虎眼萬年青總皂苷對酒精所致急性肝損傷的治療作用

★ 閆立地（大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院 黑龍江 大慶 163712）

肝臟是酒精分解代謝的主要器官，但過度或有害飲酒會導(dǎo)致肝功能障礙以及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異，引起酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）［1］。目前酒精已成為我國導(dǎo)致肝損傷的第二大因素［2］。虎眼萬年青（Ornithogalum caudatumait）為百合科虎眼萬年青屬草本植物，全株皆可入藥，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含皂苷、多糖等成分?；⒀廴f年青的藥理作用包括抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、降血糖等，其中抗肝癌、抗炎和提高免疫力的作用尤為顯著［3］，應(yīng)用前景十分廣闊。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用虎眼萬年青總皂苷對酒精所致的急性肝損傷小鼠進(jìn)行治療，通過對小鼠血清及肝組織勻漿液的生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，探究虎眼萬年青總皂苷對急性酒精性肝損傷小鼠的治療作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠60只，雄性，體重18～20 g。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，許可證號是SCXK(黑)2013-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 虎眼萬年青（購自吉林省長白朝鮮族自治縣長白山中藥研究所）；薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98 %，上海源葉生物科技有限公司）；52°紅星二鍋頭白酒（北京紅星股份有限公司）；硫普羅寧腸溶片（上海凱寶新誼藥業(yè)有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST試劑盒、甘油三酯TG試劑盒、超氧化物歧化酶SOD試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX試劑盒均購于南京建成生物研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BSA-CW電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；SIGMA3-30K離心機(jī)（德國sigma公司）；UV725N分光光度計(jì)(上?？茖W(xué)精密儀器廠)。

2 方法

2.1 虎眼萬年青總皂苷藥品制備 運(yùn)用乙醇熱回流的方法，將虎眼萬年青烘干后的全株粉末與80 %乙醇以1∶15的固液比，在70℃水浴下提取3次，每次3 h。將提取后溶液濃縮揮干乙醇后，經(jīng)石油醚除雜，正丁醇萃取，干燥得虎眼萬年青總皂苷浸膏［4］。采用香草醛-冰醋酸比色法測定虎眼萬年青總皂苷含量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.506 7X-0.446 1（r2=0.999 4），表明薯蕷皂苷在 0.07～0.15 mg 范圍內(nèi)和A值呈良好的線性關(guān)系。測得虎眼萬年青總皂苷得率為0.42 %。

2.2 試驗(yàn)動物分組與酒精所致急性肝損傷小鼠模型的建立 雄性小鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成空白對照組、模型組、陽性藥物組、高劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組、低劑量實(shí)驗(yàn)組，每組10只小鼠。

除空白對照組外的小鼠，每日給其余小鼠灌服52°白酒（0.24 mL/20 g），每天 1 次，連續(xù) 7 d，于第8 d小鼠酒精性急性肝損傷模型建立成功［5-6］。

2.3 給藥治療 第9 d開始進(jìn)行給藥治療。根據(jù)已有研究皂苷類治療小鼠肝損傷的文獻(xiàn)［7］，將虎眼萬年青總皂苷高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組分別按照體重以 60、30、15 mg/ kg虎眼萬年青總皂苷溶液進(jìn)行灌胃處理，參照參考文獻(xiàn)［8］確定陽性藥物硫普羅寧的給藥劑量，為120 mg/kg硫普羅寧溶液溶液，灌胃體積皆為15 mL/kg，空白對照組及模型組灌以等體積蒸餾水。每天1次，連續(xù)7 d。

2.4 生化指標(biāo)測定

2.4.1 血液指標(biāo)測定末次灌胃后禁食不禁水12 h，小鼠眼球取血，1 500 r/min、4 ℃離心 15 min 得血清，測定小鼠血清中ALT、AST活力和TG含量，具體操作方法皆嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4.2 肝臟指標(biāo)測定小鼠處死后，解剖取肝臟組織，加入生理鹽水，冰水浴條件下進(jìn)行勻漿，制成10 % 的勻漿液，2 000 r/min、4 ℃離心 10 min 取上清液為肝臟勻漿液，測定SOD、GSH-PX活力，具體操作方法皆嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及處理 使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較通過t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般生理狀態(tài) 空白對照組小鼠精神狀況良好，行動自如，飲食如常，體重正常增加。模型組小鼠精神渙散嗜睡，有時(shí)極度狂躁，多飲多食，排泄物增多，體重基本保持不變，毛色光澤減少?；⒀廴f年青總皂苷實(shí)驗(yàn)組相比于模型組精神狀況有所改善，體重有所增加，高劑量實(shí)驗(yàn)組改善最為明顯。

3.2 對急性酒精性肝損傷小鼠生化指標(biāo)影響

3.2.1 對急性酒精性肝損傷小鼠血清指標(biāo)影響血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高反映了肝細(xì)胞受損程度［9］，由表1結(jié)果可知，與空白對照組相比模型組小鼠血清中ALT、AST活力均有顯著升高（P＜0.01），說明急性酒精性肝損傷小鼠造模成功。與模型組比較，陽性藥物組、高劑量實(shí)驗(yàn)組和中劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中ALT、AST活力明顯降低（P＜0.01），但低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中ALT、AST活力沒有明顯變化。因此證明虎眼萬年青總皂苷可以改善肝細(xì)胞的受損程度。

酒精性肝損傷肝纖維化與血脂有密切的關(guān)系，當(dāng)短時(shí)間內(nèi)攝入大量酒精時(shí)，肝臟脂類物質(zhì)大量積累并進(jìn)入血液，則血液中的TG濃度會增加。由表1結(jié)果可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中TG含量明顯升高（P＜0.01）說明急性酒精性肝損傷小鼠造模成功。與模型組相比較，陽性藥物組、高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TG含量顯著降低（P＜0.01），中劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TG含量也有所降低（P＜0.05），但低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TG含量沒有明顯變化，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。因此說明虎眼萬年青總皂苷可以改善肝臟發(fā)生的脂肪性病變。

表1 虎眼萬年青總皂苷對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活力及TG含量的影響（，n=10）

表1 虎眼萬年青總皂苷對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活力及TG含量的影響（，n=10）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 ALT（IU/L） AST(IU/L) TG（mmol/L）空白對照組 13.15±2.55 23.00±0.68 0.638 1±0.175模型組 43.17±4.33** 72.79±9.33** 0.870 7±0.089**陽性藥物組 26.05±2.03## 57.30±4.14## 0.642 0±0.086##高劑量實(shí)驗(yàn)組 31.00±3.15## 46.20±4.37## 0.631 5±0.491##中劑量實(shí)驗(yàn)組 36.00±1.57## 60.59±3.88## 0.743 7±0.072#低劑量實(shí)驗(yàn)組 41.73±0.33 66.93±4.13 0.886 0±0.035

3.2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指標(biāo)影響酒精進(jìn)入肝臟后，會導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，使得SOD和GSH-PX等抗氧化物大量消耗。因此肝細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-PX活力可反映酒精性肝細(xì)胞受損程度。由表2結(jié)果可知，與空白對照組相比模型組小鼠肝臟中SOD和GSH-PX活力均明顯下降（P＜0.01），說明急性酒精性肝損傷小鼠模型造模成功。與模型組相比，陽性藥物組、高劑量實(shí)驗(yàn)組和中劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中SOD和GSH-PX活力皆有明顯提高（P＜0.01），低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中GSH-PX活力也有一定提高（P＜0.05）。說明說明虎眼萬年青總皂苷可以緩解酒精所致急性肝損傷的小鼠肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表2 虎眼萬年青總皂苷對急性酒精性肝損傷小鼠肝部SOD和GSH-PX活力的影響（，n=10）

表2 虎眼萬年青總皂苷對急性酒精性肝損傷小鼠肝部SOD和GSH-PX活力的影響（，n=10）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 SOD（U/mg prot） GSH-PX（U/mg prot）空白對照組 40.86±6.48 355.15±25.45模型組 20.92±4.56** 171.12±33.61**陽性藥物組 36.16±4.62## 262.21±26.69##高劑量實(shí)驗(yàn)組 34.43±3.14## 275.66±15.24##中劑量實(shí)驗(yàn)組 29.82±2.06## 234.29±8.76##低劑量實(shí)驗(yàn)組 22.91±2.02 207.44±12.27#

4 討論

酒精性肝損傷是指長期或短期內(nèi)大量飲酒，過量的酒精在肝臟中經(jīng)過一系列的反應(yīng)可導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體的損傷等氧化應(yīng)激損傷，使脂肪大量蓄積于肝臟之中，造成肝臟損傷的一種疾?。?0］。目前研究表明，肝臟是酒精代謝的主要場所，乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）氧化代謝為乙酸。正常情況下機(jī)體有相對完善的抗氧化系統(tǒng)，包括SOD和GSH-PX等的酶抗氧化系統(tǒng)，能對抗其在氧化過程中產(chǎn)生的活性氧和活性氮分子［11］。但當(dāng)短期內(nèi)大量的乙醇進(jìn)入肝臟細(xì)胞時(shí)，乙醇被轉(zhuǎn)化為乙醛，抑制三羧酸循環(huán)引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（如MDA），此時(shí)酶抗氧物系統(tǒng)超負(fù)荷工作，使SOD和GSH-PX等抗氧化物被大量消耗，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步的損傷。導(dǎo)致膜的流動性降低，通透性升高，使肝臟細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST等轉(zhuǎn)氨酶大量游離，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外及血清中轉(zhuǎn)氨酶活力急劇增大。同時(shí)短期內(nèi)過量的乙醇攝入會造成三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化障礙，影響脂肪代謝，導(dǎo)致TG在肝臟中大量蓄積，從而TG大量進(jìn)入血液，使血液中的TG含量顯著增加。

本研究結(jié)果表示，與模型組相比，高劑量與中劑量實(shí)驗(yàn)組肝臟組織中SOD和GSH-PX活力皆有明顯提高（P＜0.01）這說明虎眼萬年青總皂苷具有一定的抗氧化能力，可提高機(jī)體內(nèi)抗氧化物水平，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，此結(jié)論與徐暘等［12］得出的虎眼萬年青總皂苷成分具有抗氧化能力的結(jié)果一致。血液中ALT和AST活力是臨床上評價(jià)肝損傷的常見指標(biāo)，與模型組相比較，虎眼萬年青總皂苷高劑量實(shí)驗(yàn)組血清中ALT、AST活力顯著降低（P＜0.01）。說明虎眼萬年青總皂苷能有效治療酒精所致的急性肝損傷，且具有一定的量效關(guān)系（效果：高劑量＞中劑量），低劑量幾乎無治療效果。

目前認(rèn)為，急性酒精性肝損傷發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是酒精導(dǎo)致的氧化應(yīng)激［13-14］。通過研究清楚的發(fā)現(xiàn)虎眼萬年青總皂苷可以使酒精所致急性肝損傷的小鼠肝部的SOD和GSH-PX活力提高，增加肝臟細(xì)胞的抗氧化物能力，減少酒精所致的氧化應(yīng)激，減少肝臟細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，從而達(dá)到的治療急性酒精性肝損傷的作用。

至今只有宛瑩［7］得出虎眼萬年青總皂苷對肝損傷有保護(hù)作用，但與本項(xiàng)目的區(qū)別較大。給藥目的不同：已有文獻(xiàn)的給藥目的預(yù)防性給藥，本項(xiàng)目為治療性給藥。本項(xiàng)目研究目標(biāo)為虎眼萬年青對肝損傷的治療作用，即在過量飲酒引起肝損傷后，判斷虎眼萬年青是否能夠有效治療急性肝臟損傷。造模方式的不同：已有文獻(xiàn)的造模方式為腹腔注射對乙酰氨基酚或灌胃給予他克林，而本項(xiàng)目采用了灌胃高度白酒的方式建立急性酒精性肝損傷模型，更好地模擬了人體的過量飲酒。

綜上所述，虎眼萬年青總皂苷對酒精所致的急性肝損傷小鼠具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與虎眼萬年青總皂苷具有抗氧化能力和緩解氧化應(yīng)激有關(guān)。現(xiàn)我國虎眼萬年青的標(biāo)準(zhǔn)化栽培已在吉林省長白縣形成，可年產(chǎn)200噸以上鮮品原料，且虎眼萬年青具有廣闊的開發(fā)、研究及臨床應(yīng)用前景。該實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步開發(fā)利用虎眼萬年青藥用資源提供依據(jù)。