貴州省兩棲動物新記錄種
——武陵掌突蟾

劉京，李仕澤，程彥林，陳龍，張霞，魏剛

(1.茅臺學院資源環(huán)境系，貴州仁懷564500； 2.貴陽學院生物多樣性保護重點實驗室，貴陽550002)

掌突蟾屬Leptobrachella廣泛分布于亞洲大陸東南部，包括中國南部及印度東北部及東南亞群島等，目前該屬已報道82種(Frost, 2020)，其中，中國記錄分布26種，貴州省記錄分布8種，分別為峨山掌突蟾L.oshanensis、蟼掌突蟾L.pelodytoides、福建掌突蟾L.liui、腹斑掌突蟾L.ventripunctata、畢節(jié)掌突蟾L.bijie、紫腹掌突蟾L.purpuraventra、綏陽掌突蟾L.suiyangensis和赤水掌突蟾L.chishuiensis(中國兩棲類，2020)。峨山掌突蟾主要分布在貴州印江、雷山、羅甸、江口等地(伍律等，1986；魏剛等，2017)，蟼掌突蟾主要分布在貴州安龍和雷山等地(伍律等，1986)，福建掌突蟾分布在貴州東南部雷山等地(費梁等，2012)，腹斑掌突蟾分布在貴州西北部習水等地(李光榮等，2016)，畢節(jié)掌突蟾和紫腹掌突蟾分布在貴州畢節(jié)等地(Wangetal.，2019)，綏陽掌突蟾分布在貴州綏陽(Luoetal.，2020)，赤水掌突蟾分布在貴州赤水(Lietal.，2020)。

2016年4月4日在江口縣梵凈山國家級自然保護區(qū)(108°46′8.07″E，27°50′56.77″N，海拔539 m)進行兩棲動物調(diào)查時，采集到掌突蟾屬成體標本1號(表1)。2016年6月6日，在雷山縣雷公山國家級自然保護區(qū)(108°11′47.2″E，26°22′42.24″N，海拔1 687 m)進行兩棲動物調(diào)查時，采集到掌突蟾屬成體標本1號(表1)。經(jīng)形態(tài)學比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定為武陵掌突蟾Leptobrachellawulingensis，為貴州省兩棲動物分布新記錄種。本文對其形態(tài)特征及生態(tài)習性進行描述，并初步探討其形態(tài)特征的地理變異，為掌突蟾屬物種的系統(tǒng)學和譜系地理學研究提供了新信息。

表1 樣品信息表Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

1 材料與方法

1.1 材料

2號標本取肌肉組織存于95%乙醇中，標本浸泡于10%福爾馬林溶液中，保存于茅臺學院生物學標本室。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

對2號標本使用游標卡尺(無錫錫工量具有限公司；量程200 mm，精度0.1 mm)進行測量，測量依據(jù)《中國兩棲動物檢索及圖鑒》(費梁等，2005)，并參照《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》(費梁等，2012)進行形態(tài)鑒定。

1.3 分子鑒定

以高鹽法提取保存于乙醇中的肌肉組織的DNA。利用引物P7和P8(Simonetal.，1994)擴增16SrRNA基因部分片段并測序。PCR擴增條件和步驟參照Chen等(2017)。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，大小符合要求的產(chǎn)物交上海生工生物公司測序。所得序列上傳到GenBank。

在GenBank中下載掌突蟾屬部分物種16SrRNA基因，結(jié)合本次采集標本所測序列，進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。以騰沖擬髭蟾Leptobrachiumtengchongense、華深擬髭蟾Leptobrachiumhuashen和大角蟾Megophrysmajor為外群(Lietal.，2020)。所有序列在Clustal X v1.8(Thompsonetal.，1997)中進行比對，采用貝葉斯法(Bayesian-Inference，BI)重建系統(tǒng)發(fā)育關系。建樹之前，利用jModeltest v2(David，2008)基于AIC標準選擇最適核苷酸替代模型。貝葉斯法運算中馬爾科夫鏈的蒙特卡羅方法(Markov chain Monte Carlo process)設置為4條鏈(3條冷鏈1條熱鏈)同時運行，共運行10 000 000代，每100代抽樣一次，共得到100 001個樣本及其相對的似然值和模型參數(shù)。在運行500 000代后，似然值趨于穩(wěn)定，舍棄最初的500 000代(5 000個樣本)，剩余的樣本構(gòu)建一致樹，并獲得系統(tǒng)樹的支系結(jié)構(gòu)和各支系的后驗概率。用MEGA v6.0(Tamuraetal.，2013)中的Kimura雙參數(shù)模型計算表1中所列掌突蟾屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

本次采集的2號標本(JK20160404001♂、LS20160610007♀)均為成體，體型中等，雄性體長31.0 mm，雌性體長32.2 mm，其他部位量度見表2。頭長小于頭寬，吻端略凸出于下唇。鼓膜清晰可見，圓形，稍凹陷；無犁骨齒，舌后有缺刻；鼻間距長于眼間距。眼角圓潤，瞳孔縱置，上半部分有明亮的金色虹膜，下半部虹膜呈銀色。指端圓且稍膨大，手指無蹼和指側(cè)緣膜，指長序為1<2≈4<3，掌突2，橢圓形，內(nèi)掌突大，外掌突略小。趾端圓形略膨大，趾間有蹼跡，趾側(cè)緣膜狹窄，趾長序為1<2<5<3<4。后肢纖細，左右跟部輕微重疊，后肢貼體前伸時跗關節(jié)到達眼中部。無婚墊和關節(jié)下瘤。

表2 貴州省采集的武陵掌突蟾成體標本形態(tài)量度Table 2 Morphometric measurements of adult Leptobrachella wulingensis from Guizhou Province

體背部灰褐色，有明顯的暗褐色斑點，散布有不規(guī)則的淺橙色色斑。背部皮膚粗糙，有稀疏的大疣粒。吻背部有不明顯的“Y”形斑紋。四肢背面為深棕色橫條紋，腹股溝至腋窩兩側(cè)為明顯的深棕色斑點，縱向排列成2列；肘部和上臂有深棕色條紋和明顯的銅黃色；手指和腳趾有明顯的深棕色條紋。四肢腹面呈灰紫色，腋上腺、股、胸、腹側(cè)腺清晰可見，呈乳白色(圖1)。

比較此次所采集的掌突蟾標本和其他掌突蟾屬物種的形態(tài)鑒定特征，發(fā)現(xiàn)本次采集的標本形態(tài)特征與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標本相符。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關系和遺傳距離

PCR擴增獲得的掌突蟾線粒體16SrRNA基因片段長度為495 bp，T、C、A、G含量分別是24.6%、24.6%、30.2%、20.6%，A+T含量高于G+C。本文所用最適核苷酸替代模型為GTR+G+I。

基于貝葉斯構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，來自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地(湖南省張家界天全山森林公園)的標本聚為一支，且有較高的支持率(0.94)(圖2)?；贙imura雙參數(shù)模型估算本研究中所采用的掌突蟾屬部分物種的遺傳距離(表3)為3.3%～13.2%，平均遺傳距離為6.94%。梵凈山和雷公山所采的掌突蟾標本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標本間的遺傳距離均為1.6%，遠小于掌突蟾屬物種間的遺傳距離。通過形態(tài)比較，在梵凈山和雷公山采集的掌突蟾標本與武陵掌突蟾原始描述(Qianetal.，2020)吻合，系統(tǒng)發(fā)育分析也支持采自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標本與武陵掌突蟾關系較近。

因此，結(jié)合形態(tài)比較與分子系統(tǒng)學分析結(jié)果，鑒定采集于貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標本為武陵掌突蟾，為貴州省兩棲動物分布新記錄。

2.3 生境描述

本次采集的武陵掌突蟾1號標本來自梵凈山國家級自然保護區(qū)森林內(nèi)的溪溝旁(圖3：a)，與其同域分布的兩棲類有棘腹蛙Quasipaaboulengeri、棘指角蟾Megophrysspinata、華西雨蛙Hylaannectans、中華湍蛙Amolopssinensis、中華蟾蜍Bufogargarizans、武陵瘰螈Paramesotritonwulingensis等。另1號標本采集于雷公山國家級自然保護區(qū)的溪溝旁(圖3：b)，與其同域分布的兩棲類有棘腹蛙、雷山角蟾Megophrysleishanensis、雷山髭蟾Vibrissaphoraleishanensis、中華湍蛙、中華蟾蜍和大樹蛙Zhangixalusdennysi等。

3 討論

掌突蟾屬物種在中國廣泛分布，大多數(shù)物種間形態(tài)較為相似，因此在野外很難對其進行鑒定(費梁等，2012)。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，采用形態(tài)比較結(jié)合分子系統(tǒng)學分析對物種進行鑒定的方法已廣泛應用。

目前貴州省記錄的掌突蟾屬物種有8種(中國兩棲類，2020)。本文通過GenBank下載貴州已有報道的掌突蟾及其近緣種的16SrRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)本文采集的標本和貴州省有記載分布的紫腹掌突蟾、綏陽掌突蟾、赤水掌突蟾、畢節(jié)掌突蟾、峨山掌突蟾、蟼掌突蟾、福建掌突蟾和腹斑掌突蟾的遺傳距離分別為4.4%、5.3%、5.5%、6.0%、6.7%、11.9%、12.6%和13.2%，和武陵掌突蟾模式產(chǎn)地標本的遺傳距離僅為1.6%，且小于其他掌突蟾屬物種的遺傳距離。

表3 基于16S rRNA基因序列估算的掌突蟾屬物種間Kimura雙參數(shù)遺傳距離Table 3 Genetic distance under Kimura 2-parameter model on 16S rRNA gene of Leptobrachella species examined in the study

采自貴州梵凈山和雷公山的掌突蟾標本與目前貴州記載的8種掌突蟾屬物種在形態(tài)上存在明顯的差異(表4)。趾基部有蹼跡和狹窄的趾側(cè)緣膜，區(qū)別于腹斑掌突蟾和峨山掌突蟾(無趾側(cè)緣膜)、福建掌突蟾(側(cè)緣膜較寬)和蟼掌突蟾(具1/4～1/3蹼，側(cè)緣膜寬)；后肢貼體前伸跗關節(jié)達眼中部，區(qū)別于赤水掌突蟾(跗關節(jié)達鼓膜)和腹斑掌突蟾(跗關節(jié)達鼓膜至眼后角)；體腹部白色，胸部和腹部前方有疣粒狀白色斑點，區(qū)別于紫腹掌突蟾(腹部灰紫色，有灰色斑點)、腹斑掌突蟾(腹部有深褐色斑點)和畢節(jié)掌突蟾(腹部有灰白色斑點)；背部皮膚粗糙，有稀疏的大疣粒，區(qū)別于綏陽掌突蟾、腹斑掌突蟾、峨山掌突蟾背部無大疣粒。背側(cè)有明顯標記，區(qū)分于貴州分布所有掌突蟾。側(cè)腹部有黑點，區(qū)分于峨山掌突蟾和蟼掌突蟾的大的黑點。本次采集的掌突蟾標本與武陵掌突蟾模式產(chǎn)地的形態(tài)上也存在一些差異，如頭寬大于頭長，不同于模式產(chǎn)地的頭長大于頭寬或幾乎相等的情況；皮膚呈灰棕色，不同于模式產(chǎn)地的體背部皮膚棕色或紅棕色。由于本次采集的武陵掌突蟾標本數(shù)有限，上述差異是否為適應不同環(huán)境而導致的形態(tài)變異，有待進一步采集標本進行論證。

表4 貴州分布的掌突蟾屬物種形態(tài)特征比較Table 4 Morphological comparisons between the Leptobrachella species occurring from Guizhou Province

武陵掌突蟾為中國特有種，此前報道在我國的分布僅限于湖南省武陵山脈，包括張家界市天全山森林公園和天子山自然保護區(qū)，海拔為414～979 m的山區(qū)(Qianetal.，2020)。此次在貴州省江口縣梵凈山國家級自然保護區(qū)(采集地海拔539 m)和雷山縣雷公山國家級自然保護區(qū)(采集地海拔1 687 m)發(fā)現(xiàn)武陵掌突蟾，豐富了其分布信息，并拓寬了對該物種分布海拔的認識。