液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素和甲硝唑的探討

張琳 李敏 張辰辰

氯霉素和甲硝唑都是在家畜養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常會(huì)使用到的抗生素類藥物，但是由于大多數(shù)家畜養(yǎng)殖密度較高，發(fā)病率也相對(duì)較高，養(yǎng)殖戶為了降低發(fā)病率會(huì)大劑量使用此類抗生素，由此引發(fā)一系列食品安全問(wèn)題，影響人體健康。因此，加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性食品中氯霉素和甲硝唑的檢測(cè)研究是十分重要的，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是當(dāng)前較為有效的檢測(cè)手段。

一、材料與方法

1.試劑。甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；無(wú)水硫酸鈉、乙酸乙酯、甲酸、氨水、正己烷（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司）；氯霉素、甲硝唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL，甲醇）；氯霉素氘代內(nèi)標(biāo)（氯霉素D5）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL，甲醇）。氯霉素、甲硝唑、氯霉素-D5混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將進(jìn)行前處理和儀器定性未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物峰的樣品中，分別加入適量的氯霉素和甲硝唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL，氯霉素D5濃度均為10ng/ml的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.儀器分析條件。（1）儀器。Exion LC-triple quad 3500三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)sciex公司）；超聲波清洗機(jī)；漩渦混合儀；高速冷凍離心機(jī)；全自動(dòng)平行濃縮儀；超純水機(jī)。（2）超高效液相色譜條件。色譜柱：Agilent-Eclipse plus C18柱（1.8μm，100mm×2.1mm），流速0.3mL/min，進(jìn)樣體積為10μl，柱溫40℃。流動(dòng)相及梯度洗脫程序：梯度洗脫；0-1min，10%B；1-5min，10%-100%B；5-6min，100%B；6-6.1min，100%-10%B；6.1-8min，10%B。（3）質(zhì)譜條件。選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子同時(shí)掃描模式。電噴霧電壓：-4500V/5500V；霧化器氣壓力：0.345MPa；氣簾氣壓力：0.069MPa；輔助氣流速：0.345MPa；離子源溫度：550℃。

3.樣品。對(duì)濟(jì)寧市任城區(qū)4處大型超市及3處農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)進(jìn)行采樣，共20份樣品，包括豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉、豬肝、雞肝、淡水魚(yú)、蝦等。

4.樣品提取。樣品通過(guò)粉碎機(jī)打碎成泥，冷藏待用。稱取5.00g樣品，加入10μL（1000ng/mL）的氯霉素D5、10mL乙酸乙酯、0.45mL氨水和5g無(wú)水硫酸鈉，渦旋30s混勻，超聲提取5min，10000r/min條件下離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，備用。取備用液，40℃氮?dú)獯蹈?，?mL甲醇-水（50︰50，V︰V）溶解殘?jiān)?，再加?mL正己烷，渦旋3min，靜置分層，棄去正己烷層，重復(fù)此步驟3次。溶液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

二、結(jié)果與討論

1.實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。為進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)效果，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本實(shí)驗(yàn)在國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定程度的優(yōu)化和改進(jìn)。（1）樣品提取條件。本研究方法簡(jiǎn)化了國(guó)標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)樣品提取條件進(jìn)行了合理優(yōu)化，使用乙酸乙酯進(jìn)行樣品提取，在氮吹后使用甲醇-水（50︰50，V︰V）進(jìn)行溶解，依舊采用正己烷除去油脂，并經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。與國(guó)標(biāo)中的檢測(cè)方法相比，這種樣品提取方式更加簡(jiǎn)單，并且回收率較高。特別是在以內(nèi)臟為樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，采用甲醇-水（50︰50，V︰V）對(duì)其進(jìn)行溶解時(shí)能夠得到澄清溶液，達(dá)到溶解殘?jiān)哪康?。?）儀器方法。本實(shí)驗(yàn)參考了標(biāo)準(zhǔn)方法中較為成熟的梯度洗脫程序和質(zhì)譜各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置，并在此基礎(chǔ)上對(duì)部分參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用1%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，氯霉素和甲硝唑能保持足夠分離度和良好峰形。質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.方法學(xué)驗(yàn)證。本研究對(duì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，包括線性范圍及相關(guān)系數(shù)、定量限，采用10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度作為方法定量限（LOQ）。經(jīng)驗(yàn)證，氯霉素、甲硝唑的方法定量限分別為0.1ug/kg和0.5ug/kg，線性范圍為0.1-5μg/kg，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.998；分別選擇3個(gè)濃度進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試（n=3），加標(biāo)回收率在78.0%-92.4%范圍內(nèi)，RSD不高于4.8%。檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

3.樣品實(shí)際測(cè)定。采用本研究?jī)?yōu)化后的方法對(duì)20份樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行獨(dú)立測(cè)定，均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品（含量低于方法定量）。本研究方法在對(duì)氯霉素和甲硝唑共同測(cè)試過(guò)程中，相比于標(biāo)準(zhǔn)方法體現(xiàn)出更快速、高效的特點(diǎn)，并且獲得了更優(yōu)的離子流圖。

食品安全關(guān)乎著人們的身體健康和生命安全，當(dāng)前我國(guó)對(duì)于食品安全方面的檢測(cè)和監(jiān)督手段以及力度都在不斷加強(qiáng)，我們對(duì)于動(dòng)物源性食品方面的檢測(cè)研究也從未停止。本方法對(duì)傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和更新，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物源性食品中兩種經(jīng)常出現(xiàn)的抗生素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)抗生素檢測(cè)方法中無(wú)法對(duì)這兩種不同類抗生素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的情況，還對(duì)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化和改進(jìn)，不僅降低了檢測(cè)的難度，提高了實(shí)驗(yàn)的效率和簡(jiǎn)便性，還進(jìn)一步提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，較為適合推廣應(yīng)用。