發(fā)物對接觸性皮炎模型大鼠的影響

汪一晗 邢鳳玲 傅宏陽 岑璐莎 楊曉紅 曹毅

1.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江省中醫(yī)院

接觸性皮炎（contact dermatitis，CD）是一種常見的炎癥性皮膚疾病，通常由接觸致敏物或刺激物引起[1]。近年來飲食對于皮膚疾病的影響越來越受到重視，但仍少有文獻報道飲食對CD的影響。此病因接觸物不同而有不同的中醫(yī)病名，如接觸油漆者為漆瘡、接觸膏藥者為膏藥風等。在中醫(yī)理論中，此病多由過食肥甘，脾胃積濕生熱，濕熱內(nèi)搏，湊于皮膚；又受風邪，不得宣通而出現(xiàn)[2]。牛羊肉是常見的“發(fā)物”，味甘性溫，被認為忌用于胃腸濕熱證患者，且會加重瘡瘍腫物[3]。本研究通過觀察牛羊肉對胃腸濕熱證CD模型大鼠皮損及血清中相關(guān)炎癥因子的影響，探究發(fā)物對CD的影響，從而為臨床上指導患者飲食宜忌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量180～220g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，飼養(yǎng)和實驗均在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]。飼養(yǎng)室溫21～23℃，濕度30%～40%，光照12h明暗交替，大鼠自由進食飲水，每日更換無菌干燥墊料。所有實驗均嚴格按照動物實驗倫理委員會制定的動物福利和倫理標準操作。

1.2 主要試劑 瑪貝拉脫毛膏購于廣州諾菲化妝品有限公司（規(guī)格：50g/支，國妝特字：G20100663）；3%戊巴比妥溶液購于美國Sigma-aldrich公司（批號：P3761）；蘇木精（hematoxylin，H）購于上海展云化工有限公司（批號：0712059）；伊紅（eosin，E）購于國藥集團化學試劑有限公司（批號：20140818）；大鼠白細胞介素-35（interleukin-35，IL-35）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試 劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購于酶免公司（批號：MM-0856R2、MM-0180R2）；Notch1抗體購于Cell Signaling Technology（CST）公司（批號：3608S）。

肥甘飼料：由普通飼料60%、10%植物油、10%雞蛋、10%黃油、7%奶粉、3%白糖組成，另加200g·L-1蜂蜜（冠生園集團有限公司產(chǎn)品）、紅星二鍋頭（體積百分比：50%vol，北京紅星股份有限公司產(chǎn)品）。牛肉/羊肉飼料：在肥甘飼料基礎(chǔ)上加15%的牛肉或羊肉。

1.3 主要儀器 HEINE mini 3000R型皮膚鏡購于德國HEINE醫(yī)療器械公司；BX50型電子顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 制備胃腸濕熱模型 所有大鼠以標準飼料飼養(yǎng)1周后，隨機分為牛肉組、羊肉組、胃腸濕熱組、模型對照組、空白組，每組各5只。參照呂冠華等[4]的方法用飲食干預制備胃腸濕熱模型，除空白組和模型對照組大鼠予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其余3組大鼠均予肥甘飼料飼喂，飼喂次數(shù)等同于大鼠正常進食次數(shù)。食物干預21d后，參照任璽等[5]的方法，對大鼠一般情況、飲食、二便及肛溫進行評估，判斷胃腸濕熱模型是否建立成功。當大鼠出現(xiàn)精神萎靡、大便溏稀、肛門黏膜潮紅、肛溫升高時，表明建模成功。CD造模前1d，牛肉組和羊肉組分別開始投放含牛肉或羊肉的肥甘飼料，飼喂次數(shù)及時間與大鼠正常進食相同。

1.4.2 CD模型制備 胃腸濕熱模型構(gòu)建成功后，所有大鼠用電推剪剪去背部毛發(fā)，在背部以脊柱為中線選擇4cm×4cm大小皮膚作為實驗區(qū)域，空白組參照脫毛膏使用方法進行脫毛后，涂抹0.9%氯化鈉注射液，停留8min后擦凈；其余組于相同部位涂抹5mm長度脫毛膏，停留8min后以濕巾擦凈，24h后再次涂抹等量脫毛膏，停留8min后擦去，構(gòu)建CD模型。在造模完成當日及48h后分別觀察大鼠皮損變化。

1.4.3 標本采集 CD造模第3天，禁食不禁水8h，各組大鼠以100mg·kg-1戊巴比妥腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血，離心后分離血清，-80℃凍存。采血后剪取皮損明顯處皮膚和胃體組織、空腸、回腸、結(jié)腸組織，置于10%甲醛溶液中固定；另取皮損處皮膚和胃體組織，空腸、回腸、結(jié)腸組織各約1.0cm長，-80℃冷凍保存。

1.4.4 組織病理觀察 將固定于甲醛溶液中的組織脫水，用石蠟包埋并切片。HE染色后，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織病理變化。

1.4.5 免疫組化檢測Notch1蛋白表達水平 用免疫組化法檢測大鼠皮損及消化道組織中Notch1的表達。將組織包埋、切片，室溫脫蠟并水化，封閉后滴入一抗4℃過夜；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后滴加二抗孵育，清洗后以3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobezidin，DAB）染色，復染、脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。免疫組化陽性物質(zhì)為棕黃色、黃色、淡黃色，呈顆粒狀、絲狀。根據(jù)視野中陽性細胞占比及染色程度綜合評價結(jié)果。陽性細胞占比評分：0%計0分，1%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分； 染色程度評分：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕色計3分。將兩者分數(shù)相加，綜合評定：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～5分為陽性，6～7分為強陽性。

1.4.6 血清炎癥因子檢測 以ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-35的表達，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，滿足正態(tài)分布時，組間比較采用單因素方差分析?？傮w均數(shù)滿足方差齊性者，進一步兩組間比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）-t檢驗； 方差不齊采用Dunnet'T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況、大便性狀及肛溫變化比較 食物干預造模21d后，空白組及模型對照組大鼠精神狀態(tài)較好，反應迅速，大便成形，質(zhì)地顏色正常，肛門直腸黏膜顏色正常，肛溫無明顯改變；胃腸濕熱組、牛肉組、羊肉組大鼠精神倦怠，反應遲緩，飲食減少，大便稀溏，有臭穢氣味，肛門直腸黏膜潮紅，肛溫較造模前升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠胃腸濕熱證造模前后肛溫比較（±s，℃）Tab.1 Comparison of anal temperature before and after modeling of gastrointestinal dampness-heat syndrome in each group(±s，℃)

表1 各組大鼠胃腸濕熱證造模前后肛溫比較（±s，℃）Tab.1 Comparison of anal temperature before and after modeling of gastrointestinal dampness-heat syndrome in each group(±s，℃)

注：與同組造模前比較，*P＜0.05Note:Compared with the same group before modeling，*P＜0.05

組別造模前 造模后空白組 37.8±0.3 37.9±0.3模型對照組 37.6±0.2 37.8±0.3胃腸濕熱組 37.8±0.3 38.8±0.2*牛肉組 37.6±0.4 38.9±0.5*羊肉組 37.8±0.3 39.1±0.5*

2.2 各組大鼠皮損情況比較 空白組背部表皮完好，無皮損。模型對照組大鼠背部見紅斑伴輕度腫脹，呈淡紅色，少量針尖大小水皰、部分糜爛；皮膚鏡表現(xiàn)為淡紅色背景下不規(guī)則分布的多形性或線狀血管。48h后見紅斑、結(jié)痂和少量鱗屑。牛肉組和羊肉組及胃腸濕熱組大鼠背部見邊緣清晰的紅斑，呈鮮紅色，部分糜爛，伴有明顯腫脹，其上密布針尖大小水皰；皮膚鏡下表現(xiàn)為紅色背景下大量不規(guī)則分布的多形性血管及水皰。48h后肉眼見少量紅斑，部分已結(jié)痂，可見較多鱗屑。見圖1及圖2。

圖1 肉眼觀察大鼠皮損表現(xiàn)Fig.1 Skin lesions of rats observed with naked eyes

圖2 皮膚鏡下觀察大鼠皮損表現(xiàn)（30×）Fig.2 Skin lesions of rats observed with dermatoscope（30×）

2.3 各組大鼠病理表現(xiàn)比較 空白組表皮結(jié)構(gòu)完整，細胞排列緊密，無明顯細胞內(nèi)及細胞間水腫，真皮處可見少量淋巴細胞。牛肉組、羊肉組、胃腸濕熱組均見表皮結(jié)構(gòu)嚴重破壞，出現(xiàn)嚴重海綿水腫，棘層內(nèi)水皰，皰內(nèi)有少量淋巴細胞，表皮及真皮內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞，真皮淺層血管擴張，內(nèi)皮細胞腫脹明顯，周圍大量淋巴細胞浸潤。模型對照組表皮結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯海綿水腫，棘層內(nèi)水皰，真皮內(nèi)較多以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，真皮淺層血管擴張，內(nèi)皮細胞腫脹，其病理表現(xiàn)與上3組類似，但細胞水腫及炎癥細胞浸潤程度較輕。見圖3。

圖3 大鼠皮損病理表現(xiàn)（HE染色，200×）Fig.3 Pathological manifestations of skin lesions of rats（HE staining，200×）

2.4 各組大鼠皮損及胃腸道組織中Notch1表達比較 空白組中，Notch1蛋白在所測組織中均呈陰性表達。模型對照組中，Notch1在表皮及血管內(nèi)皮中呈弱陽性，在消化道組織中均為陰性。牛肉組和羊肉組中，皮損及消化道組織中，Notch1均呈強陽性表達。胃腸濕熱組中，Notch1在表皮及血管內(nèi)皮呈陽性表達，在胃黏膜層和空腸、回腸、結(jié)腸的黏膜層和肌層呈陽性表達。見圖4。

圖4 各組大鼠皮膚及消化道組織中Notch1蛋白的表達（標尺=250μm，40×）Fig.4 Expression of Notch1 in skin and digestive tract tissues in each group（scale=250μm，40×）

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-35水平比較 與空白組比較，模型對照組大鼠血清炎癥因子水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，牛肉組、羊肉組大鼠TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），牛肉組的IL-35表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型對照組比較，胃腸濕熱組IL-35水平明顯降低 （P＜0.05），TNF-α水平稍升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-35水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-35 in each group(±s，pg·mL-1)

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-35水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-35 in each group(±s，pg·mL-1)

注：與模型對照組比較，△P＜0.05Note:Compared with model control group，△P＜0.05

分組 n TNF-α IL-35空白組 5 511.58±27.41 136.06±3.14模型對照組 5 506.99±23.13 134.67±4.66胃腸濕熱組 5 528.28±34.25 125.16±6.92△牛肉組 5 569.53±21.64△ 116.29±4.85△羊肉組 5 614.34±42.23△ 132.29±11.03

3 討論

CD是一種接觸某些物質(zhì)后出現(xiàn)的炎癥性皮膚病，根據(jù)接觸物為致敏物或刺激物分為過敏性CD和刺激性CD兩類[6]。目前，CD大鼠造模多采用2，4-二硝基氟苯，但在前期實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)在大鼠皮膚上涂抹脫毛膏，并停留8min以上，再次涂抹時，90%以上大鼠會出現(xiàn)CD急性期樣表現(xiàn)，而且病理組織改變?yōu)楸砥ず＞d水腫、細胞間水皰、真皮層大量炎癥細胞浸潤，與標準CD模型相似，因此本研究采用脫毛膏誘導大鼠CD模型。

中醫(yī)認為，CD主要是由患者稟賦不足，復感風、熱、濕邪所致，其中患者素體濕熱內(nèi)蘊是重要內(nèi)因，與臟腑功能（尤其是脾胃功能）失調(diào)密切相關(guān)，飲食不節(jié)是重要的誘發(fā)因素?！端貑枴分性疲骸帮嬍匙员?，腸胃乃傷?！闭f明飲食不節(jié)與疾病發(fā)生之間具有密切關(guān)系?；颊叱Ｒ蜻^食膏粱厚味、甘溫之物滋膩礙胃，助濕生熱，從而出現(xiàn)胃腸濕熱的表現(xiàn)?！督饏T翼》云：“有飲食之濕，酒水乳酪之類也?！盵7]內(nèi)生濕熱蘊于皮膚，在外接觸毒邪，蘊而化熱，與人體之氣血相搏，拂郁肌膚發(fā)而為病。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，高糖高脂的西方飲食會促使TNF-α、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）等促炎因子的水平升高[8]，這可能是因為動物油脂中富含的長、中鏈脂肪酸會破壞腸道屏障功能，提高腸上皮通透性，促進輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）和Th17的增殖和分化，從而誘導腸道炎癥性改變；而高纖維飲食所含有的短鏈脂肪酸，能促進調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）的數(shù)量增加，從而抑制腸道炎癥[9-10]。故在胃腸濕熱動物模型中，常選用油脂、白糖、蜂蜜、白酒等作為飲食因素進行造模。而減少食肉在皮膚疾病的飲食管理中也經(jīng)常被提及。《素問·熱論》曰：“食肉則復。”牛羊肉是傳統(tǒng)意義上的發(fā)物，被認為辛甘性溫，動而升浮，多食則能動火生風，與皮膚病有密切的關(guān)系?！侗静菥V目》中記載：“牛肉甘溫……羊肉大熱?！盵11]牛羊肉中富含花生四烯酸，其體內(nèi)代謝產(chǎn)物白三烯是過敏性疾病和炎癥性疾病的重要參與者[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，羊肉煎劑灌胃可明顯加重CD小鼠皮損，增加局部炎癥細胞的浸潤，上調(diào)干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等炎癥因子的水平[13]。

CD包括致敏階段和激發(fā)階段，致敏階段由朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LC）呈遞外來過敏原，激活T淋巴細胞，其中TNF-α是活化LC的關(guān)鍵因素之一[14]。CD動物模型血清中，TNF-α水平明顯升高[15]。在CD早期，TNF-α局部水平增高，促進細胞間黏附分子-1 （intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）的分泌，從而誘導以中性粒細胞為主的炎癥細胞聚集，加重局部炎癥反應[16]。有報道高脂飲食可升高小鼠血清TNF-α水平[17]，且TNF-α可協(xié)同IFN-γ改變腸上皮細胞的形態(tài)，并可影響腸上皮的屏障特性，使腸黏膜的通透性增加，繼而進一步引起腸道的炎癥性改變[18]。本次研究中，牛肉組、羊肉組大鼠血清TNF-α水平明顯上升，提示牛羊肉可能通過上調(diào)血清TNF-α水平加重CD癥狀。

在CD病程中，Treg細胞起到免疫抑制的作用。當再次接觸抗原時，Treg細胞募集至皮膚中，能夠強烈地抑制炎癥反應[14]。IL-35由Treg細胞分泌，是一種具有抗炎作用的細胞因子，其分泌可以進一步反饋促進Treg細胞的分化[19]。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清中IL-35表達水平低于健康對照組，且其表達水平與皮損嚴重程度呈負相關(guān)，提示IL-35作為一種抗炎因子參與皮膚炎癥的發(fā)病過程[20]。唐文靜等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，IL-35的表達水平與炎癥性腸病活動度呈負相關(guān)，提示腸道炎癥反應可能與IL-35表達降低，不能有效發(fā)揮抗炎作用有關(guān)。本研究中，牛肉組大鼠血清IL-35水平明顯下降，提示攝入牛肉加重CD癥狀可能與此有關(guān)。

Notch信號通路包括受體（Notch1～4）、配體（Jagged1、2和Delta-like1、3、4）以及DNA結(jié)合蛋白，Notch1受體能夠直接作用于核因子-κB（nuclear factor-κ B，NF-κB），使T細胞中的NF-κB保留在細胞核中；并能夠與IFN-γ的啟動子形成復合物，從而調(diào)控IFN-γ的表達，增加IFN-γ的分泌。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路能夠抑制Treg細胞的功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1能抑制Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，并降低相關(guān)炎癥抑制因子的表達[23]；激活的Notch1信號也可促進TNF-α的釋放[24]。在CD小鼠中，高表達的Notch1可促進血管內(nèi)皮細胞分泌血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion protein-1，VCAM-1），促進炎癥細胞募集，加重局部炎癥反應[25]。Notch1蛋白表達升高能影響腸道上皮細胞分化方向，促進上皮細胞向吸收型細胞分化，減少向分泌型細胞尤其是杯狀細胞的分化，從而降低腸黏膜屏障的防御功能，導致炎癥反應[26]。本研究結(jié)果提示，牛、羊肉組大鼠消化道組織中Notch1表達上升，說明牛羊肉可能通過上調(diào)Notch1表達，影響消化道黏膜的屏障功能，促進炎癥細胞聚集，導致炎癥反應發(fā)生，從而加重CD的癥狀。

本研究發(fā)現(xiàn)，脫毛膏可誘導大鼠CD模型；牛肉組和羊肉組大鼠皮損表現(xiàn)較胃腸濕熱組及模型對照組更嚴重，病理結(jié)果中表皮、真皮內(nèi)炎癥細胞浸潤較多，提示傳統(tǒng)發(fā)物牛羊肉能加重胃腸濕熱證CD，這可能與消化道中Notch1表達上調(diào)，以及促進血清中TNF-α水平上升、IL-35水平下降有關(guān)。但本研究樣本量較少，因此結(jié)果的局限性和偏倚性難以避免，有待擴大樣本量進一步加以驗證。而Notch1的表達是否與TNF-α和IL-35水平有關(guān)，發(fā)物對CD的影響是否具有時間和劑量關(guān)系，以及脫毛膏長期施用于大鼠皮膚導致CD樣表現(xiàn)的內(nèi)在機制尚需要深入研究。