膠東地區(qū)設施栽培奧尼爾和米斯蒂藍莓花色苷代謝研究

劉笑宏，張麗麗，王春燕，慈志娟，于海軍，李公存，顧亮，趙玲玲

(1.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 煙臺 265500；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究所，山東 濟南 250000；3.海陽市果業(yè)發(fā)展服務中心，山東 海陽 265100)

藍莓是我國主要生態(tài)經(jīng)濟林漿果，營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，風味獨特，被評為“人類五大健康食品之一”[1]，列入世界第3代水果行列[2]?；ㄉ帐撬{莓重要的品質(zhì)性狀，其生物合成受內(nèi)部因素(合成途徑關鍵酶活性及相關基因表達量等)和外界環(huán)境因子(溫度、空氣濕度、光照等)的共同影響[3－5]。研究表明，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)是花色苷合成過程的起始酶，起限速作用；查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)可催化生成柚皮素查爾酮；查耳酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)可顯著提高花色苷合成速率；黃烷酮3－羥化酶(flavanone 3－h(huán)ydroxylase，F(xiàn)3H)是花色苷合成途徑的中樞酶；二氫黃酮醇4－還原酶(dihydroflavonol 4－reductase，DFR)對花色苷積累起限制因素；花色素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)是花色苷合成和原花青素合成樞紐的關鍵酶，決定花色苷合成途徑的走向；類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP－glucoseflavonoid 3－O－glucosyltransferase，UFGT)是花色苷合成的最終作用酶；糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GLH)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)對花色苷的分解氧化起重要作用[6－10]?；蚴菦Q定酶活性的關鍵因素，環(huán)境因素則通過影響酶活性影響花色苷的最終合成。環(huán)境因素中，光照是花色苷合成的重要前提[11，12]，適量光照可有效提高花色苷的合成量，而強光則會降低花色苷的含量[13]；溫度是影響花色苷代謝的第二因素[14，15]，高溫能降解花色苷[16，17]，低溫則抑制花色苷的合成[18]；空氣濕度對花色苷的積累同樣重要，較高的空氣相對濕度可降低蒸騰速率、提高光合產(chǎn)物積累，從而為花色苷代謝提供充足的合成底物[19，20]。

膠東半島氣候溫暖濕潤，是我國重要的藍莓生產(chǎn)區(qū)[21]，傳統(tǒng)以栽植北高叢藍莓為主。近年來，南高叢藍莓由于品質(zhì)優(yōu)、適應性強、豐產(chǎn)性高等特點，被大規(guī)模引種，但因花期較早，易受霜凍危害，在膠東地區(qū)較為適合設施栽培。奧尼爾和米斯蒂均為引入的優(yōu)良南高叢藍莓品種，奧尼爾果個大、香氣濃郁，米斯蒂有特殊香氣，均深受消費者喜愛，表現(xiàn)出較高的商品價值。但引種后生長環(huán)境的改變?nèi)菀讓е滤{莓果實中營養(yǎng)物質(zhì)成分及含量變化，從而對其品質(zhì)造成一定影響?；ㄉ兆鳛樗{莓的主要活性物質(zhì)，其含量改變明顯影響藍莓果實品質(zhì)，因此，了解生長環(huán)境條件對花色苷積累和代謝的影響對于改善藍莓品質(zhì)具有重要意義。

本試驗以膠東地區(qū)設施栽培的奧尼爾和米斯蒂兩個品種藍莓為研究對象，分析轉(zhuǎn)色期各階段花色苷積累及代謝途徑相關酶基因表達的情況，并探究設施環(huán)境因子對花色苷積累的影響，以期為藍莓花色苷代謝研究及生產(chǎn)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2021年在山東省煙臺市福山區(qū)藍莓生產(chǎn)基地進行。福山區(qū)位于膠東半島北部，屬暖溫帶東亞季風區(qū)大陸性氣候，夏季溫暖濕潤，冬季寒冷干燥，年平均降水729.2 mm，平均氣溫11.8℃，平均日照2672.2 h，空氣相對濕度65%，適合藍莓生長發(fā)育。

1.2 試驗材料

供試藍莓品種為奧尼爾和米斯蒂，均于2017年定植于東西向暖棚內(nèi)，供試品種南北向種植，株距0.8 m，行距1.8 m，栽培管理措施一致。每個小區(qū)由4個種植行組成，按種植行從東到西、植株從南到北的次序，每一種植行順次選擇5株藍莓(即第一行的5株在種植行的南邊、第二行5株接著第一行的次序向北數(shù)、第三行和第四行順次進行)，共計20株設置為一小區(qū)，重復3次，總計60株。

1.3 試驗方法

1.3.1 環(huán)境因子測定 于果實轉(zhuǎn)色前每小區(qū)中間部位放置兩個溫濕度及光照記錄儀，懸掛于植株中部外測5～10 cm處，待果實總體轉(zhuǎn)色完成后取下記錄儀，數(shù)據(jù)用于設施環(huán)境因子分析。

1.3.2 藍莓果實樣品采集 根據(jù)試驗區(qū)內(nèi)藍莓果實總體轉(zhuǎn)色情況，分別于轉(zhuǎn)色初期、花盤轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色中期、轉(zhuǎn)色后期、轉(zhuǎn)色完成期采摘果實樣品，每個品種每小區(qū)采集50粒，帶回實驗室后液氮冷凍，存于－80℃冰箱供相關指標測定。轉(zhuǎn)色期各階段果實采集標準見圖1。

圖1 試驗材料采收標準

1.3.3 花色苷含量及其代謝相關基因表達量測定 藍莓果實花色苷含量參照張美嬌等[22]的方法測定?？俁NA提取參照鄭嘉偉等[23]的方法，利用北京康為試劑公司的UltraSYBR Mixture進行qRT－PCR檢測，相關基因表達量檢測引物序列如表1所示?；蛳鄬Ρ磉_量數(shù)據(jù)均以各品種轉(zhuǎn)色初期的表達量為對照。

表1 藍莓花色苷代謝相關基因表達量檢測的引物及序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行處理及作圖，采用DPS 7.05進行方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種藍莓果實轉(zhuǎn)色期花色苷含量變化動態(tài)

由圖2可見，奧尼爾的花色苷總量在轉(zhuǎn)色初期至花盤轉(zhuǎn)色期均較低，變化不顯著；轉(zhuǎn)色中期始花色苷快速積累，含量增加顯著，為花盤轉(zhuǎn)色期的5.30倍；轉(zhuǎn)色后期花色苷含量為轉(zhuǎn)色中期的3.38倍，至轉(zhuǎn)色完成期，花色苷含量達5.95 mg/kg，比轉(zhuǎn)色后期顯著提升30.86%。米斯蒂的花色苷快速積累期稍有延后，轉(zhuǎn)色中期前積累很少，含量變化不顯著；轉(zhuǎn)色后期花色苷快速積累至3.00 mg/kg，為轉(zhuǎn)色中期的8.82倍，至轉(zhuǎn)色完成期花色苷含量達到5.03 mg/kg。由此可見，奧尼爾的花色苷快速積累期在花盤轉(zhuǎn)色期至轉(zhuǎn)色后期，米斯蒂的快速積累期則在轉(zhuǎn)色中期至轉(zhuǎn)色后期；奧尼爾的花色苷快速積累持續(xù)時間更長，轉(zhuǎn)色完成時，花色苷含量也更高。

圖2 兩種藍莓果實轉(zhuǎn)色期花色苷含量變化動態(tài)

2.2 兩種藍莓果實轉(zhuǎn)色期花色苷代謝途徑相關基因表達量變化

2.2.1 奧尼爾的相關基因表達量變化 對奧尼爾花色苷代謝途徑相關基因不同時期表達量分析可見(圖3)，花色苷合成基因VcPAL、VcCHS、Vc-CHI、VcANS、VcUFGT表達量在整個測定期呈現(xiàn)上升趨勢，轉(zhuǎn)色中期表達量驟升為花盤轉(zhuǎn)色期的2.77～3.63倍，其中，VcPAL、VcCHS、VcANS和VcUFGT表達量在轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期依舊顯著上升，即合成酶繼續(xù)發(fā)揮合成作用。VcF3H和VcDFR表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中，VcF3H在轉(zhuǎn)色后期表達量最高，轉(zhuǎn)色完成期表達量顯著下降至轉(zhuǎn)色后期的45.32%；VcDFR表達量則在轉(zhuǎn)色中期達最高峰，轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期表達量分別顯著下降4.59%、20.51%。氧化酶基因VcGLH和VcPPO表達量在整個轉(zhuǎn)色期均較低，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)色初期較高、之后下降、轉(zhuǎn)色完成期再顯著回升的趨勢，其中，VcGLH表達量在花盤轉(zhuǎn)色期比轉(zhuǎn)色初期顯著下降79.39%，花盤轉(zhuǎn)色期至轉(zhuǎn)色后期無顯著變化，轉(zhuǎn)色完成期顯著提升至轉(zhuǎn)色后期的2.08倍；VcPPO的表達量在轉(zhuǎn)色初期至花盤轉(zhuǎn)色期有所降低，但差異不顯著，轉(zhuǎn)色中期顯著下降52.32%，轉(zhuǎn)色后期與轉(zhuǎn)色中期水平相當，轉(zhuǎn)色完成期驟升至轉(zhuǎn)色后期的6.83倍。

圖3 奧尼爾藍莓轉(zhuǎn)色期花色苷代謝相關酶的基因相對表達量動態(tài)分析

可 見，奧 尼 爾 的VcPAL、VcCHS、VcCHI、VcANS、VcUFGT等合成酶基因在果實轉(zhuǎn)色期持續(xù)發(fā)揮作用，且表達量較高，而氧化酶基因VcGLH、VcPPO在整個轉(zhuǎn)色期表達量均較低，尤其合成酶基因表達高峰期極低，這更利于果實花色苷的合成與積累。

2.2.2 米斯蒂的相關基因表達量變化 對米斯蒂花色苷代謝途徑相關基因不同時期表達量分析可見(圖4)，VcPAL、VcCHS、VcCHI、VcF3H、VcDFR的基因表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，轉(zhuǎn)色中后期表達量驟升，轉(zhuǎn)色后期表達量最高，而VcUFGT僅在轉(zhuǎn)色后期表達量驟升；至轉(zhuǎn)色完成期上述基因的表達量又顯著下降82.00%～91.30%，與花盤轉(zhuǎn)色期的表達量相當。VcANS的表達量在花盤轉(zhuǎn)色期顯著升高至轉(zhuǎn)色初期的8.25倍，之后表達量無顯著變化。VcGLH和VcPPO相較于其他基因，表達量一直處于較低水平。

圖4 米斯蒂藍莓花色苷代謝相關基因相對表達量動態(tài)分析

由此可見，米斯蒂各基因的表達趨勢一致性較強，且調(diào)控花色苷合成的基因表達高峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色中期和轉(zhuǎn)色后期，以轉(zhuǎn)色后期表達量更高，轉(zhuǎn)色完成時，各基因的相對表達量與花盤轉(zhuǎn)色期水平相當，但VcANS的相對表達量在花盤轉(zhuǎn)色期上升后，一直保持在轉(zhuǎn)色初期的17倍左右。

2.3 果實微環(huán)境對花色苷積累的影響

2.3.1 光照 從轉(zhuǎn)色期光照強度(圖5)來看，4月11日至21日設施大棚內(nèi)的光照強度主要集中在20～40 klx，最強光照為40～60 klx，最高達65.25 klx，此時大部分藍莓果實處于轉(zhuǎn)色初期；4月22日至25日光照強度顯著下降，大多在10 klx左右，最大光照強度為46.40 klx；4月26日至5月1日光照強度波動較大，主要分布在10～40 klx，但出現(xiàn)超過60 klx的強光照天氣數(shù)增多，即轉(zhuǎn)色中后期光照強度相對較強。

圖5 藍莓果實轉(zhuǎn)色期光照強度動態(tài)分析

2.3.2 氣溫 由圖6可見，4月11日至21日，設施內(nèi)氣溫相對穩(wěn)定，大部分維持在15～35℃，溫差較小；4月26日以后，棚內(nèi)溫差較大，氣溫波動較大，35℃以上高溫和10℃以下低溫同日出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)5℃以下低溫。即藍莓花盤轉(zhuǎn)色期棚內(nèi)溫差較小，轉(zhuǎn)色中后期溫度相對穩(wěn)定，后期晝夜溫差增大，促進花色苷合成與積累。由日平均溫度曲線可見，設施內(nèi)日平均溫度維持在15～25℃，前期維持在20～25℃，后期降至15～20℃。

圖6 藍莓果實轉(zhuǎn)色期氣溫變化動態(tài)

2.3.3 空氣濕度 從圖7來看，設施內(nèi)空氣濕度大部分在10%以上，4月25日左右濕度全天較高，維持在50%以上，即果實轉(zhuǎn)色中期生長環(huán)境濕度較大，這有利于減少光合產(chǎn)物消耗及為花色苷代謝提供充分的底物；4月28日以后濕度未達到100%，且10%及以下濕度出現(xiàn)幾率增加，5月2日至4日濕度波動范圍較小，最高濕度在70%左右。

圖7 藍莓果實轉(zhuǎn)色期空氣濕度變化動態(tài)

綜合氣象數(shù)據(jù)可見，棚內(nèi)前期光照較弱、平均氣溫較高且溫差較小、空氣濕度較大，適宜果實營養(yǎng)物質(zhì)的積累，以便為花色苷合成提供充分的底物；后期光照相對較強，平均溫度較低、溫差較大、濕度較小、光照較強，加之前期的底物累積，更利于果實花色苷合成。

3 討論與結(jié)論

品種是影響花色苷含量的重要因素，直接決定花色苷基因型[24]。本試驗結(jié)果表明，引種的南高叢藍莓品種奧尼爾和米斯蒂在膠東地區(qū)設施栽培時的花色苷積累規(guī)律不同，奧尼爾的花色苷合成呈穩(wěn)定增長模式，而米斯蒂的花色苷合成屬于激增式。奧尼爾花色苷代謝相關基因中，前端合成基因VcPAL、VcCHS、VcCHI及后端合成基因VcANS、VcUFGT的相對表達量在果實轉(zhuǎn)色前期至后期逐步升高，且在轉(zhuǎn)色后期至轉(zhuǎn)色完成期的基因表達量增幅較高，合成中端基因VcF3H和VcDFR表達量先升高再降低，VcGLH、VcPPO表達量先降低再升高，這與花色苷在轉(zhuǎn)色中期開始大量累積趨勢一致。米斯蒂花色苷合成相關基因表達量在轉(zhuǎn)色前期和花盤轉(zhuǎn)色期均較為平穩(wěn)，轉(zhuǎn)色中期至轉(zhuǎn)色后期表達量激增，之后又斷崖式下跌，這與花色苷含量在轉(zhuǎn)色后期大量積累的規(guī)律一致。兩個藍莓品種花色苷代謝相關基因表達量的差異可能是由品種差異造成的，也可能是由于不同品種的基因表達對外界因素如溫度、濕度及光照等的響應不同[25]。通過對藍莓生長環(huán)境的氣溫、濕度及光照強度分析可見，花色苷合成的不同階段其外界條件不同，前期棚內(nèi)日平均氣溫較高、溫差較小、濕度較大、光照強度相對較低，可能更適合奧尼爾花色苷相關基因的表達；而中后期，棚內(nèi)日平均溫度下降、溫差較大、濕度下降、光照強度增大，可能更適合米斯蒂花色苷相關基因的表達。

綜合上述分析，米斯蒂的花色苷基因表達高峰期稍晚，集中表達特點更為顯著，但奧尼爾花色苷總量在整個轉(zhuǎn)色過程中均高于米斯蒂。造成這種差異的原因首先可能是品種間差異，其次可能是米斯蒂合成途徑中的VcANS表達量相對較低，限制了花色苷的合成[26]。