基于響應(yīng)面法的蟹味菇原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化

馮婷婷，宋天磊，春 霞，劉超雄，李亞嬌，慕宗杰，孫國(guó)琴，于傳宗，王海燕，郭九峰

（1.內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

蟹味菇（Hypsizygus marmoreus），是食用菌界的新秀，屬擔(dān)子菌亞門、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，又名真姬菇、斑玉蕈、玉蕈等，外形美觀、口感獨(dú)特，低熱量、低脂肪，是一種藥食兼用的珍貴食用菌，含有較豐富的SOD、CAT、膽堿等天然抗氧化活性物質(zhì)，具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，王金梅等[1]研究表明，蟹味菇多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制有一定的影響，蟹味菇多糖可顯著改善由環(huán)磷酰胺所致小鼠脾臟指數(shù)下降。在市場(chǎng)上頗受歡迎。其子實(shí)體含有豐富的維生素、粗蛋白、粗脂肪、多糖、多肽、氨基酸和多種人體必需的礦物質(zhì)，特別是菌柄，所含營(yíng)養(yǎng)種類豐富[2-3]。此外，蟹味菇的菌蓋具有較高的清除超氧自由基、羥自由基能力[4-5]。目前，我國(guó)的蟹味菇工廠化栽培已具有一定規(guī)模[6-7]。

對(duì)蟹味菇的育種研究也取得一定進(jìn)展，董先茹等[8]對(duì)蟹味菇菌株離子束誘變選育進(jìn)行了研究，篩選出綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的誘變菌株。以原生質(zhì)體為材料選育優(yōu)良菌株在微生物食用菌領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用[9-12]，張卉等[13]通過(guò)對(duì)姬松茸原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，獲得了液體培養(yǎng)條件下高產(chǎn)胞外多糖的誘變菌株?；谠|(zhì)體的敏感性[14]，以蟹味菇原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料，進(jìn)行誘變、菌種選育等領(lǐng)域的研究。同時(shí)，菌種改良、原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體融合等均對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率有一定的前提要求，因此，優(yōu)化蟹味菇原生質(zhì)體的制備及再生條件有重要價(jià)值。此外，響應(yīng)面法較正交試驗(yàn)方法精度更高，能夠得到更可靠的結(jié)果，目前在蟹味菇原生質(zhì)體制備及條件優(yōu)化方面未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以蟹味菇菌絲體為材料，以原生質(zhì)體制備產(chǎn)量、再生率為指標(biāo)，對(duì)制備條件：菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化，旨在獲得蟹味菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件，為原生質(zhì)體的融合、體細(xì)胞誘變、基因編輯等研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 蟹味菇菌株，由內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保留。溶壁酶，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 加強(qiáng)液體搖瓶培養(yǎng)基：180～200 g/L去皮馬鈴薯，10 g/L蔗糖，10 g/L葡萄糖，1.6 g/L蛋白胨，1.6 g/L酵母提取粉，1.0 g/L K2HPO3，0.5 g/L MgSO4。

PDA 固體培養(yǎng)基：成分同液體培養(yǎng)基，另添加瓊脂10 g/L。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：180～200 g/L去皮馬鈴薯，10 g/L蔗糖，10 g/L葡萄糖，10 g/L 瓊脂，1.6 g/L蛋白胨，1.6 g/L 酵母提取粉，1.0 g/L K2HPO3，0.5 g/L MgSO4，硫酸鏈霉素100 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟹味菇菌絲體活化培養(yǎng) 蟹味菇菌絲體，切取0.3 mm×0.3 mm 小方塊狀，接種至PDA 固體培養(yǎng)基活化2次，25℃恒溫暗培養(yǎng)觀察。

1.2.2 菌絲體液體搖瓶培養(yǎng) 取固體培養(yǎng)活化所得菌絲體，同切取3 mm×3 mm 小方塊狀，接種至PDA液體搖瓶培養(yǎng)基，于搖床150 r/min，25℃恒溫暗培養(yǎng)觀察。

1.2.3 蟹味菇原生質(zhì)體的制備 0.6 mol/L甘露醇：稱取10.93 g甘露醇溶于100 mL 無(wú)菌水。經(jīng)0.22 μm 微孔過(guò)濾器滅菌后備用。2%溶壁酶：稱取0.02 g 溶壁酶溶于1 mL 滲透壓穩(wěn)定劑。經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器滅菌后備用。

取液體搖瓶培養(yǎng)一定時(shí)間后的球狀菌絲體200 mg 于2 mL 離心管中，依次用無(wú)菌水和滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，4 000 r/min 離心5.5 min，棄上清。加入溶壁酶200 μL，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，待酶解后，加入適量甘露醇洗滌3 500 r/min 離心5 min，取上清液用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，過(guò)濾后離心，棄上清后所得即純化后的原生質(zhì)體液。將所得原生質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，在光學(xué)顯微鏡40倍鏡下，用XB-K-25 型號(hào)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.2.4 原生質(zhì)體的再生 取制備后的原生質(zhì)體，調(diào)整到合適的濃度，取200 μL，涂板于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基，重復(fù)3次。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別探究制備條件：菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。（1）菌齡：固定溶壁酶濃度2 %，滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇，酶解時(shí)間3 h，探究菌齡：5、6、7、8、9 d 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。（2）滲透壓穩(wěn)定劑種類：固定溶壁酶濃度2 %，滲透壓穩(wěn)定劑濃度0.6 mol/L，酶解時(shí)間3 h，菌齡7 d，探究不同滲透壓穩(wěn)定劑：蔗糖、甘露醇、NaCl 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。（3）溶壁酶濃度：固定滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇，酶解時(shí)間3 h，菌齡7 d，探究溶壁酶濃度：1%、2%、3%，對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。（4）酶解時(shí)間：固定溶壁酶濃度2%，滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇，酶解時(shí)間3 h，菌齡7 d，探究酶解時(shí)間：2、3、4、5 h 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。每組處理重復(fù)3次。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量為響應(yīng)值，制備條件：菌齡、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用Design-Expert 8.0.6、SPSS 22.0、Excel、Origin2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響 由圖1a、圖1b可見(jiàn)，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量先增加后減少，在95 %置信度下，第7 天和第8 天時(shí)制備產(chǎn)量顯著增加，在菌齡為7 d時(shí)達(dá)最大產(chǎn)量8.85×107個(gè)/mL。在6、8、9 d時(shí)原生質(zhì)體再生率增加，第6 天時(shí)效果最佳，再生率達(dá)1.502 %。

圖1 不同菌齡對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量（a）及再生率（b）的影響

2.1.2 不同種類滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生率的影響 不同種類的滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)于原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量和再生率的影響各異。由圖2a、圖2b可見(jiàn)，以甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最多，制備效果最好，差異顯著。相比之下，以蔗糖和NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，效果較差。而以蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高，其次為甘露醇、NaCl，在95 %置信度下，再生率顯著較高。綜上，在后期制備及再生試驗(yàn)中選擇甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑。

2.1.3 不同溶壁酶濃度對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生率的影響 由圖3a可見(jiàn)，隨著溶壁酶濃度的增大，原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，濃度為2%、3%時(shí)較1%時(shí)效果明顯，濃度為3 %時(shí)制備產(chǎn)量最多，達(dá)9×107個(gè)/mL。由圖3b可見(jiàn)，原生質(zhì)體再生率隨溶壁酶濃度的增大呈先增加后減少趨勢(shì)，在95%置信度下，溶壁酶濃度為2 %時(shí)，再生率最高，為0.067%。

圖2 不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量（a）及再生率（b）的影響

圖3 不同溶壁酶濃度對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量（a）及再生率（b）的影響

2.1.4 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生情況的影響 隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加，在5 h時(shí)最高，2 h時(shí)產(chǎn)量最低。同時(shí)，隨著酶解時(shí)間的變化，原生質(zhì)體再生率總體呈下降趨勢(shì)，在2 h和4 h時(shí)再生率較高，2 h時(shí)最高（圖4）。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量（a）及再生率（b）的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

基于響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表2），對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，建立多元二次回歸模型如下：

Y=120.4+1.47A+2.33B-19.18C+0.23AB-1.92AC-3.8BC-74.77A2-40.65B2-38.3C2

由表3可知，F(xiàn)值為10.89，P＜0.05，表明該模型顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.933 3，校正決定系數(shù)R2Adj=0.847 6，失擬項(xiàng)P=0.176 4＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合良好，可以用該模型分析和預(yù)測(cè)結(jié)果。A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01），C 對(duì)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），表明A、B、C 三因素對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量影響的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞溶壁酶濃度＞菌齡。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 交互作用響應(yīng)面法分析 由圖5可知，3種情況下的交互作用響應(yīng)面圖等高線均未呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說(shuō)明因素之間的交互作用不顯著。相比之下，結(jié)合3D 曲面和等高線形狀，交互項(xiàng)對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量的影響強(qiáng)弱依次為：菌齡和溶壁酶濃度、菌齡和酶解時(shí)間、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間。

2.2.2 最佳制備條件確定與驗(yàn)證 在滲透壓穩(wěn)定劑選定為甘露醇的情況下，經(jīng)Design Expert 8.0.6 軟件分析，得到蟹味菇原生質(zhì)體最佳制備條件：溶壁酶濃度2.04%、菌齡7.01 d、酶解時(shí)間3.75 h，預(yù)測(cè)制備產(chǎn)量為122.881×106個(gè)/mL，為了試驗(yàn)方便，將各條件值取為：溶壁酶濃度2 %、菌齡7 d、酶解時(shí)間4 h，在此條件下，根據(jù)所得最優(yōu)條件進(jìn)行平行試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)3次，得到蟹味菇原生質(zhì)體制備產(chǎn)量為（120.40 ±1.5）×106個(gè)/mL，與預(yù)測(cè)值相近，表明具有良好的擬合性，由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳制備參數(shù)可靠。

表3 模型方差分析

3 討論與結(jié)論

以原生質(zhì)體為試驗(yàn)對(duì)象和媒介可以打破細(xì)胞壁和遠(yuǎn)緣雜交的障礙，避免繁雜的遺傳標(biāo)記問(wèn)題，在體細(xì)胞雜交、誘變、融合以及新型微生物菌種選育和改良技術(shù)、基因組重排技術(shù)等生物學(xué)研究領(lǐng)域，已獲得穩(wěn)定遺傳、性狀優(yōu)良的新品種[15-18]。隨著科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展，在種質(zhì)資源創(chuàng)新和新型品種選育的研究中，原生質(zhì)體都有廣泛的應(yīng)用潛力和前景。制備高產(chǎn)量和高再生率的原生質(zhì)體是后續(xù)生物學(xué)研究的關(guān)鍵一步，具有重要的研究意義。已有研究表明對(duì)于不同的菌種，菌齡、酶濃度、種類、溫度、pH值等條件對(duì)原生質(zhì)體制備的產(chǎn)量和再生率影響不同[19-21]。

圖5 兩因子交互作用的響應(yīng)面

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蟹味菇原生質(zhì)體最佳的制備條件為菌齡7 d+0.6 mol/L甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑+溶壁酶濃度2%+酶解5 h。再生率最佳的制備條件為菌齡6 d+0.6 mol/L甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑+溶壁酶濃度2%+酶解3 h。響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果顯示，選擇0.6 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑為前提，經(jīng)優(yōu)化，最佳制備條件為菌齡7 d，溶壁酶濃度為2%，酶解4 h，經(jīng)檢驗(yàn)與模型預(yù)測(cè)值有良好的擬合性，相比單因素結(jié)果更可靠。酶解時(shí)間、溶壁酶濃度、菌齡三因素對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)量影響的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞溶壁酶濃度＞菌齡，以響應(yīng)面法確定的最佳制備條件可獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率。該研究可為蟹味菇原生質(zhì)體的誘變、融合、育種提供理論參考。