浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053
近年來(lái),隨著發(fā)病率的不斷上升,肺癌已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1],其中非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)是肺癌常見(jiàn)的病理類(lèi)型,約占肺癌發(fā)生率的85%[2]。近十年來(lái),雖然NSCLC的診斷與治療已經(jīng)取得明顯進(jìn)展[3],但晚期患者預(yù)后仍不佳,轉(zhuǎn)移成為NSCLC患者治療失敗及死亡的主要原因。
中醫(yī)認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移者,多是癌毒稽留而不去,同時(shí)攻伐太過(guò),導(dǎo)致機(jī)體抗邪能力下降[4],正氣虧虛,免疫功能低下,免疫細(xì)胞難以殺滅循環(huán)腫瘤細(xì)胞[5],以致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散。因此,正氣虧虛是腫瘤轉(zhuǎn)移的根本原因[6]。肺癌是一種全身屬虛、局部屬實(shí)的病證。晚期NSCLC患者虛癥尤為明顯,其中脾虛證是最常見(jiàn)證型,嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后[7]?!芭嗤辽稹狈ㄍㄟ^(guò)補(bǔ)脾土生肺金,可明顯提高患者的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期[8]。臨床上,眾多醫(yī)家將培土生金法用于肺癌轉(zhuǎn)移的防治,取得了較滿(mǎn)意的效果[9-12]。黃土湯方源于《金匱要略》,其主要功效為溫陽(yáng)健脾、養(yǎng)血止血,臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),以黃土湯為基礎(chǔ)方治療NSCLC轉(zhuǎn)移具有一定的療效,尤其對(duì)于咳血的患者作用更佳。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證黃土湯抑制NSCLC轉(zhuǎn)移的作用,并初步探討其可能的作用機(jī)制。
1.1 細(xì)胞 人NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9、A549、H125、H647均由浙江省人民醫(yī)院惠贈(zèng)。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(specified pathogen free,SPF)級(jí)雄性SD大鼠5只,6~8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼:SCXK(滬)2012-0002],飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼:SYXK(浙)2013-0184]。
1.3 藥物 黃土湯由甘草12g、干地黃60g、白術(shù)40g、炮附子40g、阿膠48g、黃芩48g、赤石脂240g組成,以上藥物均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診部提供。
1.4 試劑 杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)購(gòu)于杭州賽洛進(jìn)生物科技有限公司(批號(hào):8120130);胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司 (批號(hào):F815FA0001);三抗購(gòu)于源葉生物公司(批號(hào):S20F10G81214);胰蛋白酶購(gòu)于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司(批號(hào):1911150405);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)試劑盒、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T4 DNA Ligase均購(gòu)于日本TaKaRa公司 (批號(hào):RR086B、AA4502-1、AHE4572A、06114KA1);放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液購(gòu)于上海基爾頓生物科技有限公司(批號(hào):BYL40836);四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)購(gòu)于美國(guó)Amresco公司 (批號(hào):00761);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購(gòu)于賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司(批號(hào):EZ2811F153);端錨聚合酶2(tankyrase 2,TNKS2)、β-肌動(dòng)蛋白(beta-actin,β-actin)、腺瘤樣息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)一抗購(gòu)于Abcam公司(批號(hào):ab92329、ab8227、ab32197);IRDye 800羊抗兔二抗和IRDye680羊抗鼠二抗購(gòu)于Licor公司(批號(hào):926-32211、926-68070)。
1.5 儀器 BX51型數(shù)碼生物顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司;Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品;Mini-PROTEAN Tetra電泳系統(tǒng)、Mini Trans-Blot Electrophoretic槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和qPCR儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Licor公司;5541R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。
1.6 方法
1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) H125、H647、A549、PC9均采用含10% FBS的DMEM,于37℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.6.2 qPCR檢測(cè)TNKS2表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30s,1個(gè)循環(huán);95℃變性5s,60℃退火30s,共40個(gè)循環(huán);95℃ 10s,65℃ 60s,97℃ 1s,1個(gè)循環(huán)。采用公式2-ΔΔct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。所有引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成,序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences
1.6.3 TNKS2小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾/過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建包裝及轉(zhuǎn)染 基于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站檢索獲得TNKS2全基因序列,合成TNKS2序列并設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)靶點(diǎn)序列,構(gòu)建TNKS2干擾過(guò)表達(dá)慢病毒,設(shè)計(jì)和構(gòu)建由賽瀾生物技術(shù)(杭州)有限公司完成。將上述病毒感染對(duì)應(yīng)細(xì)胞,獲得穩(wěn)定的NSCLC細(xì)胞株,再分別提取細(xì)胞內(nèi)總RNA、總蛋白,鑒定干擾過(guò)表達(dá)效果。
1.6.4 含藥血清制備 將所有藥材以蒸餾水800mL浸泡30min,煎煮1h,將兩次煎煮所得的藥液混合濃縮,最終濃度為7.8g·mL-1[13],即大鼠灌胃濃度。按照臨床上成人等效劑量帶入換算公式,計(jì)算出大鼠每日最大中藥煎劑灌胃量為10.9g/(kg·d),以該劑量灌胃1周。末次灌胃1h后眼眶取血,室溫靜置4h,3 000r/min離心15min后分離血清,以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,56℃水浴滅活30min,-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.6.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為8組:A549+FBS組、A549+黃土湯含藥血清組、A549 TNKS2+FBS組、A549 TNKS2+黃土湯含藥血清組、H647+FBS組、H647+黃土湯含藥血清組、H647 siRNA+FBS組、H647 siRNA+黃土湯含藥血清組,其中A549+FBS組和H647+FBS組分別與1.6.1細(xì)胞培養(yǎng)中的A549和H647細(xì)胞相同處理。先用含10% FBS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板,將各組細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)6h后待細(xì)胞貼壁,換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜,分別于6孔板內(nèi)進(jìn)行劃痕,PBS清洗2次,去除脫落細(xì)胞,再分別加入含黃土湯含藥血清以及含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),最后在0、24h時(shí)鏡下觀察并拍照。細(xì)胞遷移能力以細(xì)胞遷移率表示,細(xì)胞遷移率 (%)=(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。
1.6.6 Western blot法檢測(cè)TNKS2蛋白和APC蛋白表達(dá)變化 將H647和A549細(xì)胞分為4組:黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組、H647 siRNA干擾組、黃土湯含藥血清+A549過(guò)表達(dá)組、A549過(guò)表達(dá)組,其中H647 siRNA干擾組、A549過(guò)表達(dá)組以FBS培養(yǎng),黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組、黃土湯含藥血清+A549過(guò)表達(dá)組中加入黃土湯含藥血清。各組培養(yǎng)48h后收獲細(xì)胞并提取總蛋白,蛋白定量后電泳并轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉封閉90min,分別加入一抗(TNKS2稀釋比例1:10 000、APC稀釋比例1:5 000),4℃孵育過(guò)夜,含Tween20的Tris緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween20,TBST)漂洗3次,加入IRDye800羊抗兔二抗(稀釋比例1:10 000)和IRDye680羊抗鼠二抗(稀釋比例1:10 000)避光孵育90min。吸去二抗并洗凈后以紅外激光成像系統(tǒng)掃描,以Primer 6.0軟件分析圖像。以β-actin為內(nèi)參,進(jìn)行半定量檢測(cè),計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 細(xì)胞篩選 qPCR結(jié)果提示,H647細(xì)胞TNKS2基因表達(dá)明顯高于A549、H125、PC9細(xì)胞系(P<0.001,P<0.001,P<0.01),而A549、H125細(xì)胞系基因表達(dá)量較低,且兩種細(xì)胞間基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。基于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)的細(xì)胞背景調(diào)查發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞系惡性程度低于H125,因此選擇H647為本底TNKS2基因高表達(dá)細(xì)胞系,A549為本底TNKS2低表達(dá)細(xì)胞系,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖1 各組細(xì)胞TNKS2表達(dá)比較Fig.1 Comparison of TNKS2 expression in each group
2.2 干擾/過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建 通過(guò)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,基于PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)TNKS2全基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建pSLLV-CMV-TNKS2-puro質(zhì)粒。見(jiàn)圖2。通過(guò)TNKS2干擾靶點(diǎn)預(yù)測(cè)合成siRNA序列,構(gòu)建pSLLV-U6-si TNKS2-puro質(zhì)粒。見(jiàn)圖3。通過(guò)感染293T細(xì)胞獲得TNKS2基因過(guò)表達(dá)/干擾慢病毒,病毒滴度檢測(cè)如表2。
表2 病毒滴度值及獲取體積Tab.2 Virus titer value and acquisition volume
圖2 慢病毒載體pSLLV-CMV-puroFig.2 Lentiviral vector pSLLV-CMV-puro
圖3 慢病毒載體pSLLV-U6-puroFig.3 Lentiviral vector pSLLV-U6-puro
2.3 TNKS2過(guò)表達(dá)/干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定 以TNKS2干擾慢病毒轉(zhuǎn)染H647細(xì)胞,構(gòu)建TNKS2穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株;以TNKS2過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,構(gòu)建TNKS2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞株。提取細(xì)胞內(nèi)總RNA和總蛋白,分別通過(guò)qPCR和Western blot進(jìn)行鑒定。鑒定提示,與H647細(xì)胞比較,經(jīng)siRNA-TNKS2干擾后H647細(xì)胞內(nèi)TNKS2基因和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.001,P<0.001),而且設(shè)定的2號(hào)siRNA干擾效果更佳。與A549細(xì)胞比較,經(jīng)TNKS2過(guò)表達(dá)干預(yù)后A549細(xì)胞內(nèi)TNKS2基因和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.001,P<0.001)。見(jiàn)圖4。
圖4 TNKS2過(guò)表達(dá)/干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定Fig.4 Identification of TNKS2 overexpression/interference stable transfection cell
2.4 細(xì)胞遷移能力變化檢測(cè) 黃土湯含藥血清干預(yù)24h后,與A549+FBS組比較A549+黃土湯含藥血清組細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.01);經(jīng)過(guò)TNKS2基因過(guò)表達(dá)干預(yù)后,A549 TNKS2+FBS組細(xì)胞遷移率有所上升(P<0.05),經(jīng)過(guò)TNKS2基因過(guò)表達(dá)和黃土湯含藥血清聯(lián)合干預(yù)后,細(xì)胞遷移率與A549 TNKS2+FBS組比較明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。黃土湯含藥血清干預(yù)24h后,與H647+FBS組比較,H647+黃土湯含藥血清組細(xì)胞遷移率明顯降低(P<0.001);經(jīng)過(guò)TNKS2干擾后,H647 siRNA+FBS組細(xì)胞遷移率同樣降低(P<0.01);同時(shí)經(jīng)過(guò)TNKS2干擾和黃土湯含藥血清干預(yù),H647 siRNA+黃土湯含藥血清組細(xì)胞遷移率與H647 siRNA+FBS細(xì)胞組比較,進(jìn)一步降低(P<0.001)。見(jiàn)圖6。
圖5 A549細(xì)胞遷移能力變化(40×)Fig.5 Changes of cell migration ability of A549 cell(40×)
圖6 H647細(xì)胞遷移能力變化(40×)Fig.6 Changes of cell migration ability of H647 cell(40×)
2.5 各組細(xì)胞TNKS2蛋白及APC蛋白表達(dá)比較 Western blot檢測(cè)提示,黃土湯含藥血清+H647 siRNA干擾組和H647 siRNA干擾組比較,兩組TNKS2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但前者APC蛋白表達(dá)明顯高于H647 siRNA干擾組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃土湯含藥血清+A549過(guò)表達(dá)組和A549過(guò)表達(dá)組比較,前者TNKS2蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但兩組APC蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖7。
圖7 各組細(xì)胞TNKS2蛋白及APC蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparison of TNKS2 protein and APC protein expression in each group
腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC患者病情惡化、死亡的主要原因。中醫(yī)認(rèn)為,正氣不足、肺脾氣虛是肺癌發(fā)生發(fā)展甚至擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的重要病機(jī)[14]。根據(jù)這一病機(jī),通過(guò)“培土生金”法健脾補(bǔ)肺已成為防治肺癌轉(zhuǎn)移的重要方法之一[15]。本研究結(jié)果顯示,基于培土生金理論的經(jīng)方黃土湯,能夠有效抑制NSCLC細(xì)胞的遷移能力,干預(yù)惡性化程度不同的NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)程,說(shuō)明黃土湯對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移具有抑制作用。黃土湯立足于溫中健脾,方中以灶心黃土(現(xiàn)用赤石脂)為君,溫中止血;以白術(shù)、附子為臣,君臣相伍,溫脾陽(yáng)、補(bǔ)中氣;佐以黃芩、生地、阿膠,清熱滋陰養(yǎng)血,并遏制術(shù)、附辛溫耗血之弊;最后以甘草調(diào)藥和中為使。諸藥配合,寒熱并用,標(biāo)本兼治,剛?cè)嵯酀?jì),溫中健脾益肺。正如《石室秘錄》所云:“治肺之法,正治甚難,當(dāng)轉(zhuǎn)治以脾,脾氣有養(yǎng),則土自生金?!盵16]本研究結(jié)果在體外實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證了黃土湯乃至培土生金法對(duì)肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響。
研究發(fā)現(xiàn),TNKS2在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高[17]。A549、H125、PC9及H647這4種NSCLC細(xì)胞系的惡性程度依次增加,本研究發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞中TNKS2的表達(dá)也相應(yīng)增加,說(shuō)明TNKS2基因表達(dá)與NSCLC的惡性程度呈正相關(guān)。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示,惡性程度高的H647細(xì)胞遷移能力高于A549細(xì)胞。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),A549經(jīng)過(guò)TNKS2基因過(guò)表達(dá)干預(yù)后,細(xì)胞遷移能力有所上升;而H647經(jīng)過(guò)TNKS2干擾后,其遷移能力受到一定程度的抑制,表明TNKS2表達(dá)與NSCLC細(xì)胞遷移能力成正相關(guān)。經(jīng)黃土湯含藥血清干預(yù)后,A549、H647兩種細(xì)胞的遷移能力均下降,經(jīng)TNKS2基因過(guò)表達(dá)干預(yù)后的A549細(xì)胞和經(jīng)TNKS2干擾后的H647細(xì)胞遷移能力亦下降,提示黃土湯對(duì)不同惡性程度NSCLC細(xì)胞遷移均有抑制作用。
有研究表明,TNKS2和Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白APC、Axin以及β-catenin結(jié)合形成相應(yīng)的復(fù)合物,從而影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-21]。APC是一種抑癌基因,其作用是增強(qiáng)降解復(fù)合體與β-catenin的親和力[22],通過(guò)參與Wnt信號(hào)通路,影響細(xì)胞的增殖與分化,是Wnt通路中的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[23]。簡(jiǎn)而言之,TNKS2高表達(dá)與肺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān),而APC表達(dá)升高則能抑制肺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程。本研究中的Western blot結(jié)果提示,黃土湯能抑制經(jīng)TNKS2基因過(guò)表達(dá)干預(yù)的A549細(xì)胞中TNKS2表達(dá),能誘導(dǎo)經(jīng)TNKS2基因干擾的H647細(xì)胞中APC表達(dá)升高,表明黃土湯對(duì)惡性程度不同的肺癌細(xì)胞均有干預(yù)作用,雖然其作用目標(biāo)蛋白不同,但均與激活或抑制Wnt信號(hào)通路相關(guān)。因此,筆者推測(cè)黃土湯影響NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制與抑制細(xì)胞內(nèi)TNKS2表達(dá)或促進(jìn)抑癌蛋白APC表達(dá)有關(guān)。具體而言,惡性化程度低的NSCLC,其TNKS2表達(dá)低,黃土湯可能通過(guò)上調(diào)抑癌蛋白APC而起效;惡性化程度高的NSCLC,其TNKS2表達(dá)高,黃土湯則通過(guò)直接抑制TNKS2表達(dá)而起效。進(jìn)一步推測(cè),黃土湯可能毒副作用較低,在發(fā)揮良好治療效果的同時(shí),對(duì)患者機(jī)體正常細(xì)胞的殺傷力較弱。
綜上所述,培土生金法對(duì)惡性程度不同的NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移均有抑制作用,可通過(guò)下調(diào)TNKS2表達(dá)或通過(guò)誘導(dǎo)抑癌蛋白APC表達(dá),從而干預(yù)與癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的Wnt信號(hào)通路。但Wnt通路尚有多個(gè)調(diào)節(jié)蛋白參與,后續(xù)將鎖定其他相關(guān)目標(biāo)蛋白進(jìn)行研究,以精準(zhǔn)化研究培土生金法干預(yù)NSCLC的療效靶點(diǎn)。