細(xì)胞衰老與椎間盤退變的相關(guān)性研究進(jìn)展

張廣智，武作龍，賀學(xué)崗，高一誠，郭旭東，王以典，劉明強(qiáng)，朱大學(xué)，康學(xué)文*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，中國甘肅蘭州730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國甘肅蘭州730030)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是一種常見的肌肉骨骼系統(tǒng)退行性疾病，也是導(dǎo)致慢性腰背部疼痛的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)估計，約20%的青少年有輕度的IDD，并且80%的人在一生中出現(xiàn)過背部疼痛癥狀[2]。IDD的具體發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，現(xiàn)有的研究認(rèn)為，IDD是一種細(xì)胞介導(dǎo)的復(fù)雜過程，最終導(dǎo)致椎間盤功能和結(jié)構(gòu)的改變[3]。其中，細(xì)胞衰老被認(rèn)為是導(dǎo)致IDD的主要原因之一，而炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、端粒縮短和DNA損傷、營養(yǎng)剝奪、機(jī)械負(fù)荷異常和表觀遺傳學(xué)改變參與了椎間盤細(xì)胞的衰老進(jìn)程，最終導(dǎo)致IDD的發(fā)生發(fā)展[4]。目前，關(guān)于細(xì)胞衰老與IDD的研究多集中在椎間盤髓核(nucleus pulposus，NP)細(xì)胞、纖維環(huán)(anulus fibrosus，AF)細(xì)胞和軟骨終板(cartilage endplate，CEP)細(xì)胞。本文就這方面研究進(jìn)展作一綜述，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

1 椎間盤結(jié)構(gòu)和功能概述

作為連接椎體的關(guān)節(jié)，椎間盤是脊柱承載系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的部分，其主要作用是傳遞和吸收作用在脊柱軸向的壓縮應(yīng)力并保持脊柱的多軸靈活性，因此，是人體中較早發(fā)生退行性改變的組織[5]。健康的椎間盤由中央凝膠狀的NP、外周包繞髓核的AF及連接上下椎體的CEP共同構(gòu)成[6]。NP主要由富含Ⅱ型膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成，在脊柱受力過程中主要起抵消和傳遞軸向壓力載荷作用。AF的ECM主要由相互交替的Ⅰ型膠原纖維組成，主要功能是在脊柱彎曲或扭曲過程中防止髓核在壓力作用下突出。CEP是厚度均勻的透明軟骨組織，其ECM主要由蛋白聚糖和膠原纖維組成。由于椎間盤是無血管無神經(jīng)的組織，CEP在椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)中起重要作用，椎間盤通過CEP以擴(kuò)散的方式交換營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物，從而維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能[7]。此外，在正常椎間盤中，許多生長因子和細(xì)胞因子使ECM的合成和分解保持動態(tài)平衡[8]。因此，各種原因?qū)е碌淖甸g盤功能和結(jié)構(gòu)的異常終將導(dǎo)致IDD。

2 細(xì)胞衰老的特征

早在1961年，Hayflick等[9]就發(fā)現(xiàn)正常人成纖維細(xì)胞在連續(xù)傳代后出現(xiàn)增殖能力受到限制，并首次提出“細(xì)胞衰老”這一概念。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞處于不可逆性的增殖停滯狀態(tài)，細(xì)胞周期永久性停滯在G0/G1期，形態(tài)上表現(xiàn)為形狀變大、胞質(zhì)內(nèi)色素堆積和空泡形成，線粒體數(shù)量減少，胞核增大、核膜內(nèi)陷和染色質(zhì)固縮等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10～11]。衰老細(xì)胞的另一個重要特征就是分泌多種炎癥因子、趨化因子、生長因子和組織重建蛋白酶等，組成衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)。這些因子廣泛參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和遷移等多種生物學(xué)過程，其作用十分廣泛。細(xì)胞衰老主要分為兩種類型，即細(xì)胞復(fù)制性衰老和細(xì)胞過早性衰老。細(xì)胞在連續(xù)復(fù)制過程中導(dǎo)致端?？s短引起的衰老稱為復(fù)制性衰老，而由炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、DNA損傷和線粒體功能障礙等外源性壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老稱為細(xì)胞過早性衰老。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老后，衰老相關(guān) β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal)特異性表達(dá)升高，且 p53、p21、p16等細(xì)胞周期抑制蛋白表達(dá)上調(diào)，它們是鑒定細(xì)胞衰老的主要標(biāo)志物[12]。

3 椎間盤細(xì)胞衰老與IDD

當(dāng)椎間盤NP細(xì)胞、AF細(xì)胞和CEP細(xì)胞發(fā)生衰老后局部代謝狀態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為合成代謝降低、分解代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致ECM降解增加、NP含水量下降、AF彈性降低及CEP鈣化增加，最終導(dǎo)致脊柱穩(wěn)定性下降、椎間盤塌陷、椎體滑脫、骨贅形成、AF撕裂及NP組織突出等一系列病理改變[8]。相關(guān)研究表明，在IDD患者的NP和AF組織中SA-β-gal染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且這種陽性細(xì)胞數(shù)量與椎間盤磁共振下Pfirrmann分級呈正相關(guān)，而與Ki67陽性細(xì)胞(增殖細(xì)胞)的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[13～15]，提示椎間盤細(xì)胞衰老水平與IDD嚴(yán)重程度正相關(guān)。最近研究表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、端粒縮短和DNA損傷、營養(yǎng)剝奪及機(jī)械負(fù)荷異常等因素介導(dǎo)了細(xì)胞衰老相關(guān)的IDD發(fā)展。

3.1 炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)通常被認(rèn)為是機(jī)體應(yīng)對感染或組織損傷后的一種病理過程，越來越多的證據(jù)表明炎癥是IDD進(jìn)程中的關(guān)鍵因素[16～17]。隨著IDD進(jìn)展，退變椎間盤中各種促炎細(xì)胞因子的水平顯著增加，包括白細(xì)胞介素-1α (interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[18～25](表 1)，這些炎癥因子在局部產(chǎn)生自身免疫炎癥反應(yīng)并使椎間盤ECM的分解代謝增強(qiáng)，從而導(dǎo)致椎間盤功能紊亂和結(jié)構(gòu)改變。相關(guān)研究表明，在變性椎間盤中IL-1β的水平增加，且隨著IDD的嚴(yán)重程度而增加；IL-1β不僅能直接抑制ECM合成，而且還形成一個正反饋回路，刺激其他炎癥介質(zhì)的釋放和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤局部分解代謝增強(qiáng)[16]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用IL-1β刺激人NP和AF細(xì)胞后，IL-6、IL-8和IL-17的水平均顯著增加?？梢姡琁L-1β可通過促進(jìn)IL-6、IL-8和IL-17的釋放而充當(dāng)炎癥級聯(lián)事件的關(guān)鍵引發(fā)劑[18]。Chen等[19]用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測了腰椎間盤突出癥患者的血清IL-21濃度，發(fā)現(xiàn)其較椎間盤未突出患者明顯增加。Gorth等[20]通過研究IL-1在年齡相關(guān)IDD中的作用發(fā)現(xiàn)，給予小鼠IL-1α/β雙基因敲除(IL-1KO)后，血液中炎癥因子γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-5和IL-15的濃度顯著降低。重要的是，這些炎癥介質(zhì)參與椎間盤細(xì)胞衰老進(jìn)程。Markova等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增加了體外培養(yǎng)牛椎間盤細(xì)胞中SA-β-gal染色陽性細(xì)胞的數(shù)量，并導(dǎo)致ECM從合成代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榉纸獯x。同樣，在用TNF-α和IL-1β處理大鼠NP細(xì)胞后，SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)量也顯著增加[22]。此外，一些炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等對長入椎間盤的竇椎神經(jīng)末梢產(chǎn)生炎性刺激，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)根性疼痛的臨床癥狀[4]。以上研究表明，炎癥因子是強(qiáng)大的促細(xì)胞衰老因子，是導(dǎo)致IDD的關(guān)鍵因素之一，也是導(dǎo)致慢性腰背痛的重要原因。

表1 椎間盤退變后主要促炎因子的變化Table 1 Major variations in proinflammatory factors after IDD

3.2 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞衰老的主要原因之一，隨著IDD的發(fā)展，椎間盤中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平顯著增加，包括超氧陰離子(O2·－)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和一氧化氮(NO)，它們是細(xì)胞氧化代謝的副產(chǎn)物[26～27]。NP細(xì)胞是椎間盤中最重要的功能性細(xì)胞，已被證明是無厭氧的，在體內(nèi)進(jìn)行有氧代謝，而ROS是其主要的代謝副產(chǎn)物[12]。過量ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過各種信號通路加速椎間盤的變性，包括核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和 PI3K-Akt信號通路等[28～30]。Patil等[31]通過研究亞致死濃度H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠NP細(xì)胞過早衰老的過程，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞長期暴露于這種亞致死性氧化應(yīng)激時，它們會變成衰老細(xì)胞，失去增殖能力，但仍具有活細(xì)胞的功能，表現(xiàn)為大的細(xì)胞畸形，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，同時衰老相關(guān)信號通路(p53-p21-pRb 和 p16-pRb 信號通路)激活，SA-β-gal染色陽性。以上研究表明，氧化應(yīng)激在NP細(xì)胞衰老中起著至關(guān)重要的作用。

AF位于椎間盤的周緣部，由內(nèi)、外層呈同心圓排列的纖維構(gòu)成，內(nèi)層是纖維軟骨帶，外層主要為膠原纖維。堅固的AF包圍著內(nèi)部柔軟的NP，AF最重要的功能可能是通過液壓密封NP細(xì)胞并使施加在椎間盤上的任何壓力均勻化從而限制NP的突出，各種原因引起的AF降解都會導(dǎo)致其功能喪失，引起NP突出，從而引發(fā)腰背疼痛和神經(jīng)損傷等一系列臨床癥狀[32]。有研究表明，與正常的椎間盤相比，IDD患者中的AF細(xì)胞凋亡增加，而氧化應(yīng)激在AF細(xì)胞凋亡中扮演重要的作用[33]。此外，AF細(xì)胞中過量ROS與TNF-α之間形成的正反饋回路也參與IDD的發(fā)展[34]。然而，在氧化應(yīng)激條件下，AF細(xì)胞的衰老是否參與其凋亡過程，目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，值得未來進(jìn)一步研究。

3.3 線粒體功能障礙

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，由線粒體內(nèi)膜包繞的線粒體基質(zhì)含有完成三羧酸循環(huán)以及氧化還原反應(yīng)的重要組分，其通過氧化磷酸化過程產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，從而保證細(xì)胞的正常功能[35]。ATP 是細(xì)胞最主要的能量來源，但在ATP產(chǎn)生的同時也會產(chǎn)生ROS來介導(dǎo)氧化應(yīng)激[36]。隨著年齡的增長，線粒體DNA損傷加劇，導(dǎo)致線粒體功能障礙和異常的電子泄漏，從而增加ROS的產(chǎn)生，同時細(xì)胞氧化還原平衡能力的降低導(dǎo)致ROS對細(xì)胞的氧化損害增加，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞衰老。相反，線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)可減少H2O2的產(chǎn)生，從而延遲細(xì)胞的復(fù)制性衰老[12]。

椎間盤細(xì)胞線粒體功能受損參與IDD的發(fā)生發(fā)展[37]。有研究表明，在大鼠NP細(xì)胞中Progerin蛋白的積累可以通過提高ROS水平，破壞線粒體膜電位，降低ATP產(chǎn)生以及改變線粒體酶復(fù)合物的活性，進(jìn)而破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，加速IDD進(jìn)程[38]。另有研究報道，衰老的NP細(xì)胞中與線粒體功能相關(guān)的基因(包括底物脫氫酶、細(xì)胞色素和底物載體的編碼基因)的表達(dá)顯著上調(diào)，表明在衰老的NP細(xì)胞中線粒體功能發(fā)生異常[39]。Chen等[40]研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)對 NP 細(xì)胞再生作用的影響，發(fā)現(xiàn)與BMSC共培養(yǎng)可降低NP細(xì)胞內(nèi)的ROS，并維持細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體完整性，從而減輕壓力誘導(dǎo)的NP細(xì)胞線粒體損傷。由此可見，線粒體功能在IDD過程中發(fā)揮著重要作用，線粒體衍生的ROS加速了椎間盤細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰，進(jìn)而導(dǎo)致IDD。因此，針對椎間盤細(xì)胞中線粒體功能障礙的機(jī)制研究有助于揭示椎間盤細(xì)胞衰老的潛在機(jī)制和IDD的發(fā)病機(jī)理。

3.4 端?？s短和DNA損傷

哺乳動物的端粒由重復(fù)DNA片段(TTAGGG)組成，長度為50～400個核苷酸[41]。由于DNA末端的不完全復(fù)制，在細(xì)胞復(fù)制過程中端粒長度逐漸縮短。有研究表明，隨著IDD的發(fā)展，端粒長度逐漸縮短，端粒酶活性逐漸降低，同時衰老信號通路(p53-p21-Rb和p16-pRb信號通路)激活，提示端粒縮短在IDD發(fā)生發(fā)展過程中觸發(fā)了椎間盤細(xì)胞的復(fù)制性衰老[4]。Jeong等[42]從接受椎間盤手術(shù)的不同年齡(35歲、42歲、55歲、66歲和76歲)患者中提取并培養(yǎng)人NP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞的復(fù)制，不同年齡患者的NP細(xì)胞都表現(xiàn)出衰老特征，具體為SA-β-gal陽性細(xì)胞數(shù)量增加、端?？s短、端粒酶活性降低及p53-p21-pRb和p16-pRb通路激活。Wu等[43]用慢病毒載體將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)轉(zhuǎn)入衰老的人NP細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞的復(fù)制，端粒長度得以維持，端粒酶活性得到恢復(fù)，細(xì)胞衰老得到延緩，同時細(xì)胞增殖速率有所提高。以上研究結(jié)果表明，端粒長度的保持及端粒酶活性的維持在細(xì)胞復(fù)制性衰老中發(fā)揮重要的作用，而基于載體導(dǎo)入的基因治療可能是未來治療IDD的方向之一。

DNA損傷是指物理或化學(xué)因素引起的細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈的破壞，導(dǎo)致基因突變、染色體重排，嚴(yán)重者導(dǎo)致遺傳信息丟失、細(xì)胞周期停滯和凋亡等[44]。研究表明，端粒縮短常引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷反應(yīng)，而細(xì)胞損傷是細(xì)胞衰老的內(nèi)在觸發(fā)因素[4]。有研究報道，電離輻射通過導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA損傷進(jìn)而增加野生型小鼠NP組織中p16陽性細(xì)胞的數(shù)量[45]。Nasto等[46]將成年野生型和DNA修復(fù)基因Ercc1缺陷的小鼠暴露于電離輻射中，以誘導(dǎo)DNA損傷并研究其對椎間盤結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ercc1缺陷的小鼠椎間盤中，細(xì)胞衰老和凋亡均明顯增加。因此，各種因素導(dǎo)致的DNA損傷引起的椎間盤細(xì)胞衰老是介導(dǎo)IDD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。

3.5 營養(yǎng)剝奪

細(xì)胞營養(yǎng)的減少被認(rèn)為是IDD的另一重要原因?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證明，血清饑餓會抑制人工培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞的增殖，并增加其衰老速率，而給予高濃度血清可增加NP細(xì)胞的增殖速率[47]。多種血清來源的生長因子可增強(qiáng)椎間盤細(xì)胞的增殖，包括胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[48～50]。此外，由于椎間盤組織的無血管性，CEP對椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)至關(guān)重要，大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)通過其擴(kuò)散以滋養(yǎng)椎間盤細(xì)胞，從而維持椎間盤正常的結(jié)構(gòu)和功能[51]。在CEP退化的病理過程中，CEP細(xì)胞的凋亡和鈣化阻斷了椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而加速了椎間盤細(xì)胞的衰老，最終導(dǎo)致IDD[4]。因此，椎間盤正常營養(yǎng)的供應(yīng)對維持其正常功能十分重要，而CEP的變性可能是導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞衰老的原因之一。

3.6 機(jī)械載荷異常

人類的脊柱承受多方向的機(jī)械載荷，包括軸向、徑向和圓周方向的壓縮、拉伸與剪切力，而機(jī)械載荷異常是IDD的危險因素之一[4]。研究表明，肥胖引起的脊柱機(jī)械負(fù)荷增加是IDD發(fā)生發(fā)展的危險因素，體重指數(shù)的增加改變了椎間盤的生物力學(xué)，最終導(dǎo)致椎間盤間隙的變窄和椎間盤細(xì)胞分解代謝的增強(qiáng)[52]。Feng等[53]發(fā)現(xiàn)NP細(xì)胞長時間暴露于周期性機(jī)械張力下可誘導(dǎo)其過早性衰老。Liang等[54]通過前肢截肢術(shù)誘導(dǎo)大鼠直立行走來模擬人類的直立姿勢，發(fā)現(xiàn)長時間的直立姿勢會導(dǎo)致NP組織膠原蛋白結(jié)構(gòu)紊亂，AF出現(xiàn)裂隙和椎間盤高度降低，同時ECM分解增強(qiáng)。另外，長時間的直立姿勢上調(diào)了椎間盤細(xì)胞衰老相關(guān)基因(包括 p16、p27、p19ARF、p27KIP、RB、PTEN 和 RAGE)的表達(dá)。Ao等[55]基于實(shí)驗(yàn)性小鼠的疏水性，將實(shí)驗(yàn)組小鼠放置在含水深度約5 mm的空間內(nèi)以誘導(dǎo)其雙足站立姿勢(每天6 h)，而對照組正常飼養(yǎng)，10周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠椎間盤退變程度明顯加重。以上研究表明，機(jī)械負(fù)荷異常導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞的衰老，從而加速IDD的發(fā)展進(jìn)程。

3.7 表觀遺傳學(xué)改變

表觀遺傳學(xué)是研究DNA序列不變的前提下，基因表達(dá)可遺傳的改變的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科，其研究對象主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA編輯等，這些變化是通過環(huán)境與基因組的相互作用來調(diào)控基因的特異性表達(dá)，使其產(chǎn)生永久性改變，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[56]。Ikuno等[57]研究表明，在IDD晚期，DNA甲基化程度明顯加重。Yang等[58]報道，miR-143-5p在退變的NP細(xì)胞中高表達(dá)，并且在NP細(xì)胞中加入miR-143-5p特異性抑制劑后，細(xì)胞增殖增加，凋亡下降，且SA-β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少。遺憾的是，關(guān)于表觀遺傳學(xué)改變在IDD中的研究仍處于起步階段，具體機(jī)制仍需要大量的研究來證明。

4 結(jié)語和展望

綜上所述，在IDD發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞衰老是導(dǎo)致IDD進(jìn)展的重要因素，而炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、端?？s短、DNA損傷、營養(yǎng)剝奪、機(jī)械負(fù)荷異常和表觀遺傳學(xué)改變是導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞衰老的常見原因。因此，降低細(xì)胞衰老水平可以減輕椎間盤退變程度。然而，IDD是一個緩慢進(jìn)展的過程，其具體機(jī)制仍不完全明確。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者利用動物模型并在細(xì)胞水平進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，均無法完全模擬人體內(nèi)IDD進(jìn)程中椎間盤功能和結(jié)構(gòu)的具體改變，這也使得現(xiàn)有的研究成果難以解釋其復(fù)雜的機(jī)制。此外，關(guān)于IDD的研究目前多集中在NP組織，而在AF和CEP層面的研究仍然很少，對于這方面的研究也是未來非常有前途的方向之一?？偟膩碇v，椎間盤細(xì)胞衰老研究的不斷深入和抗衰老策略的持續(xù)開發(fā)，必將為這種慢性疾病提供新的治療契機(jī)。