微流控通道內(nèi)細胞及其初級纖毛的力傳導(dǎo)行為1)

李朝鑫 武曉剛,,2) 孫玉琴 秦迎澤 段王平 張美珍 王艷芹 陳維毅,3) 衛(wèi)小春

?(太原理工大學(xué)機械與運載工程學(xué)院,太原 030024)

?(太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,太原 030024)

??(骨與軟組織損傷修復(fù)山西省重點實驗室,太原 030001)

??(太原理工大學(xué)體育學(xué)院,太原 030024)

引言

微流控芯片[1]可以實現(xiàn)細胞的體外培養(yǎng),廣泛應(yīng)用于細胞的檢測研究中.微流控腔中培養(yǎng)液的動力流動方式從原理上主要分兩類:第一類為被動式,如表面張力和毛細作用,第二類為主動式,包括壓力驅(qū)動、離心力驅(qū)動、磁流體動力和電滲流驅(qū)動等[2].生物體內(nèi)的細胞生長、分化、粘附、遷移等活動受到力學(xué)微環(huán)境的影響,而微流控芯片培養(yǎng)細胞可以模擬實現(xiàn)特定的力學(xué)微環(huán)境,并完成細胞的生物力學(xué)研究[3-4].電滲流[2]是一種重要的微流體系統(tǒng),它可以在不需要機械運動部件的情況下通過微通道輸送流體,當(dāng)施加軸向電場時,帶電表面會影響溶液中離子的運動狀態(tài),從而帶動溶液流動.為了研究生物組織的逆向力?電效應(yīng)[5],微流控技術(shù)可以實現(xiàn)力?電協(xié)同驅(qū)動培養(yǎng)液流動刺激貼壁細胞的生物力學(xué)技術(shù)微環(huán)境[6].人工配置的無血清培養(yǎng)液可以簡化為理想的牛頓型流體,而生理流體和細胞培養(yǎng)液一般被視為不可壓縮的非牛頓型流體(Maxwell 流)[7-8],忽略慣性力后可視為蠕動流.在之前的工作中,建立含有細胞的牛頓型流體和非牛頓型流體的二維有限元模型被用于研究兩種流體模型下線彈性細胞的動態(tài)響應(yīng)[9].

現(xiàn)有的細胞模型有線彈性、黏彈性、多孔彈性和多孔黏彈性模型等[10-12].細胞組織的力學(xué)性質(zhì)主要通過實驗的方法探究,裘鈞[13]研究發(fā)現(xiàn)細胞存在滯后,蠕變和松弛等黏彈性材料才有的力學(xué)行為并測定了標準線性固體黏彈性骨細胞模型的三參數(shù)k1(黏彈性材料的平衡態(tài)模量)、k2(黏性系數(shù))和η(黏滯系數(shù)),在此基礎(chǔ)上可以進一步推導(dǎo)出松弛時間τ=η/k2和剪切模量G=k1/3.研究表明,水在人體體重的比重在一半以上,從宏觀生物器官組織到微觀的各類細胞,均可以被視為同時具有固相和液相的多孔彈性材料[14-16].近年來,原子力顯微鏡通過測量微懸臂梁探針與樣品表面之間的相互作用,提供了評估細胞力學(xué)性能的新技術(shù),原子力顯微鏡實驗數(shù)據(jù)和有限元模擬結(jié)合的方法被用于估算了兩種細胞的孔隙彈性和黏彈性參數(shù)[17-18].最初,為了簡化,細胞被視為線彈性體而不足以考察細胞的生物力學(xué)特性,隨著細胞力學(xué)的發(fā)展,建立更精確的多孔黏彈性細胞模型來考察復(fù)雜的力學(xué)行為是必要的.

初級纖毛是生長在細胞表面的毛發(fā)狀細胞器,它可以通過改變長度和抗彎性,以調(diào)節(jié)其力學(xué)敏感性,適應(yīng)微觀力學(xué)環(huán)境[19-23].初級纖毛已被觀察與多種細胞途徑的活動相結(jié)合,但是作為化學(xué)和力學(xué)信號的重要感受器還未被充分認識.在很多情況下,初級纖毛充當(dāng)調(diào)節(jié)細胞與細胞通信的信號傳導(dǎo)中心[24],它充當(dāng)力學(xué)傳感器并執(zhí)行高度專業(yè)化的感知功能.初級纖毛的力學(xué)行為在細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)和相關(guān)疾病中研究發(fā)現(xiàn),軟骨祖細胞(osteochondroprogenitors)獨特地感知流體剪切并且參與成骨細胞的分化現(xiàn)象,但去除初級纖毛后這種現(xiàn)象基本消失,這個結(jié)果表明初級纖毛充當(dāng)了具有力學(xué)信號傳導(dǎo)功能的成骨分化細胞器[25].在醫(yī)學(xué)上,初級纖毛與認知障礙、耳蝸聽覺喪失、視網(wǎng)膜變性、嗅覺缺失癥、顱面畸形、肺癌和呼吸道異常、骨骼異常等疾病都具有相關(guān)性[26].最近的研究表明骨細胞初級纖毛不僅可以作為感知外部力學(xué)刺激的“天線”,還可以作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中各種信號分子的受體和吸收劑[27].血管內(nèi)襯內(nèi)皮細胞上的初級纖毛起著鈣依賴性力學(xué)傳感器的作用,通過感應(yīng)血流刺激來調(diào)節(jié)血管系統(tǒng)內(nèi)的血液動力學(xué)參數(shù)[28].內(nèi)皮初級纖毛的缺陷會導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)难髡T導(dǎo)反應(yīng),并導(dǎo)致血管功能障礙如動脈粥樣硬化、高血壓和動脈瘤[29].腎初級纖毛在暴露于血流中時發(fā)生彎曲,并在血流停止后發(fā)生恢復(fù),類似于材料力學(xué)中的懸臂梁,其周期性彎曲可以激活鈣離子通道的開關(guān)[30].在發(fā)現(xiàn)初級纖毛的力學(xué)行為的重要性之后,從理論方面探討初級纖毛的力學(xué)機制也就成為了一項重要工作.初級纖毛最初被簡化為圓柱截面懸臂梁,并結(jié)合實驗中觀察到的彎曲情況得到初級纖毛的剛度范圍[29].結(jié)合實驗觀察研究初級纖毛尖端的擺動對其軸突和基底的力學(xué)響應(yīng),初級纖毛被更細化的建模為微管集合體計算初級纖毛在軸向和半徑方向的彈性模量,發(fā)現(xiàn)長初級纖毛剛度比短初級纖毛更高[31].培養(yǎng)腔內(nèi)的細胞的流?固耦合有限元模型的建立證明了定常流中初級纖毛可以通過調(diào)節(jié)長度和剛度來改變線彈性細胞的力學(xué)敏感性[24].

至今為止,對于初級纖毛力學(xué)行為的理論研究大多數(shù)都是在穩(wěn)定流場中進行的.那么,有初級纖毛附著的細胞在振蕩流中有怎樣的周期性力學(xué)行為以及初級纖毛又如何對細胞體造成動態(tài)的影響就成為了重要的問題.本文通過有限元建模的方法研究振蕩層流中多孔黏彈性細胞的力學(xué)響應(yīng),得到了初級纖毛在微流控腔內(nèi)液體流動中的力學(xué)行為.具體研究了細胞質(zhì)滲透率變化對細胞多孔彈性力學(xué)行為的影響,以及初級纖毛的幾何(長度、直徑)和力學(xué)(彈性模量)特性對自身及其他細胞器(細胞質(zhì)、細胞核)的力學(xué)信號感受能力的影響.

1 材料和方法

1.1 矩形截面通道振蕩層流理論

微流控腔體內(nèi)的液體流動可以用Navier-Stokes方程來描述,圖1 所示,流動為充分發(fā)展的矩形截面(a×b)層流體系.并且假設(shè):流體為不可壓縮的牛頓流體,壓力在管道截面上均勻分布

圖1 微流控通道中的流場示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow field in microfluidic channel

不可壓縮流體的連續(xù)性方程為

式中,μ=νρ 是流體的動力黏度,ν 是流體的運動黏度,ρ 為流體密度,u為流體在矩形截面上的速度,f是流體所受的體力,?為Laplace 算子,?為梯度算子.若微管x和z方向的流速為0,設(shè)y方向的速度為u,壓強P僅是關(guān)于y和時間t的函數(shù),忽略體力的影響,則x?z截面上的方程(1)可簡化為

?P(y,t)/?y是y軸方向的壓力梯度.為便于數(shù)學(xué)計算,原點o設(shè)置在通道的左下角,使0 ≤x≤a和0 ≤z≤b,則初始和邊界條件為

方程(3)的解寫成u=us(y,z)+ut(x,z,t),其中us為穩(wěn)態(tài)速度分量,ut為振蕩瞬時速度分量.由于各種周期性函數(shù)均能通過傅里葉變換分解為三角函數(shù)的疊加,Blythman 等[32]用格林函數(shù)求解了在壓力分別為?P(y,t)/?y=?Pos(?Pos是定常流的常數(shù)項壓力梯度值)和?P(y,t)/?y=?Potcos(ωt)(?Pot是三角函數(shù)壓力梯度幅值)振蕩層流的解析解,ω 為振蕩角速度,當(dāng)壓力梯度為常數(shù)時,穩(wěn)態(tài)速度的解析解為

式中m,n為求和指數(shù),odd 表示m和n從1～∞取奇數(shù),其中Φ 和β 是由式(6)確定的函數(shù)

當(dāng)壓力梯度為振蕩層流時,速度的解析解為

1.2 有限元建模

1.2.1 幾何模型

根據(jù)先前的細胞培養(yǎng)微流控芯片裝置模型[33],將其擴展為三維有限元模型,如圖2(a)所示.根據(jù)先前工作,液體壓力沿流動方向y線性分布[32],截取其中包含第40 個單細胞進行分析,如圖2(c) 所示,培養(yǎng)腔全長L=35 mm,寬a=150μm,高b=150μm,割離出的培養(yǎng)腔長l=350 μm.建立的三維微流控通道流場模型中,細化出了細胞的初級纖毛,細胞質(zhì)和細胞核三維結(jié)構(gòu)(忽略了細胞膜).如圖2(b) 和圖2(d)所示,細胞質(zhì)呈半橢球狀,長軸Ycytoplasm=20μm,長軸方向沿通道y軸方向,短軸Xcytoplasm=14 μm,高度Hcytoplasm=4 μm.將細胞核建模為橢球體,長軸Xnucleus=5 μm,長軸方向沿通道x軸方向,短軸Ynucleus=4μm,高度Hnucleus=2.5μm,初級纖毛建立為圓柱截面懸臂梁嵌入細胞表面下0.05μm,初始直徑為Dpc=0.2μm,初始長度為Lpc=2.5μm[24],模型的尺寸參數(shù)總結(jié)為表1.

圖2 微流體培養(yǎng)腔和單細胞的模型和網(wǎng)格:(a)矩形截面培養(yǎng)腔和其中等間隔的細胞;(b)由初級纖毛、細胞質(zhì)和細胞核組成的細胞;(c)分離的單細胞培養(yǎng)腔有限元網(wǎng)格;(d)單細胞的有限元網(wǎng)格Fig.2 Models and mesh of microfluidic culture chamber and single cell:(a)Rectangular cross-section culture chamber and equidistantly distributed cells;(b)cell diagram composed of primary cilium,cytoplasm and nucleus;(c)finite element mesh of separated single cell culture chamber;(d)finite element mesh of single cell

表1 矩形通道和細胞模型的尺寸Table 1 Sizes of rectangular channel and cell model

1.2.2 邊界條件和載荷施加

半橢球細胞的橢圓形底面貼在細胞腔壁上故施加固定約束,細胞流體接觸面和培養(yǎng)腔壁設(shè)定無滑移邊界,細胞和液體的邊界設(shè)定結(jié)構(gòu)上的流體載荷流固耦合邊界.細胞模型屬于多孔彈性模型,是建立在流體?結(jié)構(gòu)耦合有限元模型中的:(1)細胞的固相成分是均勻的,各向同性和不可壓縮黏彈性連續(xù)體;(2)在不考慮任何主動力的情況下,只分析骨細胞在流場中的被動變形;(3)為防止初級纖毛底部旋轉(zhuǎn)過大,便于將初級纖毛視為懸臂梁分析,對初級纖毛的底面施加剛性連接并限制其旋轉(zhuǎn).

載荷驅(qū)動[33]設(shè)置:全培養(yǎng)腔入出口處分別設(shè)置正弦壓力驅(qū)動Pinlet和Poutlet,分離出的單細胞培養(yǎng)腔壓力梯度頻率f=1 Hz,?P(y,t)/?y=?P0tsin(2πft),并施加頻率f=1 Hz,電場強度為?E(y,t)/?y=?E0tsin(2πft)的電場力,壓力梯度和電場強度變化見表2 和圖3.

表2 壓力和電場的載荷參數(shù)Table 2 Load parameters of pressure and electric field

圖3 通道中y 軸方向的壓力梯度和電場梯度Fig.3 Pressure gradient and electric field gradient in the y-axis direction in the channel

1.2.3 材料參數(shù)

細胞培養(yǎng)液的參數(shù)設(shè)置見表3,其中C為電解質(zhì)的摩爾濃度,ψ0為腔壁的Zeta 電勢,z0為離子所帶電荷數(shù),kb為玻爾茲曼常數(shù),NA為阿伏伽德羅常數(shù),e為單位電荷電量,ε0為真空介電常數(shù),εr為相對介電常數(shù),t0為攝氏溫度,ρ 和μ為細胞培養(yǎng)液的密度和動力黏度.

表3 流體參數(shù)[33]Table 3 Fluid parameters[33]

多孔黏彈性細胞的參數(shù)設(shè)置見表4 和表5,其中E為彈性模量,vs為泊松比,ρS為固相密度,κ 為滲透率,εp為孔隙率,αB為Biot-Wills 系數(shù),ρl為液相密度,μ 為動力黏度,χf為壓縮系數(shù),τv為松弛時間,Gv為剪切模量,初級纖毛[24]的初始彈性模量為E0=178 kPa,泊松比為0.3.

表4 細胞質(zhì)參數(shù)[13,34,35]Table 4 Cytoplasmic parameters[13,34,35]

表5 細胞核參數(shù)[13,34,35]Table 5 Nuclear parameters[13,34,35]

2 結(jié)果

2.1 不含細胞矩形通道層流的有限元有效性驗證

為了驗證有限元結(jié)果的可靠性,如圖4(a) 為分離出單細胞所在培養(yǎng)腔,腔體的寬和高a=b=150 μm,長l=350 μm,壓力梯度為?P(y,t)/?y=4.6 sin(2πft)/3.5×10?4Pa/m.由于矩形通道的對稱性,選取流速幅值時刻t=0.25 s,將x∈(0μm,75μm),通道的中軸線z=75μm 的有限元流速結(jié)果與式(7)計算的解析解進行對比,計算過程中公式中m和n從1,2,···,999 取奇數(shù),對比結(jié)果如下圖4(b)所示,為不含細胞矩形通道層流的有限元分析和解析解對比結(jié)果,可以看出從管道中心到管道壁面流速呈拋物線式逐漸減小.從圖中可以看出有限元模擬的結(jié)果與解析解吻合,矩形通道層流的有限元有效性得以驗證.

圖4 流速v 的有限元結(jié)果與解析解的對比:(a)計算黃色線段所在位置的有限元和解析解;(b)有限元和解析解的對比結(jié)果Fig.4 Comparison of finite element results and analytical solutions of velocity v:(a)Calculate the finite element and analytical solutions at the position of the yellow line segment;(b)compare the results of the finite element and analytical solutions

2.2 多孔黏彈性細胞的力學(xué)響應(yīng)

圖5(a)表明除孔隙流速的幅值時刻較外加載荷提前,其他三種力學(xué)信號幅值時刻與外加載荷相同,圖5(b)～圖5(e)依次為0～1 s 內(nèi)細胞質(zhì)在不同滲透率下的體平均Mises 應(yīng)力σ(Pa),總位移s(μm),孔隙壓力p(Pa)和孔隙流速v(nm/s)四種力學(xué)信號的時程曲線,體平均應(yīng)力值由網(wǎng)格節(jié)點應(yīng)力求和除以節(jié)點數(shù)求得,其中κ1,κ2和κ3依次為1.0×10?19m2,5.0×10?19m2和1.0×10?18m2.可以看出四種力學(xué)信號表現(xiàn)為與流場外加驅(qū)動同周期的發(fā)展規(guī)律.細胞質(zhì)滲透率為κ1,κ2和κ3時,體平均Mises 應(yīng)力在t=0.25 s 達到最大值為41.25 Pa,41.09 Pa 和41.04 Pa,體平均位移達到最大值均為0.24μm,體平均孔隙壓力達到最大值為729.64 Pa,661.03 Pa 和654.53 Pa,其中滲透率κ1,κ2和κ3的體平均孔隙流速值的最大值依次出現(xiàn)在0.70 s,0.64 s 和0.61 s,為3.31 nm/s,9.79 nm/s 和13.42 nm/s.

圖5 力學(xué)信號時程曲線(續(xù))Fig.5 Mechanical signal time history curve(continued)

如圖6(a)～圖6(d) 為滲透率為κ3的細胞在t=0.25 s 時細胞的σ,s,p云圖和t=0.61 s 時細胞的云圖.從圖6(a)中可以看出細胞貼壁側(cè)的受力較大,細胞受力較大的位置處于細胞的貼壁邊界,細胞核的Mises 應(yīng)力大于細胞質(zhì).圖6(b)為細胞在t=0.25 s 時細胞的總位移云圖,可以看出細胞遠離貼壁側(cè)位移較大,細胞位移最大的位置處于細胞核與貼壁邊界中間的細胞質(zhì)表面,細胞質(zhì)的總位移大于細胞核.圖6(c)為細胞的孔隙壓力云圖,可以看出細胞質(zhì)和細胞核的孔隙壓力分布均勻,細胞質(zhì)的孔隙壓力大于細胞核,且細胞質(zhì)中位移越大的位置孔隙壓力越大.圖6(d)為細胞的孔隙流速云圖,可以看出貼壁邊界和細胞核附近的孔隙流速較大,細胞孔隙流速最大的點位于細胞核下方的細胞質(zhì)貼壁處,細胞質(zhì)的孔隙流速大于細胞核.

2.3 初級纖毛的研究

2.3.1 有無初級纖毛的細胞對比

圖7(a)～圖7(d) 依次為不含初級纖毛的細胞在t=0.25 s(細胞變形和纖毛撓度達到最大值時刻)的σ,s,p和v云圖,圖7(e)～圖7(h)依次為含初級纖毛的細胞在t=0.25 s 的σ,s,p和v云圖.從中可以看出,初級纖毛的存在使纖毛基部(纖毛嵌入細胞內(nèi)的部分)所在的局部細胞質(zhì)應(yīng)力增大和孔隙流速降低,但并不對整體應(yīng)力、位移和孔隙壓力和孔隙流速分布產(chǎn)生影響.不含初級纖毛和2.5 μm 長的初級纖毛基部所在區(qū)域的局部平均Mises 應(yīng)力分別為36.02 Pa和94.51 Pa,平均總位移分別為0.73 μm 和0.76 μm,平均孔隙壓力分別為654.61 Pa 和648.15 Pa,平均孔隙流速分別為7.62 nm/s 和4.80 nm/s.

圖6 無初級纖毛細胞的力學(xué)信號云圖Fig.6 Mechanical signals contours of cell without primary cilium

圖7 無初級纖毛細胞Mises 應(yīng)力σ(a),總位移s(b),孔隙壓力p(c)和孔隙流速v(d)和有初級纖毛細胞的Mises 應(yīng)力σ(e),總位移s(f),孔隙壓力p(g)和孔隙流速v(h)的對比Fig.7 Comparison of Mises stress σ(a),total displacement s(b),pore pressure p(c)and pore flow velocity v(d) of cell without primary cilium and Mises stress σ(e),total displacement s(f),pore pressure p(g)and pore flow velocity v(h)of cell with primary cilium

圖8 為初級纖毛、細胞質(zhì)和細胞核的體平均Mises 應(yīng)力和第一主應(yīng)變對比圖,結(jié)果表明初級纖毛的平均應(yīng)力和應(yīng)變大于細胞核大于細胞質(zhì).

圖8 t=0.25 s 時初級纖毛,細胞質(zhì)和細胞核的應(yīng)力和應(yīng)變對比Fig.8 Comparison of stress and strain of primary cilium,cytoplasm and nucleus at t=0.25 s

此外,如圖9(a)的紅色區(qū)域為初級纖毛的影響區(qū)域圖,圖中紅色區(qū)域應(yīng)力大于40 Pa.為了總結(jié)初級纖毛的存在對初級纖毛基部局部細胞質(zhì)的影響,進行如圖9(b)的局部選點分析,點與點間隔5 nm,t=0.25 s時左側(cè)(Zone 1)在初級纖毛向右側(cè)彎曲時受拉,右側(cè)(Zone 3)受壓.

研究表明,初級纖毛的形狀和力學(xué)參數(shù)受細胞外界生理環(huán)境、細胞生命活動、藥物干預(yù)等多種因素影響.所以進一步研究了初級纖毛在不同長度(Lpc)、不同直徑(Dpc)、不同彈性模量(Epc)下的力學(xué)行為.

2.3.2 初級纖毛長度的影響

圖9 初級纖毛的影響區(qū)域尺寸r 和研究區(qū)域Fig.9 Primary cilium’s affected area size r and the study zones

如圖10(a)為t=0.25 s 時帶有不同長度初級纖毛(Lpc)的Mises 應(yīng)力和變形云圖,從圖中可以看出,初級纖毛的長度越長彎曲和拉伸程度越大,初級纖毛中下方的應(yīng)力也越大.當(dāng)初級纖毛的長度分別為1.5μm,2μm,2.5μm,3μm,3.5μm 時[29],初級纖毛頂端的撓度依次為0.34μm,1.25μm,3.38μm,7.74μm,15.34 μm,初級纖毛基部的最大Mises 應(yīng)力依次為9.41 kPa,19.69 kPa,34.42 kPa,55.15 kPa,81.13 kPa.從中可以看出初級纖毛長度的變化對初級纖毛的彎曲程度和初級纖毛基部的應(yīng)力將產(chǎn)生很大的影響.

如圖10(b)～圖10(e) 所示,統(tǒng)計了t=0.25 s 初級纖毛基部局部細胞質(zhì)的力學(xué)信號的平均值和標準差,取點方式見圖9(b).隨著初級纖毛長度的增大,從圖10(b)中可以看出,纖毛基部局部細胞質(zhì)總體上應(yīng)力提升,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)和底部應(yīng)力大小相近;從圖10(c)中可以看出,總位移隨著長度的增大而小幅增大,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)和底部總位移大小相近;從圖10(d)中可以看出,孔隙壓力隨著長度的增大而保持不變,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)和底部孔隙壓力大小相同;從圖10(e)中可以看出,孔隙流速隨著長度的增大而增大,長度較低時,壓縮側(cè)流速大于拉伸側(cè)大于底部,當(dāng)長度大于2μm 后,壓縮側(cè)流速大于底部大于拉伸側(cè).此外,從圖11 可以看出,初級纖毛長度越長,纖毛基部的局部細胞質(zhì)受影響范圍越大.

圖10 初級纖毛長度變化的影響Fig.10 The influence of primary cilium’s length changes

圖10 初級纖毛長度變化的影響(續(xù))Fig.10 The influence of primary cilium’s length changes(continued)

圖11 不同長度初級纖毛影響區(qū)域Fig.11 Influence area of primary cilium of different lengths

2.3.3 初級纖毛直徑的影響

對于懸臂梁模型來說,初級纖毛的直徑是影響初級纖毛抗彎行為的主要因素,因此研究了初級纖毛的直徑(Dpe)在0.1～0.3μm 范圍變化[36-37]對細胞感受外界生物力學(xué)因素的影響.如圖12(a)為t=0.25 s時帶有不同直徑初級纖毛的Mises 應(yīng)力和變形云圖,當(dāng)直徑分別為0.10μm,0.15μm,0.20μm,0.25μm,0.3 μm 時,初級纖毛頂端的撓度分別為40.44 μm,9.65 μm,3.38 μm,1.56 μm,0.79 μm,初級纖毛基部的最大Mises 依次為202.88 kPa,75.49 kPa,34.42 kPa,19.06 kPa,12.00 kPa.從圖中可以看出,初級纖毛直徑的變化對初級纖毛的彎曲變形程度和初級纖毛基部的應(yīng)力將產(chǎn)生很大的影響,初級纖毛的直徑越小其彎曲和拉伸程度越大,應(yīng)力也越大.

圖12 初級纖毛直徑變化的影響Fig.12 The influence of primary cilium’s diameter changes

如圖12(b)～圖12(e)所示,統(tǒng)計了t=0.25 s 初級纖毛基部局部細胞質(zhì)的力學(xué)信號的平均值和標準差,取點方式見圖9(b).隨著初級纖毛直徑的增大,從圖12(b)中可以看出,纖毛基部局部細胞質(zhì)總體上應(yīng)力降低,直徑Dpc=0.1μm 時,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)的應(yīng)力明顯大于底部,隨著直徑的增大,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)和底部應(yīng)力大小相近;從圖12(c) 中可以看出,直徑的增大僅僅引起壓縮側(cè)位移的小幅減小;從圖12(d)中可以看出,孔隙壓力隨著直徑的增大而保持不變,拉伸側(cè)、壓縮側(cè)和底部孔隙壓力大小相同;從圖12(e)中可以看出,孔隙流速隨著長度的增大而增大,壓縮側(cè)流速大于底部大于拉伸側(cè).此外,從圖13 可以看出,初級纖毛直徑越大,纖毛基部的局部細胞質(zhì)受影響范圍越大.

圖13 不同直徑初級纖毛影響區(qū)域Fig.13 Influence area of primary cilium with different diameters

2.3.4 初級纖毛彈性模量的影響

影響初級纖毛剛度的因素包括初級纖毛直徑和彈性模量,研究了彈性模量(Epe) 在E0=178 kPa的0.1,0.5,1,5,10 倍范圍內(nèi)變化對于細胞的力學(xué)響應(yīng)的影響.研究發(fā)現(xiàn),從彈性模量和直徑兩方面改變初級纖毛的剛度,對初級纖毛的影響并不相同,彈性模量越大,初級纖毛彎曲程度越小,如圖14(a)所示,t=0.25 s 彈性模量分別為E0的0.1,0.5,1,5,10 倍時,初級纖毛頂部的撓度依次為33.73 μm,6.69 μm,3.78μm,0.68μm,0.34μm,初級纖毛底部的Mises 應(yīng)力依次為33.40 kPa,34.04 kPa,34.42 kPa,34.50 kPa,34.53 kPa,初級纖毛的彈性模量越高,初級纖毛的彎曲變形程度越低,初級纖毛彈性模量的變化對纖毛基部應(yīng)力無明顯影響.

如圖14(b)～圖14(e)所示,統(tǒng)計了t=0.25 s 初級纖毛基部局部細胞質(zhì)的力學(xué)信號的平均值和標準差,取點方式見圖9(b).從圖14(b)中可以看出彈性模量很小(0.1E0)的纖毛彎曲時拉伸側(cè)的應(yīng)力大于壓縮側(cè)大于底部,彈性模量大于0.5E0后,應(yīng)力變化不再顯著.從圖14(c)中可以看出隨著初級纖毛彈性模量的增大,壓縮側(cè)總位移小幅降低,拉伸側(cè)和底部總位移不變,從圖14(d)中可以看出初級纖毛附近的孔隙壓力恒定,從圖14(e)中可以看出纖毛基部局部細胞質(zhì)孔隙流速無明顯變化,壓縮側(cè)流速大于底部大于拉伸側(cè),從圖15 知隨著初級纖毛彈性模量的增大,基部細胞質(zhì)的受影響范圍保持1μm 左右不變.

圖14 初級纖毛彈性模量變化的影響Fig.14 Influence of primary cilium’s elastic modulu changes

圖14 初級纖毛彈性模量變化的影響(續(xù))Fig.14 Influence of primary cilium’s elastic modulu changes(continued)

圖15 不同彈性模量初級纖毛影響區(qū)域Fig.15 Influence area of primary cilium with different elastic modulus

2.3.5 初級纖毛的受力分析

如圖16(a)所示,假設(shè)初級纖毛是一個底部埋在細胞質(zhì)中的圓柱形桿件,由于矩形微流體通道中流體的壓力沿長軸線性變化,而初級纖毛的尺度相對于通道很小,因此初級纖毛附近的流體壓力值近似恒定,桿件在流體壓力均勻作用下彎曲,用q來表示桿件所受的均布載荷,w來表示彎曲撓度,根據(jù)材料力學(xué)的懸臂梁知識,則可以通過初級纖毛的撓度w計算初級纖毛所受到的均布載荷q大小.初級纖毛在均布載荷q作用下懸臂端的撓度w大小為

式中,Lpc表示纖毛長度,Epc表示彈性模量和I=表示圓形截面慣性矩,Dpc表示直徑.通過計算得到不同長度初級纖毛在流場中受到的均布載荷為

圖16 根據(jù)懸臂梁受均布載荷理論(a)和不同長度Lpc(b)、直徑Dpc(c)和彈性模量Epc(d)初級纖毛的撓度w 計算均布載荷qFig.16 Calculate the uniform load q based on the cantilever beam subjected touniform load theory(a)and the deflection w of primary cilium of different lengths Lpc(b),diameter Dpc(c)and elastic modulus Epc(d)

圖16(b)為通過式(10)和t=0.25 s 不同長度Lpc的初級纖毛的撓度w算出的均布載荷q.圖16(c)為通過式(10) 和t=0.25 s 不同直徑Dpc的初級纖毛的撓度w算出的均布載荷q.圖16(d)為通過式(10)和t=0.25 s 不同彈性模量Epc的初級纖毛的撓度w算出的均布載荷q.圖16(b)～圖16(d)中左軸對應(yīng)t=0.25 s 時不同初級纖毛的撓度w的有限元結(jié)果,右軸對應(yīng)根據(jù)撓度w的有限元結(jié)果和式(10)得出的均布載荷q.從圖中可以看出撓度w的有限元結(jié)果隨著其長度Lpc,直徑Dpc和長度Lpc的增大而非線性變化,初級纖毛的均布載荷q的結(jié)果隨著其長度Lpc,直徑Dpc的增大而線性增大卻不受彈性模量Epc變化的影響.

3 討論

本文建立了矩形通道中壓力和電場同頻驅(qū)動微流體流動刺激細胞的三維有限元模型,該模型將細胞外界流場與多孔黏彈性細胞內(nèi)部各細胞器的應(yīng)力、位移、孔隙壓力和孔隙流速聯(lián)系起來,考察了初級纖毛,細胞質(zhì)和細胞核三種細胞器的力學(xué)信號傳導(dǎo)能力,為細胞如何通過調(diào)節(jié)滲透率和初級纖毛的幾何和力學(xué)特性改善自身的力學(xué)敏感性和感知力學(xué)信號的能力提供了理論參考,并提供了一種通過有限元方法結(jié)合細胞體外微流控實驗測試初級纖毛彈性模量的方法.

在前期工作中,王兆偉等[33]建立了二維振蕩層流理論,先前的工作主要討論了壓力驅(qū)動(pressure gradient driven)、電場驅(qū)動(electric filed driven)、力?電協(xié)同驅(qū)動(pressure-electricity synergic driven) 三種驅(qū)動方式液體流場的不同,圖17 為根據(jù)該理論還原的三種驅(qū)動力學(xué)信號圖,圖17(a)為力?電協(xié)同培養(yǎng)腔簡化圖;圖17(b)描述了三種驅(qū)動方式下的流率隨時間變化規(guī)律,力電協(xié)同驅(qū)動的流率是壓力和電場驅(qū)動的疊加;圖17(c) 和圖17(d) 描述了流速幅值時刻三種驅(qū)動方式的流速和切應(yīng)力分布,力電協(xié)同驅(qū)動的流速和切應(yīng)力是壓力和電場驅(qū)動的疊加,壓力驅(qū)動下腔壁附近即細胞所在位置(y/h=±1)的流速和切應(yīng)力很小,而電場驅(qū)動大幅加大了腔壁附近的流速和切應(yīng)力,電場驅(qū)動能提供較大的切應(yīng)力幅值而壓力梯度驅(qū)動則能提供較大的流率幅值,力?電協(xié)同作用時,可以聯(lián)合壓力梯度和電場驅(qū)動的調(diào)控優(yōu)勢.但二維的理論僅僅適用于寬度遠大于高度的矩形通道并且只能研究二維細胞的力學(xué)響應(yīng).本文首次建立三維有限元模型并通過理論計算驗證其有效性,進一步研究了流場中細胞的力學(xué)響應(yīng)機制.而本文的工作具體細化出了細胞等實體結(jié)構(gòu)進行建模計算.本三維模型不局限于腔寬遠大于腔高的情況,可以考察流體的流速壓力等在腔寬方向的變化,還可以進一步研究流體的壓力梯度場、電場、流體力學(xué)參數(shù)以及通道尺寸變化對細胞流體刺激的影響.與細胞的線彈性模型相比,多孔黏彈性模型可以考察細胞中的孔隙液體壓力,流速和相應(yīng)黏彈性行為.可以通過進一步細化細胞結(jié)構(gòu)的初級纖毛、細胞質(zhì)和細胞核三種細胞器來評估三種細胞器的力學(xué)傳導(dǎo)及其感受功效.因此在流場分析和細胞屬性方面較以前的工作有了很大的進展.

圖17 力?電協(xié)同驅(qū)動Fig.17 Pressure-electricity synergic driven

滲透率[38]是多孔彈性材料力學(xué)性能的主要影響因素.骨陷窩?骨小管系統(tǒng)的滲透率范圍大致在5.0×10?25～7.172×10?17m2范圍內(nèi),滲透率從大到小依次為:骨細胞>骨小管>骨陷窩>骨單元基質(zhì),本文選擇的細胞質(zhì)滲透率變化范圍在1.0×10?19～1.0×10?18m2內(nèi)[35].在周期性流場下的瞬態(tài)行為中,細胞質(zhì)的應(yīng)力、位移和孔隙壓力與培養(yǎng)液的發(fā)展周期和幅值時刻相同(均在t=0.25 s 達到最大值),但如圖5 所示細胞的液相流速響應(yīng)速度快于固相,滲透率越高,細胞的液相孔隙流速的響應(yīng)越快,流速幅值越大(圖5),分析認為:細胞內(nèi)液體的流動主要起因是細胞固相的擠壓和膨脹變形,細胞的液相流速幅值應(yīng)該發(fā)生在細胞變形最快的時刻左右,并與細胞的液相參數(shù)有關(guān),而不是發(fā)生在細胞的變形最大的時刻,因為細胞變形最大的時刻反而是細胞變形速度最慢的時刻.結(jié)合這一結(jié)論,在之后的模型中,可以進一步開發(fā)細胞核與細胞質(zhì)間的物質(zhì)運輸通道,也可以進一步研究細胞核的物質(zhì)交換能力.如圖6 所示,細胞質(zhì)貼壁側(cè)應(yīng)力較大,細胞貼壁側(cè)的細胞膜存在大量的整合蛋白發(fā)揮一定的粘附固定以及力學(xué)感知的作用[39],而細胞核被認為是細胞的信號處理中心并且細胞核的應(yīng)力和應(yīng)變大于細胞質(zhì)[40];細胞質(zhì)的滲透率、總位移、孔隙壓力和孔隙流速和體積比均大于細胞核,證明了細胞質(zhì)具有比細胞核更好的變形能力和物質(zhì)運輸水平.

初級纖毛被認為是主要的力學(xué)信號傳感器,如圖8 所示,初級纖毛的應(yīng)力和應(yīng)變遠大于細胞質(zhì)和細胞核,這個研究結(jié)果進一步說明了初級纖毛在細胞器中力學(xué)信號感知能力最強.初級纖毛的彎曲和拉伸是細胞感知外界流體環(huán)境的方式,那么在感受到外界信號后,初級纖毛如何將信號傳遞到細胞內(nèi)部的細胞核等細胞器就是一個重要的問題.研究表明,細胞信號的傳遞主要通過信號因子的運動來實現(xiàn),纖毛基部、纖毛膜和纖毛內(nèi)部的偶聯(lián)微管廣泛分布著多種相關(guān)蛋白等作為信號因子,這些蛋白參與不同的信號通路,具有不同的功能,比如初級纖毛在流體力學(xué)條件下發(fā)生彎曲變形時,通過調(diào)節(jié)初級纖毛基底體LKB1-AMPK-mTOR 反應(yīng),可以阻斷信號mTORC1,從而影響細胞體積[41].在Notch 通路中,Notch3 受體被錨定在初級纖毛膜上,可以通過與位于初級纖毛基底體的presenilin-2 相互作用而激活;血小板源生長因子受體(PDGFR) 是一種蛋白受體,位于初級纖毛膜,PDGFR 通路可以通過與受體結(jié)合的PDGF 配體激活,并通過激活下游MEK/ERK 級聯(lián)來誘導(dǎo)細胞反應(yīng)[42].而本文的研究發(fā)現(xiàn)纖毛基部附近的局部細胞質(zhì)的孔隙流速因為纖毛的彎曲而加大,這可能更有利于初級纖毛影響區(qū)域信號因子的運輸,而且從圖10(e) 可以看出長度超過2 μm 的初級纖毛影響區(qū)域的孔隙流速壓縮側(cè)(Zone 3)>底部(Zone 2)>拉伸側(cè)(Zone 1),說明足夠長的初級纖毛彎曲時纖毛基部對局部細胞質(zhì)的壓縮行為是局部孔隙流速提升的主要原因.所以,研究影響初級纖毛長度,剛度的因素有利于預(yù)防相關(guān)疾病,而研究調(diào)控其長度和剛度的方法也成為重要的生物醫(yī)學(xué)問題.

可以通過調(diào)節(jié)初級纖毛自身的幾何(長度,直徑)和力學(xué)(彈性模量)特性來調(diào)整其力學(xué)敏感性.本研究在t=0.25 s 時初級纖毛的擺動撓度達到最大值.(1)初級纖毛的長度是影響細胞力學(xué)信號傳導(dǎo)的主要因素,且越長的初級纖毛受流體力、自身彎曲、應(yīng)力和對基部的刺激都越大,具有更好的力學(xué)敏感性.初級纖毛的周期性擺動行為是一種非常重要的細胞行為,初級纖毛的長度不足與相關(guān)疾病有充分的聯(lián)系,比如癌細胞中初級纖毛長度的退化和減小[43],因此可以利用初級纖毛的力學(xué)敏感性來檢測相關(guān)疾病.在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中,隨著等級的嚴重程度,侵蝕關(guān)節(jié)從表面到潮汐線的初級纖毛的發(fā)生率和長度增大.這些結(jié)果提示初級纖毛參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制[44].(2)初級纖毛的彎曲剛度是影響細胞力學(xué)信號傳導(dǎo)的主要因素,而彎曲剛度主要受直徑和彈性模量影響,且彈性模量和直徑越小的初級纖毛擁有更好的彎曲能力.力學(xué)和化學(xué)刺激被證明都能改變纖毛的剛度,乙?；瘜?dǎo)致了HDAC6 mRNA 表達的抑制導(dǎo)致纖毛剛度增加,導(dǎo)致細胞對力學(xué)刺激的反應(yīng)減弱[45].最近的研究表明通過藥物等方法來調(diào)節(jié)初級纖毛來治療相關(guān)疾病已經(jīng)成為可能[45].細胞的初級纖毛會調(diào)節(jié)自身長度和剛度來適應(yīng)生理環(huán)境的變化,當(dāng)初級纖毛的彎曲和拉伸程度過大,初級纖毛會發(fā)生解體,將不能繼續(xù)發(fā)揮力學(xué)感知的作用,如圖12(e)初級纖毛的直徑越小,對影響區(qū)域的流速刺激越小,所以初級纖毛的剛度和長度應(yīng)在合理的范圍內(nèi)變化以保證其在流場中保持一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.此外,本文的研究為初級纖毛在流場中的承載大小和剛度計算提供了一種簡易的評估方法,計算結(jié)果表明初級纖毛的長度和直徑越大,在流場中所受的載荷也越大,這是初級纖毛通過自身變化來感受外界流場力學(xué)信號的機制,這也提供了一種在通過觀察初級纖毛在特定流場中的彎曲情況并結(jié)合相關(guān)理論或者有限元模擬來測定初級纖毛剛度的一種方法.初級纖毛所受的撓度與自身長度、直徑和彈性模量呈非線性關(guān)系,初級纖毛所受的載荷與自身長度和直徑呈線性關(guān)系,且不受自身彈性模量變化的影響,結(jié)合繞圓柱層流流體阻力公式q=4πρv2Dpc/Re[2.002 ?ln(Re)]和懸臂梁自由端斜率k=測定的初級纖毛的彎曲剛度EpcI在1.4×10?23～1.6×10?23N·m2之間,式中Re為雷諾數(shù)[46],這也為本文初級纖毛的受載隨長度和直徑的增大而增大的結(jié)論提供了理論依據(jù).

本模型將細胞與其微流體環(huán)境有機結(jié)合,考察了多孔黏彈性屬性細胞及其初級纖毛對流體環(huán)境的力學(xué)響應(yīng).模型存在以下不足:(1) 細胞是具有主動意識形態(tài)的生命體,忽略了細胞內(nèi)力(如組成細胞骨架的肌動蛋白束主觀運動)對其力傳導(dǎo)行為的影響;(2) 在本文的研究中并沒有給細胞賦予帶電的特性,不能考察包括初級纖毛在內(nèi)的細胞器在電場中自身受到的電場力的影響;(3)各細胞器為理想化規(guī)則的幾何體,并且將細胞假設(shè)為各向同性材料體,并未建立更精細的細胞器(細胞骨架,細胞膜,初級纖毛囊,高爾基體等) 及初級纖毛偶聯(lián)微管等系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模型將有利于研究工作的深入開展;(4)在估算初級纖毛的受力時,將初級纖毛在流體中的復(fù)雜受力簡化為均布載荷.

4 結(jié)論

本文建立了力?電驅(qū)動下含有多孔黏彈性細胞的微流控腔的有限元模型,研究了微流控通道內(nèi)的細胞及其纖毛的力學(xué)行為.具體建立了外界物理場與細胞內(nèi)部受力之間的關(guān)系,進一步量化了細胞的重要力學(xué)感受器——初級纖毛擺動力學(xué)行為.本文的工作為進一步研究微流體剪切對細胞的生長、分化等作用機理奠定了基礎(chǔ),同時也為檢測細胞微結(jié)構(gòu)(纖毛等蛋白鏈)的力學(xué)性能提供了理論技術(shù)基礎(chǔ).盡管模型有其局限性,但可以得出以下參考結(jié)論.

(1)滲透率對細胞結(jié)構(gòu)的孔隙壓力和流速有明顯的影響,是細胞多孔彈性力學(xué)響應(yīng)的主要物理影響參數(shù).細胞質(zhì)滲透率的提高加快了細胞質(zhì)的液相響應(yīng)速度并加大了液相流速大小.

(2) 相對于細胞質(zhì)、細胞核,初級纖毛所受到的應(yīng)力刺激最大,它是細胞主要的力學(xué)感受器,細胞核所受到的應(yīng)力刺激大于細胞質(zhì).

(3)初級纖毛長度和抗彎剛度可以調(diào)節(jié)細胞的力學(xué)感受敏感性,從纖毛的撓度和應(yīng)力,影響區(qū)域的應(yīng)力大小來衡量初級纖毛的敏感性,長度越大,剛度越小,敏感性越大.