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    基于響應(yīng)面法的蟹味菇原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化

    2021-03-25 06:06:04馮婷婷宋天磊劉超雄李亞嬌慕宗杰孫國(guó)琴于傳宗王海燕郭九峰
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)滲透壓穩(wěn)定劑

    馮婷婷,宋天磊,春 霞,劉超雄,李亞嬌,慕宗杰,孫國(guó)琴,于傳宗,王海燕,郭九峰

    (1.內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

    蟹味菇(Hypsizygus marmoreus),是食用菌界的新秀,屬擔(dān)子菌亞門、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬,又名真姬菇、斑玉蕈、玉蕈等,外形美觀、口感獨(dú)特,低熱量、低脂肪,是一種藥食兼用的珍貴食用菌,含有較豐富的SOD、CAT、膽堿等天然抗氧化活性物質(zhì),具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值,王金梅等[1]研究表明,蟹味菇多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制有一定的影響,蟹味菇多糖可顯著改善由環(huán)磷酰胺所致小鼠脾臟指數(shù)下降。在市場(chǎng)上頗受歡迎。其子實(shí)體含有豐富的維生素、粗蛋白、粗脂肪、多糖、多肽、氨基酸和多種人體必需的礦物質(zhì),特別是菌柄,所含營(yíng)養(yǎng)種類豐富[2-3]。此外,蟹味菇的菌蓋具有較高的清除超氧自由基、羥自由基能力[4-5]。目前,我國(guó)的蟹味菇工廠化栽培已具有一定規(guī)模[6-7]。

    對(duì)蟹味菇的育種研究也取得一定進(jìn)展,董先茹等[8]對(duì)蟹味菇菌株離子束誘變選育進(jìn)行了研究,篩選出綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的誘變菌株。以原生質(zhì)體為材料選育優(yōu)良菌株在微生物食用菌領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用[9-12],張卉等[13]通過(guò)對(duì)姬松茸原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變,獲得了液體培養(yǎng)條件下高產(chǎn)胞外多糖的誘變菌株?;谠|(zhì)體的敏感性[14],以蟹味菇原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料,進(jìn)行誘變、菌種選育等領(lǐng)域的研究。同時(shí),菌種改良、原生質(zhì)體誘變、原生質(zhì)體融合等均對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率有一定的前提要求,因此,優(yōu)化蟹味菇原生質(zhì)體的制備及再生條件有重要價(jià)值。此外,響應(yīng)面法較正交試驗(yàn)方法精度更高,能夠得到更可靠的結(jié)果,目前在蟹味菇原生質(zhì)體制備及條件優(yōu)化方面未見(jiàn)報(bào)道。

    本研究以蟹味菇菌絲體為材料,以原生質(zhì)體制備產(chǎn)量、再生率為指標(biāo),對(duì)制備條件:菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化,旨在獲得蟹味菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件,為原生質(zhì)體的融合、體細(xì)胞誘變、基因編輯等研究提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 供試材料 蟹味菇菌株,由內(nèi)蒙古自治區(qū)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保留。溶壁酶,購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 加強(qiáng)液體搖瓶培養(yǎng)基:180~200 g/L去皮馬鈴薯,10 g/L蔗糖,10 g/L葡萄糖,1.6 g/L蛋白胨,1.6 g/L酵母提取粉,1.0 g/L K2HPO3,0.5 g/L MgSO4。

    PDA 固體培養(yǎng)基:成分同液體培養(yǎng)基,另添加瓊脂10 g/L。

    原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基:180~200 g/L去皮馬鈴薯,10 g/L蔗糖,10 g/L葡萄糖,10 g/L 瓊脂,1.6 g/L蛋白胨,1.6 g/L 酵母提取粉,1.0 g/L K2HPO3,0.5 g/L MgSO4,硫酸鏈霉素100 mg/L。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 蟹味菇菌絲體活化培養(yǎng) 蟹味菇菌絲體,切取0.3 mm×0.3 mm 小方塊狀,接種至PDA 固體培養(yǎng)基活化2次,25℃恒溫暗培養(yǎng)觀察。

    1.2.2 菌絲體液體搖瓶培養(yǎng) 取固體培養(yǎng)活化所得菌絲體,同切取3 mm×3 mm 小方塊狀,接種至PDA液體搖瓶培養(yǎng)基,于搖床150 r/min,25℃恒溫暗培養(yǎng)觀察。

    1.2.3 蟹味菇原生質(zhì)體的制備 0.6 mol/L甘露醇:稱取10.93 g甘露醇溶于100 mL 無(wú)菌水。經(jīng)0.22 μm 微孔過(guò)濾器滅菌后備用。2%溶壁酶:稱取0.02 g 溶壁酶溶于1 mL 滲透壓穩(wěn)定劑。經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器滅菌后備用。

    取液體搖瓶培養(yǎng)一定時(shí)間后的球狀菌絲體200 mg 于2 mL 離心管中,依次用無(wú)菌水和滲透壓穩(wěn)定劑洗滌,4 000 r/min 離心5.5 min,棄上清。加入溶壁酶200 μL,恒溫?fù)u床培養(yǎng),待酶解后,加入適量甘露醇洗滌3 500 r/min 離心5 min,取上清液用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾,過(guò)濾后離心,棄上清后所得即純化后的原生質(zhì)體液。將所得原生質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后,在光學(xué)顯微鏡40倍鏡下,用XB-K-25 型號(hào)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),重復(fù)計(jì)數(shù)3次,取平均值。

    1.2.4 原生質(zhì)體的再生 取制備后的原生質(zhì)體,調(diào)整到合適的濃度,取200 μL,涂板于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基,重復(fù)3次。

    1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別探究制備條件:菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。(1)菌齡:固定溶壁酶濃度2 %,滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇,酶解時(shí)間3 h,探究菌齡:5、6、7、8、9 d 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。(2)滲透壓穩(wěn)定劑種類:固定溶壁酶濃度2 %,滲透壓穩(wěn)定劑濃度0.6 mol/L,酶解時(shí)間3 h,菌齡7 d,探究不同滲透壓穩(wěn)定劑:蔗糖、甘露醇、NaCl 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。(3)溶壁酶濃度:固定滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇,酶解時(shí)間3 h,菌齡7 d,探究溶壁酶濃度:1%、2%、3%,對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。(4)酶解時(shí)間:固定溶壁酶濃度2%,滲透壓穩(wěn)定劑0.6 mol/L甘露醇,酶解時(shí)間3 h,菌齡7 d,探究酶解時(shí)間:2、3、4、5 h 對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響。每組處理重復(fù)3次。

    1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)P偷慕?基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果,以原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量為響應(yīng)值,制備條件:菌齡、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間為自變量,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)(表1)。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

    1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用Design-Expert 8.0.6、SPSS 22.0、Excel、Origin2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生情況的影響 由圖1a、圖1b可見(jiàn),隨著菌齡的增加,原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量先增加后減少,在95 %置信度下,第7 天和第8 天時(shí)制備產(chǎn)量顯著增加,在菌齡為7 d時(shí)達(dá)最大產(chǎn)量8.85×107個(gè)/mL。在6、8、9 d時(shí)原生質(zhì)體再生率增加,第6 天時(shí)效果最佳,再生率達(dá)1.502 %。

    圖1 不同菌齡對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量(a)及再生率(b)的影響

    2.1.2 不同種類滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生率的影響 不同種類的滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)于原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量和再生率的影響各異。由圖2a、圖2b可見(jiàn),以甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí),原生質(zhì)體產(chǎn)量最多,制備效果最好,差異顯著。相比之下,以蔗糖和NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí),效果較差。而以蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí),原生質(zhì)體再生率最高,其次為甘露醇、NaCl,在95 %置信度下,再生率顯著較高。綜上,在后期制備及再生試驗(yàn)中選擇甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑。

    2.1.3 不同溶壁酶濃度對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量及再生率的影響 由圖3a可見(jiàn),隨著溶壁酶濃度的增大,原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),濃度為2%、3%時(shí)較1%時(shí)效果明顯,濃度為3 %時(shí)制備產(chǎn)量最多,達(dá)9×107個(gè)/mL。由圖3b可見(jiàn),原生質(zhì)體再生率隨溶壁酶濃度的增大呈先增加后減少趨勢(shì),在95%置信度下,溶壁酶濃度為2 %時(shí),再生率最高,為0.067%。

    圖2 不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量(a)及再生率(b)的影響

    圖3 不同溶壁酶濃度對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量(a)及再生率(b)的影響

    2.1.4 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量及再生情況的影響 隨著酶解時(shí)間的增加,原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加,在5 h時(shí)最高,2 h時(shí)產(chǎn)量最低。同時(shí),隨著酶解時(shí)間的變化,原生質(zhì)體再生率總體呈下降趨勢(shì),在2 h和4 h時(shí)再生率較高,2 h時(shí)最高(圖4)。

    圖4 酶解時(shí)間對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體產(chǎn)量(a)及再生率(b)的影響

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

    基于響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表2),對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析,建立多元二次回歸模型如下:

    Y=120.4+1.47A+2.33B-19.18C+0.23AB-1.92AC-3.8BC-74.77A2-40.65B2-38.3C2

    由表3可知,F(xiàn)值為10.89,P<0.05,表明該模型顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)R2=0.933 3,校正決定系數(shù)R2Adj=0.847 6,失擬項(xiàng)P=0.176 4>0.05,失擬項(xiàng)不顯著,表明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合良好,可以用該模型分析和預(yù)測(cè)結(jié)果。A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著(P<0.01),C 對(duì)結(jié)果的影響顯著(P<0.05),表明A、B、C 三因素對(duì)原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量影響的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>溶壁酶濃度>菌齡。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 交互作用響應(yīng)面法分析 由圖5可知,3種情況下的交互作用響應(yīng)面圖等高線均未呈現(xiàn)明顯的橢圓形,說(shuō)明因素之間的交互作用不顯著。相比之下,結(jié)合3D 曲面和等高線形狀,交互項(xiàng)對(duì)蟹味菇原生質(zhì)體的制備產(chǎn)量的影響強(qiáng)弱依次為:菌齡和溶壁酶濃度、菌齡和酶解時(shí)間、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間。

    2.2.2 最佳制備條件確定與驗(yàn)證 在滲透壓穩(wěn)定劑選定為甘露醇的情況下,經(jīng)Design Expert 8.0.6 軟件分析,得到蟹味菇原生質(zhì)體最佳制備條件:溶壁酶濃度2.04%、菌齡7.01 d、酶解時(shí)間3.75 h,預(yù)測(cè)制備產(chǎn)量為122.881×106個(gè)/mL,為了試驗(yàn)方便,將各條件值取為:溶壁酶濃度2 %、菌齡7 d、酶解時(shí)間4 h,在此條件下,根據(jù)所得最優(yōu)條件進(jìn)行平行試驗(yàn)驗(yàn)證,試驗(yàn)重復(fù)3次,得到蟹味菇原生質(zhì)體制備產(chǎn)量為(120.40 ±1.5)×106個(gè)/mL,與預(yù)測(cè)值相近,表明具有良好的擬合性,由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳制備參數(shù)可靠。

    表3 模型方差分析

    3 討論與結(jié)論

    以原生質(zhì)體為試驗(yàn)對(duì)象和媒介可以打破細(xì)胞壁和遠(yuǎn)緣雜交的障礙,避免繁雜的遺傳標(biāo)記問(wèn)題,在體細(xì)胞雜交、誘變、融合以及新型微生物菌種選育和改良技術(shù)、基因組重排技術(shù)等生物學(xué)研究領(lǐng)域,已獲得穩(wěn)定遺傳、性狀優(yōu)良的新品種[15-18]。隨著科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展,在種質(zhì)資源創(chuàng)新和新型品種選育的研究中,原生質(zhì)體都有廣泛的應(yīng)用潛力和前景。制備高產(chǎn)量和高再生率的原生質(zhì)體是后續(xù)生物學(xué)研究的關(guān)鍵一步,具有重要的研究意義。已有研究表明對(duì)于不同的菌種,菌齡、酶濃度、種類、溫度、pH值等條件對(duì)原生質(zhì)體制備的產(chǎn)量和再生率影響不同[19-21]。

    圖5 兩因子交互作用的響應(yīng)面

    單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,蟹味菇原生質(zhì)體最佳的制備條件為菌齡7 d+0.6 mol/L甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑+溶壁酶濃度2%+酶解5 h。再生率最佳的制備條件為菌齡6 d+0.6 mol/L甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑+溶壁酶濃度2%+酶解3 h。響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果顯示,選擇0.6 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑為前提,經(jīng)優(yōu)化,最佳制備條件為菌齡7 d,溶壁酶濃度為2%,酶解4 h,經(jīng)檢驗(yàn)與模型預(yù)測(cè)值有良好的擬合性,相比單因素結(jié)果更可靠。酶解時(shí)間、溶壁酶濃度、菌齡三因素對(duì)原生質(zhì)體制備產(chǎn)量影響的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>溶壁酶濃度>菌齡,以響應(yīng)面法確定的最佳制備條件可獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率。該研究可為蟹味菇原生質(zhì)體的誘變、融合、育種提供理論參考。

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