野生玫瑰果實發(fā)育過程中種子的細胞組織結構和內(nèi)源激素變化對其休眠性的影響

王思涵 楊 濤 張金柱 董 婕 寇志玲 車代弟

（東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱 150030）

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）的落葉灌木，品種繁多，香氣馥郁，是園林綠化和水土保持的優(yōu)良植物材料［1］。玫瑰花果碩大飽滿，顏色鮮艷且產(chǎn)量高［2］，是重要的觀花和觀果花卉，具有很高的觀賞價值。玫瑰抗寒、抗病、耐干旱瘠薄，作為重要的防風固沙植物棲息在濱海沿岸，不僅是薔薇屬花卉栽培繁育的重要種質(zhì)資源，還對于保持生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定具有重大作用［3］。20 世紀80 年代，由于資源過度的開發(fā)利用以及其本身種子品質(zhì)差及后熟的特性，野生玫瑰在中國的分布區(qū)逐漸縮小甚至出現(xiàn)了片斷化現(xiàn)象。1992 年，野生玫瑰作為國家二級保護植物被編入進《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物（第一冊）》中［4］。

吉林琿春分布區(qū)是國內(nèi)目前唯一野生玫瑰天然群落保存尚好的區(qū)域，其自然繁育以無性繁殖為主，種子萌發(fā)率低，傳播力弱。Anderson 研究指出野生玫瑰的成熟種胚被木質(zhì)堅硬的果皮包裹并保護［5］，其果皮的硬度和厚度是阻礙玫瑰種子發(fā)芽的主要障礙之一［6］。2015 年De Vries 研究發(fā)現(xiàn)薔薇屬植物成熟瘦果的果皮成熟初期含有高濃度的脫落酸，也阻止種子的直接萌發(fā)，致使新收獲的玫瑰種子便具有深度休眠的特性，嚴重制約著玫瑰資源的保護與利用［7］。然而，種子的休眠特性與果實的成熟過程密不可分［8］。Dubois［7］認為果實成熟過程中顏色的變化可能指示種子休眠的深度。曾有育種者建議在玫瑰果實著色前提取瘦果，可以促進早期發(fā)芽，并且認為果實成熟的最后30 d種子才具有休眠狀態(tài)，然而這一系列猜想尚未有研究數(shù)據(jù)及成果支持。因此，本研究通過對野生玫瑰果實成熟過程中種子生長發(fā)育情況及種子內(nèi)源激素含量變化的掌握，探究果實發(fā)育過程中種子休眠性的變化，對野生玫瑰資源的保護利用及玫瑰的生產(chǎn)栽培管理具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為吉林省琿春市自然群落中的野生玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）。從2019 年7 月開始，從玫瑰開花當天開始掛牌，于花后每隔1～3 d，隨機取生長勢相近的玫瑰果實3～5 個，裝于冰盒內(nèi)帶回實驗室進行測定，直至果實成熟時結束。果實成熟標志為：果實完全著為均勻的紅色，成扁圓形且富有光澤。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生玫瑰果實及種子生長時期的確定

隨機選取3～5 個發(fā)育狀態(tài)良好、大小相近的玫瑰果實進行形態(tài)學觀察并拍照。每次取樣后用游標卡尺對果實的縱徑、橫徑進行測量。剝開果實取出100粒種子，使用游標卡尺測量種子的最大長度、寬度，用千分之一天平測量種子的千粒重，3次重復。

1.2.2 種子發(fā)育的胚胎學觀察

參照高營營的石蠟切片制作方法［9］，種子采收后迅速放入FAA 固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛=90∶5∶5）中固定，以梯度乙醇溶液（70%，85%，95%）脫水后浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊切成蠟帶置于載玻片上，并在37℃烘片機上展片。切片干燥脫蠟后，經(jīng)番紅與固綠染色，最后利用中性樹膠封片固定。制成的切片置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 野生玫瑰果實發(fā)育過程中內(nèi)果皮硬化觀察

玫瑰內(nèi)果皮質(zhì)地較硬，木質(zhì)化程度較高，通過間苯三酚法對木質(zhì)素染色，可以直觀地反映其內(nèi)果皮硬化的程度。本試驗選取玫瑰果實發(fā)育過程中的3 個時間點：花后24 d（青果期種胚發(fā)育完全）、花后50 d（轉(zhuǎn)色期）、花后75 d（紅果期）果實和種子進行染色，染色方法參照韓國粉的制作方法［10］，染色反應結束后將種子取出觀察并拍照記錄。

1.2.4 種子內(nèi)源激素含量變化測定

試驗材料選取不同發(fā)育時期的玫瑰果實，剝開后稱取質(zhì)量為0.3 g的玫瑰鮮種子置于液氮中保存，3次重復。GA3，IAA和ABA的提取及含量測定參考謝瑩（2014年）的方法［11］。

色譜條件：色譜柱采用Symmetry?C18 色譜柱，流動相為甲醇∶乙腈∶0.7%冰乙酸溶液=50∶5∶45 v/v/v，柱溫：25℃，流速：0.8 mL·min-1，紫外檢測波長：260 nm，進樣量：20 μL。采取外標工作曲線法定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗測得數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，并用Graphpad Primer 軟件獲得相關的折線圖或柱狀圖，應用SPSS 20對數(shù)據(jù)進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期果實及種子質(zhì)量的變化

玫瑰的開花期為每年的7～9 月底，果期為8～10月。玫瑰開花后，受精的子房逐漸發(fā)育成瘦果，胚珠發(fā)育成種子。根據(jù)玫瑰果實發(fā)育不同時期的質(zhì)量指標變化（見圖1A），可以看出，果實的生長過程可劃分為3 個時期，分別為青果期、轉(zhuǎn)色期和紅果期，其中青果期（1～35 d）也為果實的第Ⅰ速長期，其直徑和橫徑的增長較快，凈增長量占成熟時的53.88%和53.82%，此時果實成圓形，顏色為青綠色，果形指數(shù)為0.916±0.113；轉(zhuǎn)色期（35～60 d），也為果實的緩慢生長期，由于內(nèi)果皮的木質(zhì)化，玫瑰果實的直徑和橫徑增長緩慢，果實顏色由青綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t色；紅果期（60～75 d），即第Ⅱ快速生長期，由于果實細胞的迅速膨大和后期營養(yǎng)物質(zhì)的積累，果實的直徑和橫徑增長速度變快，果實橫徑大于縱徑，果實呈扁球形，果形指數(shù)為0.771±0.052。果實發(fā)育成熟后顏色也轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t色。

不同發(fā)育階段的果實內(nèi)種子的大小及千粒重變化也有很大的不同。如圖1B～C 所示，在青果期（1～24 d）種子千粒重迅速增加，此時種子橫徑與直徑也不斷增長，說明種子發(fā)育較快，不斷膨大并富含水分。種子千粒重在24 d 達到頂峰，但種子體積還在不斷變大，說明24 d 時內(nèi)果皮開始木質(zhì)化逐漸失去水分，但種子內(nèi)含物還在積累，體積還在膨脹。在果實轉(zhuǎn)色期和紅果期種子橫縱徑不斷減小，千粒重也隨著果實的發(fā)育不斷變輕，伴隨著內(nèi)果皮木質(zhì)化的完成最終于75 d 時種子形態(tài)基本不再發(fā)生改變。

2.2 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期果實與種子外部形態(tài)及胚胎發(fā)育的變化

如圖2可知，種子的胚胎發(fā)育是在青果期完成的。花后1 d 即形成合子，此時種子為透明的黃色。花后3 d，內(nèi)果皮顏色變?yōu)榘胪该鞯狞S色，富含水分，此時合子開始啟動分裂，形成多細胞原胚?；ê? d，種子體積持續(xù)增長，多細胞原胚持續(xù)分裂形成球形胚?；ê?2 d 時球形胚持續(xù)分裂，逐漸形成突起，當球形胚體積增大和原表皮明顯出現(xiàn)后，周圍區(qū)的細胞分裂更加活躍，細胞分裂分布的變化預示著心形胚將開始?；ê?5 d，種子顏色變?yōu)椴煌该鞯狞S色，體積不斷增大。球形胚在頂端形成兩個突起的子葉原基，形成心形胚。心形胚發(fā)育時期，子葉將形成的區(qū)域細胞分裂增多，由于細胞分裂的不一致性和細胞的擴大，胚在下胚軸區(qū)域會開始伸張而形成魚雷形?；ê?4 d，種子體積持續(xù)增大，質(zhì)地變硬，此時種胚已發(fā)育成完整的子葉胚。由于內(nèi)果皮木質(zhì)素的沉積，此時已難以形成完整切片?；ê?0～75 d，內(nèi)果皮開始變不透明黃色，最終硬化變成黃色的成熟種子。

2.3 野生玫瑰果實不同發(fā)育時期內(nèi)果皮發(fā)育及木質(zhì)素沉積的變化

2.3.1 不同發(fā)育時期內(nèi)果皮細胞結構變化

玫瑰花后第6 天的果實內(nèi)果皮由7～9 層厚壁細胞組成，細胞小而密集且排列緊密，無明顯的胞間隙，與中果皮界線明顯（見圖3A～B）。果實發(fā)育到第15 天時內(nèi)果皮細胞分裂分化迅速，數(shù)目不斷增多，大部分細胞呈現(xiàn)扁平狀，縱向延長。外側(cè)1～2層細胞呈方形緊密排列，內(nèi)側(cè)細胞均呈扁平狀緊密排列（見圖3C～D）。果實發(fā)育成熟后，內(nèi)果皮細胞細胞壁逐漸加厚，木質(zhì)化嚴重。最外側(cè)的1～2層細胞開始增厚，形成了木質(zhì)化的石細胞層，逐漸形成堅硬的種殼，石細胞層以內(nèi)的內(nèi)果皮細胞排列非常致密，幾乎無法用石蠟切片法進行切片觀察（見圖3F）。

2.3.2 不同發(fā)育時期內(nèi)果皮木質(zhì)素沉積情況

圖4 顯示出了不同發(fā)育時期玫瑰果實和種子染色后體視顯微鏡下觀察的外觀特點。青果期時，果實內(nèi)導管組織含有一定木質(zhì)素，但此時內(nèi)果皮只發(fā)生了輕微染色，說明此時內(nèi)果皮中只有少量的木質(zhì)素沉積。果實轉(zhuǎn)色期時，肉眼已可看到內(nèi)果皮木質(zhì)化，且染色部位明顯擴大，染色程度加深。果實成熟期，內(nèi)果皮已完全被染成深紅色，染色范圍進一步擴大。

2.4 野生玫瑰果實發(fā)育過程中種子內(nèi)源激素含量的變化

2.4.1 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源ABA 的含量變化

如圖5A 所示，種子內(nèi)源ABA 含量隨著果實的發(fā)育呈下降趨勢。種子內(nèi)源ABA含量在青果期時最高，達到196.85 μg·g-1。到轉(zhuǎn)色期則有一個明顯的下降，降幅達62.76%。轉(zhuǎn)色期和紅果期果實內(nèi)種子ABA含量基本持平。

2.4.2 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源GA3含量變化

種子內(nèi)源GA3特征是含量高，變化大，整體呈下降趨勢（如圖5B）。青果期時種子快速發(fā)育，此時赤霉素含量最高，為10 522.9 μg·g-1。到了轉(zhuǎn)色期，赤霉素含量稍有下降。轉(zhuǎn)色期到紅果期種子內(nèi)源赤霉素含量急速下降，由9 364.03 μg·g-1下降為2 878.47 μg·g-1，降幅為69.26%。玫瑰種子發(fā)育過程中GA3含量的高峰出現(xiàn)在青果期，即種胚發(fā)育成熟期。說明GA3和種胚的生長存在密切的相關現(xiàn)象。

2.4.3 玫瑰果實發(fā)育期種子內(nèi)源IAA含量變化

種子內(nèi)源IAA 含量隨著果實的發(fā)育呈先上升后下降的趨勢。青果期時種子內(nèi)源IAA 含量較其他激素處于較低的水平，后隨著果實的發(fā)育整體呈現(xiàn)上升的變化趨勢。青果期至轉(zhuǎn)色期時，種子內(nèi)源IAA 含量變化幅度較大，由5.567 μg·g-1迅速升至32.879 μg·g-1，增幅高達83.07%。轉(zhuǎn)色期到紅果期IAA含量又下降至20.457 μg·g-1。

3 討論

3.1 野生玫瑰果實發(fā)育和種子發(fā)育的相關性

果實是種子在母株上的載體，種子會隨著果實的發(fā)育逐漸進行胚分化及胚乳和種皮的形成，因此種子的形態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)的積累及內(nèi)源激素的調(diào)控都與果實的發(fā)育存在聯(lián)系和相互作用［12］。劉平［2］對8 個玫瑰品種的果實生長動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，野生類型果實橫徑生長中有兩個生長較快時期，縱徑增長趨勢大體一致。本試驗將果實的生長發(fā)育期分為青果期（1～35 d）、轉(zhuǎn)色期（35～60 d）、紅果期（60～75 d）三個時期，生長速度呈現(xiàn)“快—慢—快”的變化趨勢。青果期時種子含水量最高，外觀形態(tài)不斷膨大，重量迅速提升。轉(zhuǎn)色期果實內(nèi)果皮木質(zhì)化脫水，種子外表面顏色加深，種子體積變小，千粒重開始變輕。紅果期種子形態(tài)已基本保持穩(wěn)定。研究結果與油茶果實及種子的生長動態(tài)相類似［13］。

有研究認為玫瑰中花粉管到達子房所需的時間估計在授粉后12～24 h，且發(fā)育速度快［14］。2017年付長麗［15］通過內(nèi)源激素含量證明牟平玫瑰種胚在授粉60 d 已經(jīng)發(fā)育成熟，但該結果未結合胚胎學觀察，因此范圍較廣，不能確定最初成熟的時間。本試驗結合石蠟切片技術觀察到玫瑰花后1 d形成合子，花后3 d 發(fā)育為多細胞原胚，花后24 d玫瑰種胚發(fā)育完全，結果與Luca Pipino 認為多花玫瑰種胚30 d 發(fā)育完全的試驗結果相類似［8］。本試驗結果證明了野生玫瑰種子在果實的青果期便已發(fā)育完全，具有完整的胚結構，即野生玫瑰種子不存在形態(tài)休眠。

3.2 野生玫瑰種子組織結構發(fā)育對其休眠性形成的影響

內(nèi)果皮具有重要的作用價值，它對種胚起到天然的保護作用［16］。內(nèi)果皮細胞的發(fā)育是一個逐漸木質(zhì)化的過程［17～18］，然而木質(zhì)化嚴重的內(nèi)果皮會制約玫瑰種子的繁殖能力，有性繁殖能力差成為野生玫瑰資源衰減的重要原因之一。研究結果證明，內(nèi)果皮開始硬化的時間為24 d，此時種胚已發(fā)育完全，內(nèi)果皮細胞壁逐漸加厚并失水皺縮，種子千粒重開始下降，間苯三酚染色觀察到此時已有少量木質(zhì)素沉積。果實轉(zhuǎn)色期（35～60 d）時，種子質(zhì)量變小，內(nèi)果皮木質(zhì)化程度持續(xù)加深。到了紅果期（60～75 d）時內(nèi)果皮基本已完全木質(zhì)化，種子外觀形成了一層厚重的“殼”，結構致密難以剝離，此時內(nèi)果皮對種子的萌發(fā)起到了嚴重的阻礙作用，種子已進入機械休眠［19］。

3.3 野生玫瑰果實發(fā)育中種子內(nèi)源激素的變化對其休眠性形成的影響

張妮妮認為不同的果實成熟度對玫瑰種子萌發(fā)影響較大［20］。而果實的成熟與激素含量變化有關，其生長依賴于發(fā)育正常的種子，種子又是激素合成的主要場所［21］。通常，種子內(nèi)產(chǎn)生植物激素向外擴散，刺激周圍組織生長，并調(diào)控著果實的發(fā)育周期［22］。2020 年高美玲［23］研究發(fā)現(xiàn)高濃度的ABA 在西瓜種子生長過程中起到促進發(fā)育的作用。本試驗中，ABA 對種子的調(diào)控高峰在果實的青果期，此時果實發(fā)育迅速，生長力旺盛，ABA 的濃度最高，這也與樊衛(wèi)國［24］發(fā)現(xiàn)在刺梨種子發(fā)育前期，高濃度的ABA 與促進代謝和細胞分裂有關的結論一致。種子內(nèi)源ABA含量與果實顏色轉(zhuǎn)化密切相關［25］。研究認為，果實轉(zhuǎn)色期前內(nèi)源ABA含量較高，進入轉(zhuǎn)色期后，為了利于果肉內(nèi)番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累，ABA 含量迅速下降［26］。本試驗也得到了相似的實驗結果，即果實轉(zhuǎn)色期種子內(nèi)源ABA 含量降低，降幅高達62.76%。種子內(nèi)高濃度的脫落酸含量似乎是玫瑰種子生理休眠的主要原因。

果實成熟前種子內(nèi)赤霉素含量的上升與胚發(fā)育相關［27］。付長麗［15］研究發(fā)現(xiàn)授粉30 d 后的玫瑰種胚中的GA3含量隨著發(fā)育時間逐漸降低。本研究結果與其相一致，并觀察了種胚形成期的赤霉素濃度。在本研究中，青果期（1～35 d）果實內(nèi)種胚正處于發(fā)育時期，細胞不斷分裂分化形成成熟胚，此時種子內(nèi)源GA3含量最高，隨著果實生長速度變緩，種子發(fā)育完全成熟，進入轉(zhuǎn)色期和紅果期GA3合成能力下降，含量減少。

種子內(nèi)IAA 含量在果實青果期到轉(zhuǎn)色期有顯著變化，此時正是內(nèi)果皮逐漸木質(zhì)化的過程，而木質(zhì)素的沉積與激素含量之間具有密切的關系［28～29］。Biale 研究認為果實的成熟與IAA 密不可分，一些果實內(nèi)源IAA 必須先經(jīng)氧化，使其濃度降低后果實才能完熟［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，青果期到轉(zhuǎn)色期時種子內(nèi)源IAA 含量增加。轉(zhuǎn)色期到紅果期，種子中IAA 含量又開始降低直至果實完全成熟。由此推斷內(nèi)果皮發(fā)育及果實的成熟與生長素間存在一定的關系，而生長素是如何調(diào)控或影響其發(fā)育過程的，目前還沒有直接的試驗證據(jù)，需要進一步深入的研究。

本文通過形態(tài)學、組織細胞學觀察及高效液相色譜技術對果實發(fā)育期種子休眠性的形成及變化進行了評價，并結合試驗數(shù)據(jù)得出結論：玫瑰果實發(fā)育過程中種胚發(fā)育完全，種子不具有形態(tài)休眠。種胚發(fā)育完全后內(nèi)果皮形成木質(zhì)素逐漸木質(zhì)化，使得種胚受到機械束縛產(chǎn)生種殼休眠。果實發(fā)育過程中種子體內(nèi)高濃度的ABA含量使得種子尚未脫離果實時便已進入了生理休眠狀態(tài)。證明了尚未脫離果實的玫瑰種子具有生理休眠和種殼休眠兩種復雜的休眠性狀，這為日后深入探索玫瑰種子發(fā)育及休眠的分子調(diào)控機理提供數(shù)據(jù)信息。