基于VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路研究淫羊藿苷促進(jìn)大鼠脛骨干骨折愈合的作用機(jī)制

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450000

骨折是指骨的力學(xué)連續(xù)性、完整性丟失，以骨折處疼痛、腫脹、功能障礙、異?；顒?dòng)等主要臨床表現(xiàn)，是常見的外科疾病之一[1]。骨折愈合是極為復(fù)雜的組織學(xué)修復(fù)過程，其中血管新生貫穿于整個(gè)骨折愈合過程，從血腫機(jī)化期、原始骨痂形成期到骨痂改造塑形期都有血管新生的參與。臨床已證實(shí)血液供應(yīng)是影響骨折愈合情況的主要因素[2-3]，因此促進(jìn)血管新生是加快骨折愈合的關(guān)鍵。淫羊藿苷（icariin，ICA）是提取自淫羊藿莖葉的總黃酮類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫功能、改善內(nèi)分泌、抗腫瘤等多種藥理學(xué)功能[4]。近年來有研究指出，ICA可通過激活血管生成信號(hào)分子，刺激血管新生，為骨折治療提供新的可能[5]。血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGF/VEGFR-2）信號(hào)通路在血管新生過程中起著關(guān)鍵作用，研究證實(shí)該信號(hào)通路介導(dǎo)和參與了骨折愈合過程[6]。然而，目前鮮有基于VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路研究ICA對骨折愈合影響的報(bào)道。鑒于此，本研究建立大鼠脛骨干骨折模型，研究ICA對大鼠脛骨干骨折愈合的作用并探討相關(guān)機(jī)制，以期指導(dǎo)臨床。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雄性SD大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量（300±20）g，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（豫）2011-0001]，溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12h/12h，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 ICA購于上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：20120706）；復(fù)方骨肽注射液購于常州方圓制藥有限公司（劑量：5mL/75mg，國藥準(zhǔn)字：H20065416）；戊巴比妥鈉購于上海化學(xué)試劑總廠試劑二廠（批號(hào)：820219）；Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司（批號(hào)：79407）；RT-Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海Roche公司（批號(hào)：4897030001）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：AR0146）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液購于上海雷浩信息科技有限公司（批號(hào)：B1007）；Tris緩 沖 液（Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20，TBST）購于南京安培化工科技有限公司（批號(hào)：SBJ-1020）；VEGF、VEGFR-2單抗均購于美國Abcam公司（批號(hào)：ab32152、ab245725）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：A0208）。

數(shù)字化X線攝片機(jī)為美國hologic公司產(chǎn)品；BX51顯微鏡購于日本Olympus株式會(huì)社；Inveon Research Wofkplace軟件購于德國西門子股份公司；Image Pro-Plus Software 6.0 IPP軟件為美國微軟公司產(chǎn)品；Electro Force 3200生物力學(xué)性能測試儀購于美國BOSE公司；Viva CT40微計(jì)算機(jī)斷層掃描（microcomputed tomography，Mirco-CT） 機(jī)購于瑞士SCANCO Medical AG公司；ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)為美國Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 參照文獻(xiàn)[7]，采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，6%硫化鈉于左下肢備皮后，以右側(cè)臥位固定于造模臺(tái)。碘伏消毒左足至左大腿上段，于脛骨結(jié)節(jié)下方2mm沿脛骨脊作1.5cm縱向切口，剝離外皮，繼續(xù)沿脛骨脊外側(cè)0.5mm位置將淺筋膜與深筋膜層縱向切開，游離脛骨前肌群，暴露脛骨外骨面。采用5mL注射器針頭于脛骨髕韌帶開口，插入克氏針沿髓腔達(dá)脛骨粗隆間，于脛骨中段前方最高點(diǎn)鋸開約3mm左右缺損，缺損達(dá)骨髓腔，形成脛骨中段橫行骨折。繼續(xù)插入克氏針穿過骨折位置貫穿整個(gè)脛骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將其遠(yuǎn)端埋于骨皮質(zhì)下。以0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合切口，涂抹適量紅霉素軟膏，連續(xù)3d每天注射8萬U青霉素以預(yù)防感染。術(shù)后即刻于大鼠麻醉狀態(tài)下拍攝患肢X線片，建模成功標(biāo)準(zhǔn)：脛骨中段斜形或橫形骨折，骨折端內(nèi)固定效果理想，未發(fā)生明顯移位。50只大鼠建模成功41只、失敗9只，將建模成功的41只大鼠隨機(jī)分為對照組 （10只）、ICA低劑量組（10只）、ICA高劑量組（10只）、陽性藥物組（11只）。

1.3.2 術(shù)后干預(yù) 術(shù)后第2天開始進(jìn)行干預(yù)，參照文獻(xiàn)[8]結(jié)合前期研究確定ICA的劑量，ICA低、高劑量組分別為40mg/（kg·d）、80mg/（kg·d）。ICA采用0.9%氯化鈉溶液溶解，以5mL/（kg·d）的劑量腹腔注射，1次/d。陽性藥物組采用復(fù)方骨肽注射液治療，取0.4mL溶于0.9%氯化鈉溶液，以5mL/（kg·d）的劑量腹腔注射，1次/d。對照組以等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d。各組均連續(xù)干預(yù)21d。

1.3.3 Mirco-CT活體掃描 干預(yù)第7、14、21天進(jìn)行Mirco-CT活體掃描。掃描前以2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，保持大鼠俯臥位，屈曲雙下肢，使股骨縱軸平行于Mirco-CT床滑軌的移動(dòng)軸，在心電監(jiān)護(hù)下行活體掃描。掃描分辨率47μm，掃描電壓80kV，電流500μA，旋轉(zhuǎn)角度360°，掃描時(shí)間2 000ms，幀平均數(shù)6，掃描范圍為骨折線上下5mm。采用標(biāo)準(zhǔn)體模校準(zhǔn)掃描結(jié)果，圍繞骨痂沿股骨縱軸取100個(gè)掃描層面，上下各50個(gè)，建立感興趣區(qū)。采用Inveon Research Wofkplace軟件定量分析獲取的三維圖像信息，計(jì)算樣本骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）。

1.3.4 生物力學(xué)測試 末次行Mirco-CT活體掃描后脫頸處死大鼠，完全剝離左下肢脛骨，采用骨水泥固定其兩端避免加載時(shí)旋轉(zhuǎn)移位，取等長骨架，采用生物力學(xué)性能測試儀進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。以所取脛骨段中點(diǎn)為加載點(diǎn)，承載點(diǎn)跨距30mm，加載速度2mm/min，記錄各組最大載荷。

1.3.5 血管新生情況觀察 處死大鼠后，以骨折位置作為中心，上下各取5mm×5mm骨痂組織標(biāo)本，以4%多聚甲醛固定24h，組織塊常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作成厚度5μm的切片，脫蠟后蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP軟件測定新生血管面積，并計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量，在骨痂愈合平面單位視野內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)不相鄰視野，計(jì)算每個(gè)視野平均值。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantiative Real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）法檢測骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量處死大鼠后取骨折位置骨痂組織50mg，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，鑒定后進(jìn)行基因序列擴(kuò)增，按照QRT-PCR SYBRⅡ試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)體系總共25μL，包括SYBR Premix Ex Taq 10.5μL，5μmol·L-1上、 下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 10.5μL。反應(yīng)條件：90℃預(yù)變性5min，95℃變性20s，55℃退火40s，72℃延伸60s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算各目的基因相對表達(dá)量。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.7 Western blot法檢測骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量 處死大鼠后取骨折位置骨痂組織50mg，充分研磨后冰上裂解30min，8 000r/min離心15min（離心半徑10cm），BCA法測定蛋白濃度，取30μg待檢測樣本與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴5min，8 000r/min離心30min（離心半徑10cm），取上清液，SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入稀釋倍數(shù)為1:1 000的兔抗大鼠VEGF、VEGFR-2單抗稀釋液，4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，加入稀釋倍數(shù)為1:8 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2h，TBST洗滌3次后加入發(fā)光液，暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶灰度值，以目的條帶/內(nèi)參條帶灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量方差分析，經(jīng)Levene檢驗(yàn)滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，以最小顯著性差異（least significant difference，LSD）-t檢驗(yàn)行兩兩比較；方差不齊者，采用Welch檢驗(yàn)，再以Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)第7、14、21天各組活體Micro-CT結(jié)果比較 干預(yù)第7、14、21天，各組間總體比較，BV/TV、Tb.N差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）。隨時(shí)間延長各組BV/TV均呈增高趨勢，Tb.N呈增多趨勢（P＜0.01）。見表2～3。干預(yù)第21天活體Micro-CT結(jié)果顯示，對照組、ICA低劑量組骨折斷端尚未完全吻合，骨折線明顯，骨皮質(zhì)外觀連續(xù)性差，提示新生骨量較少；ICA高劑量組、陽性藥物組骨折斷端吻合良好，骨折線不明顯，骨皮質(zhì)外觀較為連續(xù)，提示新生骨量較多。見圖1。

圖1 干預(yù)第21天活體Micro-CT結(jié)果Fig.1 In vivo micro-CT results on the 21st day of intervention

表2 干預(yù)第7、14、21天各組BV/TV值比較（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

表2 干預(yù)第7、14、21天各組BV/TV值比較（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05；與同組第7天比較，▽P＜0.05；與同組第14天比較，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

組別 n 第7天 第14天 第21天對照組 10 0.19±0.04 0.24±0.05▽ 0.29±0.04▽◇ICA 低劑量組 10 0.24±0.05* 0.29±0.05*▽ 0.34±0.06*▽◇ICA 高劑量組 10 0.28±0.04*# 0.34±0.05*#▽ 0.40±0.05*#▽◇陽性藥物組 11 0.34±0.05*#△ 0.39±0.04*#△▽ 0.46±0.07*#△▽◇F 值 F 組間=15.246，F(xiàn) 時(shí)間=19.712，F(xiàn) 交互=17.075 P 值 P 組間＜0.01，P 時(shí)間＜0.01，P 交互＜0.01

表3 干預(yù)第7、14、21天各組Tb.N比較（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

表3 干預(yù)第7、14、21天各組Tb.N比較（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05；與同組第7天比較，▽P＜0.05；與同組第14天比較，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

組別 n 第7天 第14天 第21天對照組 10 1.87±0.32 2.25±0.46▽ 2.69±0.39▽◇ICA 低劑量組 10 2.22±0.37* 2.65±0.40*▽ 3.08±0.41*▽◇ICA 高劑量組 10 2.70±0.39*# 3.10±0.43*#▽ 3.54±0.55*#▽◇陽性藥物組 11 3.25±0.39*#△ 3.63±0.42*#△▽ 4.21±0.81*#△▽◇F 值 F 組間=10.711，F(xiàn) 時(shí)間=14.482，F(xiàn) 交互=12.270 P 值 P 組間＜0.01，P 時(shí)間＜0.01，P 交互＜0.01

2.2 各組生物力學(xué)測試結(jié)果比較 各組間總體比較，最大載荷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）。見表4。

表4 各組生物力學(xué)測試結(jié)果比較（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

表4 各組生物力學(xué)測試結(jié)果比較（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別n最大載荷對照組 10 27.38±3.96 ICA低劑量組 10 36.92±5.07*ICA高劑量組 10 48.63±5.92*#陽性藥物組 11 59.87±7.03*#△F值 62.125 P值 ＜0.01

2.3 各組新生血管數(shù)量、新生血管面積比較 各組間總體比較，新生血管數(shù)量、新生血管面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組新生血管數(shù)量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組新生血管數(shù)量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組新生血管數(shù)量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 各組血管新生情況（HE染色，200×）Fig.2 Angiogenesis in each group（HE staining，200×）

表5 各組新生血管數(shù)量、新生血管面積比較（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

表5 各組新生血管數(shù)量、新生血管面積比較（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n 新生血管數(shù)量（個(gè)/視野） 新生血管面積（μm2/視野）對照組 10 5.10±0.83 1 652.30±324.87 ICA 低劑量組 10 9.00±1.53* 3 567.90±587.21*ICA 高劑量組 10 11.50±2.86*# 6 092.10±896.30*#陽性藥物組 11 16.80±3.52*#△ 8 847.30±1 246.35*#△F值 41.594 141.008 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量比較 各組間總體比較，骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量較高（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量較高 （P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量較高（P＜0.05）。見表6。

表6 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

表6 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n VEGF VEGFR-2對照組 10 0.18±0.03 0.19±0.03 ICA 低劑量組 10 0.30±0.05* 0.38±0.05*ICA 高劑量組 10 0.49±0.06*# 0.54±0.06*#陽性藥物組 11 0.68±0.07*#△ 0.70±0.08*#△F值 166.562 144.748 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.5 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量比較 各組間總體比較，骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量較高（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量較高（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量較高（P＜0.05）。見表7、圖3。

圖3 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 proteins in callus tissue in each group

表7 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量比較（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

表7 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達(dá)量比較（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n VEGF VEGFR-2對照組 10 0.12±0.03 0.10±0.02 ICA 低劑量組 10 0.29±0.04* 0.23±0.03*ICA 高劑量組 10 0.51±0.06*# 0.52±0.07*#陽性藥物組 11 0.73±0.08*#△ 0.63±0.08*#△F值 228.939 194.775 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

骨折時(shí)，骨折斷端與臨近骨膜、血管受損，導(dǎo)致局部范圍骨壞死。當(dāng)骨折正確固定后，斷端張力降低，斷端破骨細(xì)胞開始管性吸收，形成新的Haversian管系統(tǒng)，為血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周干細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及新生血管進(jìn)入骨痂創(chuàng)造條件，從而促進(jìn)軟骨骨痂吸收、骨性骨痂形成、骨改建，實(shí)現(xiàn)骨折愈合[9-10]。骨折愈合是生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)綜合作用的動(dòng)態(tài)過程，需要血管發(fā)生與骨發(fā)生之間精密、協(xié)調(diào)地配合，其中血管發(fā)生先于骨發(fā)生，而且是軟骨成骨時(shí)期最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[11]。因此，探尋安全、有效的促血管新生藥物對加快骨折愈合至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組的BV/TV、新生血管面積、最大載荷均增大，Tb.N、新生血管數(shù)量均增加，提示ICA可增加新生骨量、促進(jìn)血管新生，加快骨折愈合，并增強(qiáng)其抵抗外力沖擊的能力。中醫(yī)認(rèn)為，骨折后肢體經(jīng)絡(luò)受損，血溢脈外，淤血不散，致經(jīng)脈受阻、筋骨失養(yǎng)，骨折難愈[12]。腎主骨與髓，腎強(qiáng)則達(dá)骨和，淤散則達(dá)血新，筋骨得以濡養(yǎng)，氣血旺盛，則骨愈合。淫羊藿味辛、甘，歸于腎、肝經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)健筋骨的功效。ICA是淫羊藿提取物中的主要有效成分，因其具有雌激素樣結(jié)構(gòu)，逐漸被作為植物雌激素類藥物應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松治療[13]。既往研究顯示，ICA治療老齡大鼠骨質(zhì)疏松骨折，可促使骨密度顯著回升，同時(shí)成骨標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，提示ICA對該病具有良好的治療作用[14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，ICA可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，同時(shí)促進(jìn)類骨質(zhì)鈣化與骨折位置的血管生成[15-16]。本研究應(yīng)用不同劑量的ICA干預(yù)脛骨干骨折大鼠后，新生骨量及新生血管增加，抗沖擊能力增強(qiáng)，與ICA促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、血管生成等功效關(guān)系密切。

VEGF是一種具有特異性的強(qiáng)力血管新生誘導(dǎo)劑，可活化成纖維細(xì)胞，并促使其分泌基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)血管生成。VEGFR-2是介導(dǎo)血管新生的重要信號(hào)傳遞分子，VEGF可與其結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮釋放基質(zhì)蛋白降解酶，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞游離，促進(jìn)血管新生。同時(shí)VEGFR-2有助于提升內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移能力，還參與血管通透性的調(diào)節(jié)，在骨折愈合早期即能夠促使骨祖細(xì)胞聚集到骨折斷端，加快骨愈合速度，而其他相關(guān)因子對血管新生的促進(jìn)作用也全部或部分通過VEGF而實(shí)現(xiàn)[17]。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中VEGF/VEGFR-2表達(dá)顯著升高，VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路抑制劑Apatinib可阻斷該信號(hào)通路，從而抑制腫瘤血管生成。安曉暉等[19]采用穿山龍總皂苷治療去勢大鼠骨折時(shí)發(fā)現(xiàn)，大鼠骨痂處骨密度及新生血管數(shù)量均增加，且VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路與骨折愈合相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對照組、ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量依次升高，提示ICA對大鼠脛骨干骨折愈合的促進(jìn)作用可能與激活VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，ICA可加快脛骨干骨折大鼠骨量新生，促進(jìn)血管形成，增強(qiáng)抵抗外力沖擊的能力，且其作用呈劑量依賴性，推測其作用機(jī)制與上調(diào)VEGF、VEGFR-2表達(dá)，激活VEGF/VEGFR-2信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為ICA應(yīng)用于骨折治療提供了理論基礎(chǔ)，然而關(guān)于ICA對脛骨干骨折是否存在其他影響及相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。