柴桂棗安湯對失眠模型大鼠的治療作用及其機制

胡春艷，郭齊，劉港，劉雪玲，查心儀，高雨欣，周睿晨，陸素琴

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院腦病科，江蘇 鎮(zhèn)江 212003)

失眠是一種常見的臨床睡眠障礙疾病，主要表現(xiàn)為難以啟動或維持睡眠[1]。長期失眠不僅會帶來嚴重的精神心理負擔，還會引起機體抵抗力、注意力、記憶力等下降，且會增加患者心腦血管事件發(fā)生率[2-3]。目前，西醫(yī)臨床仍以藥物治療為主，但一些傳統(tǒng)的治療藥物存在不良反應(yīng)多、藥物依賴性等缺陷[4]。中醫(yī)學中失眠癥屬于“不寐”范疇，中醫(yī)藥治療失眠不良反應(yīng)小，無成癮性的優(yōu)點使其受到越來越多的認同[5]。柴桂棗安湯為鎮(zhèn)江市中醫(yī)院陸素琴院長根據(jù)臨床多年經(jīng)驗所得的經(jīng)驗方，是以桂枝湯、小柴胡湯、甘麥大棗湯為基本方加減而成，主要由川桂枝、醋柴胡、炒白芍、淡黃芩、法半夏、酸棗仁、生龍骨等組成。目前，臨床研究表明柴桂棗安湯對肝膽氣滯型失眠的治療有顯著作用，但是其相關(guān)的作用機制尚不清晰。因此，本研究采用對氯苯丙氨酸(p-Chlorophenylalanine，PCPA)建立失眠模型大鼠，觀察其自發(fā)活動并分析血清生化指標，以初步探討柴桂棗安湯改善睡眠的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

雄性SPF級6周齡SD大鼠25只，體重(210.23±8.44)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究遵從國際有關(guān)動物實驗和臨床研究的基本倫理和準則，并通過江蘇大學動物倫理委員會批準。

柴桂棗安湯由鎮(zhèn)江市中醫(yī)院提供，組成：川桂枝9 g、醋柴胡20 g、炒白芍12 g、淡黃芩6 g、法半夏15 g、酸棗仁30 g、生龍骨30 g (先下)、生牡蠣30 g (先下)、制遠志15 g、合歡皮30 g、夏枯草10 g、川厚樸10 g、茯苓神30 g、夜交藤30 g、淮小麥30 g、炙甘草6 g、紅棗10 g、生姜6 g。

Bcl-2、 Bax、IL-2、IL-6、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) ELISA檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 將25只大鼠隨機均分成 5 組，即正常組，模型組，陽性藥組，柴桂棗安湯高、低劑量組，每組5只。除正常組外，各組于每天8:00-9:00腹腔注射350 mg/kg的PCPA，按1 mL/100 g體重給藥，正常組給予等體積生理鹽水，連續(xù)注射3 d。觀察大鼠行為，出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失表明模型制備成功。造模成功后第1天，柴桂棗安湯高(30 g/kg)、低劑量組(15 g/kg)，陽性藥組(地西泮1 g/kg)，按照1 mL/100 g體重灌胃給藥，正常組與模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。

1.2.2 大鼠自發(fā)活動實驗 造模成功后將大鼠置于干凈的飼養(yǎng)籠中提前適應(yīng)3 min，記錄各組大鼠2 min內(nèi)自主活動時間和前肢離地舉立次數(shù)作為正?；顒臃磻?yīng)指標。末次給藥后1 h再次測量各組大鼠上述指標。

1.2.3 血清生化指標分析 大鼠采用10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血8～10 mL，未抗凝；4 ℃凝固60 min；4 ℃，3 500 r/min離心15 min，取血清；于-80 ℃冰箱保存待測。按試劑盒說明書進行操作，檢測BDNF、Bcl-2、Bax、IL-2、IL-6、GFAP含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 柴桂棗安湯抑制失眠模型大鼠的自主活動

給藥前，模型組較正常組活動時間延長且站立次數(shù)顯著增加(P<0.05)，說明失眠模型建立成功。給藥后，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組活動時間較給藥前明顯縮短(P<0.05)，陽性藥組、柴桂棗安高劑量組站立次數(shù)較給藥前明顯減少(P<0.05)，說明柴桂棗安湯能抑制失眠大鼠的自主活動。見表1。

表1 柴桂棗安湯對大鼠活動時間及站立次數(shù)的影響

2.2 柴桂棗安湯對大鼠血清BDNF及GFAP含量的影響

與正常組比較，模型組血清中BDNF含量顯著降低(P<0.05)，GFAP含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組和柴桂棗安湯高劑量組血清中BDNF含量顯著升高(P<0.05)，GFAP含量顯著降低(P<0.05)，柴桂棗安湯低劑量組GFAP含量顯著降低(P<0.05)，BDNF含量有所升高但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與柴桂棗安湯低劑量組相較，柴桂棗安湯高劑量組血清BDNF含量明顯升高，GFAP含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BDNF及GFAP含量比較

2.3 柴桂棗安湯對大鼠血清細胞因子含量的影響

與正常組比較，模型組血清中IL-6與IL-2含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組大鼠血清中IL-6與IL-2水平顯著升高(P<0.05)；與柴桂棗安湯高劑量組比較，柴桂棗安湯低劑量組IL-6含量明顯升高(P<0.05)，IL-2含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清細胞因子含量比較

2.4 柴桂棗安湯對大鼠血清凋亡相關(guān)因子含量的影響

與正常組比較，模型組血清中Bcl-2含量與Bcl-2/Bax比值顯著降低，Bax含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組大鼠血清中Bcl-2含量及Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，Bax含量無顯著性差異。柴桂棗安湯高劑量組血清Bcl-2含量與Bcl-2/Bax比值較柴桂棗安湯低劑量組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清凋亡相關(guān)因子含量比較

3 討論

失眠是指患者對睡眠時間或質(zhì)量不滿且影響白天社會功能的一種主觀體驗，是一種常見的睡眠障礙疾病[6]。其發(fā)病機制復雜，由身體因素及精神因素多方面影響，所以病程長且遷延不愈[7]。中醫(yī)學認為正常的睡眠依賴于“陰平陽秘”。若陰陽失交，則發(fā)為不寐[8]。該病病位在心，與肝脾胃腎密切相關(guān)。中醫(yī)藥可調(diào)整人體臟腑氣血的功能，改善患者睡眠狀況，且不會產(chǎn)生藥物依賴和嚴重的毒副作用，廣泛用于臨床[9]。本研究結(jié)果顯示，用柴桂棗安湯干預失眠模型大鼠后，大鼠的活動時間縮短且站立次數(shù)減少，說明柴桂棗安湯能有效抑制失眠大鼠的自主活動，改善其失眠癥狀。本實驗采用高、低兩個劑量對PCPA所致失眠模型大鼠進行干預，均對大鼠的失眠癥狀具有改善作用。

目前認為失眠的主要發(fā)病機制包括中樞神經(jīng)遞質(zhì)分泌的失調(diào)、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元系統(tǒng)功能受到抑制、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進、褪黑素分泌水平下降以及細胞因子分泌失調(diào)等[10]。神經(jīng)營養(yǎng)因子參與神經(jīng)元存活、生長并維持海馬結(jié)構(gòu)，受損的神經(jīng)元在其存在的情況下具有再生的能力[11]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有促進神經(jīng)細胞生長發(fā)育，防止神經(jīng)細胞損傷的功能。另外，BDNF還可參與調(diào)節(jié)睡眠—覺醒穩(wěn)態(tài)[12]。本研究結(jié)果顯示，柴桂棗安湯能有效升高失眠模型大鼠血清中BDNF含量，且高劑量組較低劑量組升高更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與BDNF含量升高有關(guān)，且具有劑量依賴性。GFAP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，神經(jīng)元的損傷、修復、再生和可塑性等作用[13]。GFAP為星形膠質(zhì)細胞活化的標志物，其含量增高代表星形膠質(zhì)細胞活化增加，神經(jīng)元處于應(yīng)激損傷狀態(tài)。星形膠質(zhì)細胞能直接或活化后通過調(diào)控分泌多種細胞因子間接參與睡眠調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，給予柴桂棗安湯干預后，失眠模型大鼠血清中GFAP含量顯著降低，且高劑量組較低劑量組降低更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與抑制星形膠質(zhì)細胞增生活化有關(guān)，并且其對GFAP含量的降低作用具有劑量依賴性。細胞因子在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)維持機體穩(wěn)態(tài)中起重要作用。其中，IL-2能通過抑制脂質(zhì)過氧化及升高Bcl-2基因表達從而抑制神經(jīng)細胞凋亡[14]。IL-6與其受體結(jié)合后能與gp130結(jié)合形成二聚體從而發(fā)揮抗凋亡作用[15]。有研究表明IL-2、IL-6也可參與調(diào)節(jié)睡眠—覺醒穩(wěn)態(tài)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，柴桂棗安湯能有效提高失眠模型大鼠血清中與失眠相關(guān)細胞因子IL-2及IL-6含量，且高劑量組較低劑量組IL-2變化更為顯著，說明柴桂棗安湯可通過調(diào)節(jié)細胞因子IL-2及IL-6含量來干預失眠，并且對IL-2的調(diào)節(jié)呈劑量依賴性。細胞凋亡是一個由多基因控制細胞主動死亡的過程,主要受促凋亡基因和抑凋亡基因共同調(diào)節(jié)。Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡,而Bax可與Bcl-2結(jié)合，阻止Bcl-2激活，加速凋亡過程。既往研究表明，Bcl-2/Bax降低可能與睡眠剝奪有關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，柴桂棗安湯能顯著升高失眠模型大鼠血清中Bcl-2含量，但對Bax含量無顯著影響，說明柴桂棗安湯主要通過調(diào)節(jié)血清中Bcl-2含量來調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值。此外,給予柴桂棗安湯干預后失眠模型大鼠血清中Bcl-2/Bax比值有明顯的升高，且高劑量組較低劑量組升高更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl-2/Bax有關(guān)，并且呈劑量依賴性。

本研究運用柴桂棗安湯干預腹腔注射PCPA致失眠大鼠，發(fā)現(xiàn)柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)保護因子BDNF水平，凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和細胞因子IL-2、IL-6水平，抑制星形膠質(zhì)細胞增生、活化有關(guān)。