0.5 mL置于離心管內(nèi)，加入10 μmol/L Ang1～7，分別在0 h、24 h、48 h滴加1.25 μL Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min并離心，用0.5 mL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液輕輕重懸，加入10 μL Propidium Iodide，用流式細胞儀檢測分析Hem ECs的凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有實驗進行三次重復(fù)實驗，實驗結(jié)果中計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用Student"s t test檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HemECs 的培養(yǎng)及鑒定 從血管瘤組織塊中成功培養(yǎng)出HemECs，200倍倒置顯微鏡下細胞呈多角形或梭形，待細胞融合后呈“旋渦狀”排列，第Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性，見圖1。

2.2 血管瘤內(nèi)皮細胞Mas受體的表達 qRT-PCR結(jié)果表明血管瘤內(nèi)皮細胞中有Mas 受體mRNA 的表達，與HUVEC 相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot 結(jié)果表明血管瘤內(nèi)皮細胞中有Mas 受體蛋白質(zhì)的表達，與HUVEC 相比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見圖2。

圖1 體外培養(yǎng)的HemECs形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果及細胞鑒定(200×倒置顯微鏡下)

圖2 Hem ECs中有Mas受體mRNA及蛋白的表達

2.3 Ang1～7 對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及Mas 受體表達的影響 Ang1～7濃度大于1.00 μmol/L時可發(fā)揮抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的作用，10 μmol/L抑制細胞增殖的作用最明顯，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，見圖3?？瞻讓φ战M、Ang1～7組24 h、48 h血管瘤內(nèi)皮細胞的 Mas 受體 mRNA 的相對表達量=2-ΔΔCt值，見表2。實驗數(shù)據(jù)表明Ang1～7與空白對照組24 h相比較時，血管瘤內(nèi)皮細胞Mas受體mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ang1～7 與空白對照組48 h相比較時，血管瘤內(nèi)皮細胞Mas受體mRNA的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示Ang1～7 可能上調(diào)Mas受體mRNA的表達，見表2。

圖3 不同濃度Ang1-7對Hem ECs增殖的影響

表2 Mas受體mRNA的相對表達量(2-ΔΔCt，)

表2 Mas受體mRNA的相對表達量(2-ΔΔCt，)

組別24 h 48 h空白對照組Ang1-7組t值P值1.00±0.00 1.37±0.25-2.068 0.175 1.67±0.48 5.46±0.60-5.307 0.006

2.4 Ang1～7 對血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響 Ang1～7 作用于Hem ECs后24 h細胞總凋亡率為(0.79±0.13)%；48 h 細胞總凋亡率為(1.48±0.18)%，與空白對照組相比，Ang1～7組在48 h細胞凋亡率顯著增高，提示Ang1～7可能誘導(dǎo)Hem ECs的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 Ang1～7作用于Hem ECs 24 h、48 h細胞凋亡情況

3 討論

近年來，ACE2-Ang1～7-Mas 受體新軸受到了研究者的廣泛關(guān)注，RAS系統(tǒng)經(jīng)典軸在嬰幼兒血管瘤中可能發(fā)揮作用已有學(xué)者證實[10-11]，為了解其發(fā)病機制提供了一個新思路。本實驗研究RAS 系統(tǒng)新軸中Mas 受體在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中是否存在，以及重要肽Ang1～7 對其增殖及凋亡的影響，完善了RAS系統(tǒng)在嬰幼兒血管瘤中可能發(fā)揮的作用。本實驗研究表明嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中存在Mas 受體mRNA 及蛋白質(zhì)的表達，且Ang1～7 可抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖、促進其凋亡并上調(diào)Mas受體mRNA的表達，這表明Ang1～7 極有可能通過上調(diào)Mas 受體而發(fā)揮抑制細胞增殖及促進細胞凋亡作用，通過此實驗也進一步證實RAS 系統(tǒng)新軸在嬰幼兒血管瘤中可能發(fā)揮促進血管瘤消退的作用。

近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在癌癥中可能發(fā)揮作用，在頭頸部鱗狀細胞癌[17]、結(jié)腸腺癌肝轉(zhuǎn)移[18]、轉(zhuǎn)移性大腦黑色素瘤[19]、人膠質(zhì)母細胞瘤[20]等多種類型的癌癥中，腫瘤干細胞有RAS系統(tǒng)中ACE、血管緊張素Ⅱ受體等的表達。在人膠質(zhì)母細胞瘤[20]中，ACE、血管緊張素Ⅱ受體等分布于微血管局部[21]，這些研究表明，通過調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)可能為膠質(zhì)母細胞瘤等多種癌癥提供新的靶點[22]。Ang1～7也可顯著抑制前列腺癌DU145癌細胞的增殖[23]。LUO等[24]發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌相較于乳腺良性疾病Mas 水平顯著降低，Mas 受體與表皮生長因子受體(EGFR)、EGFR-2 的表達以及細胞增殖均呈負相關(guān)。在表達Mas受體的乳腺癌細胞系4T1以及MDA-MB-468中，Ang1～7 可作用于Mas 受體而抑制乳腺癌細胞系的增長及侵襲等，而下調(diào)Mas受體可削弱這種作用。PAULA 等[25]以“ACE”、“Ang1～7”、“ACE2”、“Ang Ⅱ ”、“Mas 受體”、“兒科”和“腫瘤”等為關(guān)鍵字在Pubmed、Scopus和Scielo數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)文獻，說明Ang1～7可抑制腫瘤生長，減少局部炎癥和血管生成。

ITINTEANG等[26]通過免疫組織化學(xué)、質(zhì)譜分析及NanoString 技術(shù)等證實血管瘤中有組織蛋白酶B、D、G 的表達。組織蛋白酶B 促進腎素的產(chǎn)生，而D 則促進血管緊張素原向血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)轉(zhuǎn)化，組織蛋白酶G 促進AngⅠ向AngⅡ轉(zhuǎn)化，組織蛋白酶B、D 和G可阻止AngⅡ的產(chǎn)生，AngⅡ可促血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖[11]，組織蛋白酶B、D和G可能調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)而在嬰幼兒血管瘤中發(fā)揮作用。嬰幼兒血管瘤中RAS 系統(tǒng)研究的逐漸深入將為嬰幼兒血管瘤的治療提供更多可能有效的靶點。