HPLC法同時(shí)測定草蓯蓉中草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B

陳 民 田夢飛 馮昌寅 孟憲明 羅 猛 牟璠松*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 海南熱帶海洋學(xué)院生態(tài)環(huán)境學(xué)院，三亞 572022）

草蓯蓉（Boschniakia rossica（Cham.et Schlecht.）Fedtsch）是一種寄生植物，生長在榿木的根上。草蓯蓉也稱為“不老草”，分布于中國，印度，日本，韓國和俄羅斯［1～2］。在亞洲，草蓯蓉的干燥全草被用作傳統(tǒng)中藥，作為補(bǔ)腎藥，用于增強(qiáng)腎功能和改善勃起功能障礙［3］。

草蓯蓉中含有苯丙素苷、環(huán)烯醚萜苷、單萜、三萜、生物堿和甾醇等多種成分［4～6］。其中草蓯蓉的環(huán)烯醚萜苷主要成分為草蓯蓉納拉苷，草蓯蓉的苯丙素苷主要成分為草蓯蓉苷B。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，草蓯蓉全草及其有效部位提取物如環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷類、多糖等具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤（肺癌、肝癌）、抗氧化（抑制肝勻漿和肝線粒體體脂質(zhì)過氧化）、清除自由基及抗衰老、減輕肝臟損傷、益智作用（減少腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡）和抗炎作用等［7～13］。

雖然之前已有文獻(xiàn)對(duì)草蓯蓉指紋圖譜進(jìn)行了繪制，但都沒有對(duì)特征峰進(jìn)行鑒定和含量測定［14～16］。本研究采用高效液相色譜梯度洗脫方法，可對(duì)兩種主要成分進(jìn)行定量分析，檢測方法快速、高效、簡便，結(jié)果重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

草蓯蓉（哈爾濱當(dāng)?shù)厮幉氖袌鲑徺I）置于60℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，粉碎，過60 目篩備用。草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷對(duì)照品（云南西力生物公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

美國Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀；電子分析天平（北京賽多利斯天平）；高速多功能粉碎機(jī)（CS-2000，武義海納電器有限公司）；超聲波清洗器（潔盟JP-040S）；微孔濾膜（針式過濾器0.45 μm 有機(jī)系，Lab Instrument Co.，Ltd.）。

1.3 草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B測定方法

色譜柱：Klimail 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件：0～12 min，15%A；12～30 min，15%～20%A；30～40 min，20%～25%A；40～45min，25%～30% A；45～60 min，30%～100%A，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：260 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 溶液制備

1.4.1 供試品溶液的配置

稱取干燥草蓯蓉全草適量，粉碎，過60 目篩，精密稱取1 g 粉末，將其置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇溶液10 mL，密塞稱重，超聲處理0.5 h后，等待其冷卻至室溫后，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足缺少的重量，搖勻，提取物離心，濾過，再用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，作為樣品溶液，待用，測定時(shí)取20 μL進(jìn)樣。

1.4.2 對(duì)照品溶液的配置

精密稱取草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇定容至刻度線，將其搖勻，配置成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取1.4.2 對(duì)照品溶液適量，梯度稀釋成6種不同濃度的對(duì)照品溶液。按照1.3的色譜條件測定草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 組分的峰面積，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各自的回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。

1.5.2 專屬性試驗(yàn)

將配制好的草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 對(duì)照品混合溶液和供試品溶液各取20 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，每份樣品測3次。

1.5.3 精密度試驗(yàn)

精密量取草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 對(duì)照品溶液，按照1.3 色譜條件重復(fù)測定6 次。計(jì)算6 次進(jìn)樣峰面積的RSD值，考察儀器的精密度。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液，按照1.3 色譜條件重復(fù)測定6次。計(jì)算6次進(jìn)樣峰面積的RSD 值，考察方法精密度。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h并按1.3方法進(jìn)行測定8次。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣峰面積的RSD 值，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.5.6 檢出限與定量限

精密量取對(duì)照品適量，以1.4.2 方法配置對(duì)照品溶液，逐步稀釋，按S/N=10 計(jì)算定量限，按S/N=3計(jì)算檢測限。

1.5.7 回收率試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品9 份，分別精密加入1.4.2 的對(duì)照品溶液1.0、1.5 和2.0 mL，使其相當(dāng)于含量為80%、100%和120%的樣品。每個(gè)濃度3 份樣品，按1.3 色譜條件測定峰面積，由回歸方程計(jì)算供試品中草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

為了驗(yàn)證新建立的高效液相方法是否符合草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 的常規(guī)分析，對(duì)草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1。結(jié)果表明，草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 的相關(guān)系數(shù)（R2）在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 各測定成分標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 1 Standard curve data for each component

2.2 專屬性試驗(yàn)

結(jié)果如圖1所示，兩種混合對(duì)照品溶液的出峰時(shí)間與供試品溶液中兩種物質(zhì)的出峰時(shí)間幾乎一致。

2.3 精密度試驗(yàn)

表2 中草蓯蓉納拉苷的RSD=0.57%，草蓯蓉苷B的RSD=0.73%。這表明該方法正確合理。

表2 各測定成分精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental results of the precision of each component（n=6）

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

草蓯蓉納拉苷的RSD=0.29%，草蓯蓉苷B 的RSD=0.75%（見表3）。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 各測定成分重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability and stability test results of each component

2.6 檢出限和定量限

經(jīng)計(jì)算，草蓯蓉納拉苷檢出限為4.687 5 μg·mL-1，草蓯蓉苷B 檢出限為3.433 7 μg·mL-1。按信噪比10∶1 測得：草蓯蓉納拉苷定量限為14.205 1 μg·mL-1，草蓯蓉苷B 定量限為10.405 4 μg·mL-1。這表明，此分析方法具有較好的靈敏度。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

通過測定3 種不同濃度的對(duì)照品溶液對(duì)回收率進(jìn)行分析。草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 平均回收率分別為97.86%、96.55%，RSD 分別為1.01%、1.23%（n=9），結(jié)果見表4～5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示回收率良好。

表4 草蓯蓉納拉苷回收率測定結(jié)果Table 4 Result of recovery of baschnaloside（n=9）

表5 草蓯蓉苷B回收率測定結(jié)果Table 5 Result of recovery of rossicaside B（n=9）

3 結(jié)論

草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 是草蓯蓉主要活性成分，具有抗肝損傷、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗疲勞等多種生物活性。

本研究利用高效液相色譜法建立了同時(shí)測定草蓯蓉中草蓯蓉納拉苷和草蓯蓉苷B 兩種組分的方法。方法學(xué)的驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為草蓯蓉的進(jìn)一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。