野生與仿生栽培刺五加葉浸出物中多糖與黃酮含量分析

曲春風(fēng)，張 倩，田 芯，周燕霞

(山東大學(xué) 威海分校海洋學(xué)院，山東 威海 264209)

刺五加(Acanthopanax senticosus)屬于刺五加科植物，其干燥根［1］、莖、葉可作藥用［2］。刺五加主要分布于中國(東北、華北)、遠東、朝鮮及日本［3］，前蘇聯(lián)將刺五加作為人參代用品而廣泛載培［4］。我國吉林、黑龍江省野生資源豐富，蘊藏量大。

2000年以前之歷代本草專著及新中國以來之各版《中國藥典》均記載其藥用部位為根。2000年版《中國藥典》將其藥用部位規(guī)定為根及地上莖枝。在中國醫(yī)藥學(xué)中，刺五加被作為藥物廣泛應(yīng)用已有悠久的歷史。其有特異性香氣，性溫，味辛，微苦，有益氣健脾，補腎安神之功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將刺五加列為上品，并初步認識到其有“益氣”的作用;至《名醫(yī)別錄》中就指出五加有“補中，益精;堅筋骨，強志意”的功效;久服“輕身耐老”，與它藥配伍，亦可“進飲食，健氣力，不忘事”。另雷斅著《炮灸論》記五加皮有“陽人使陰，陰人使陽”的作用。《甄權(quán)本草》還記載它能“破逐惡風(fēng)血……治內(nèi)不足”。

現(xiàn)代藥理研究表明刺五加可增強機體非特異性防御能力，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗損傷及抗疲勞作用外，還可治療心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)衰弱、益氣健脾、補腎安神、益精壯骨之功效［5］。近年來，經(jīng)過對刺五加生理活性和化學(xué)成分方面的研究，表明刺五加有效成分為苷類，其中丁香苷，異秦皮啶是主要有效成分［6－20］。為了探討野生刺五加與仿生栽培刺五加的性狀及內(nèi)在質(zhì)量，提高其有效成分的利用率，我們對野生刺五加與仿生栽培刺五加依據(jù)藥典中浸出物含量測定的方法，分別對刺五加不同部位中的水提浸出物和醇提浸出物的含量進行了分析測定。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及來源

采自吉林省通化地區(qū)。試驗樣品均由山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院張崇禧教授鑒定為刺五加(表1)。

1.2 試驗儀器及試劑

試驗儀器:752型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，電子計數(shù)天平(500 g/0.001 g，金羊天平儀器廠)，百靈 LAI14型電子天平(110 g/0.000 1 g)，常熟市百靈天平儀器有限公司，101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司。無水乙醇為分析純、蒸餾水。

試驗試劑:蒽酮、葡萄糖、濃硫酸、鹽酸、無水乙醇、三氯化鋁溶液、醋酸鈉溶液、乙醇等，均為分析純。蒸餾水自制，蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所。

表1 刺五加的樣品來源

1.3 試驗方法

1.3.1 浸出物的制備

水提浸出物的制備。分別精密稱取刺五加葉粉末(恒重)2.000 g，每個樣品稱取3份(3次平行)，分別置于100 mL具塞三角瓶中，加蒸餾水50 mL，浸泡30 min，超聲提取30 min，靜置過濾，重復(fù)提取2次，過濾3次，濾液分別置蒸發(fā)皿中蒸干(蒸發(fā)皿在105℃下恒重，稱重)。浸出物重量=總重－蒸發(fā)皿凈重。

醇提浸出物的制備。精密稱取刺五加葉粉末(恒重)2.000 g，每個樣品稱取3份(3次平行)，分別置于100 mL具塞三角瓶中，加70%EtOH 50 mL，浸泡30 min，超聲提取 30 min，靜置過濾，重復(fù)提取2次，過濾，3次濾液分別置蒸發(fā)皿中蒸干(先在105℃下恒重)，再把帶浸出物的蒸發(fā)皿恒重，稱重。浸出物重量=總重－蒸發(fā)皿。

1.3.2 浸出物中可溶性多糖分析

顯色劑(蒽酮-濃硫酸)的制備。取98%的濃硫酸76 mL，稀釋成100 mL溶液;精密稱取蒽酮0.100 0 g，放入100 mL容量瓶中，逐漸加入上述配制的硫酸溶液至刻度并搖勻，冷卻至室溫，備用(需臨用前現(xiàn)配)。

標準曲線的制備。將葡萄糖于60℃烘1 h，再逐漸升溫至105℃干燥至恒重。精密稱取10.55 mg，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，取16支試管，除空白試液外，其余5組都做3次平行實驗，按表2加試劑，于620 nm處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)，繪制標準曲線。將所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，得回歸方程:

樣品液的制備與測定。各取水提浸出物0.25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用50%的乙醇定容至刻度，混勻。分別取1.0 mL加入具塞試管中，再加入蒽酮－濃硫酸試劑5.0 mL，混勻。同時另取1支具塞試管加50%EtoH 1 mL，再加入蒽酮－濃硫酸試劑5.0 mL，作為空白實驗。置沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫。于620 nm處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 醇浸出物中總黃酮的分析

顯色劑溶液的配制。0.1 mol·L－1三氯化鋁溶液的配制:取結(jié)晶三氯化鋁2.46 g于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，備用。

1 mol·L－1醋酸鈉溶液的配制:取結(jié)晶醋酸鈉13.6 g于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用。

對照品溶液的制備。精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品5.8 mg，置50 mL容量瓶中，以75%乙醇定容至刻度。

標準曲線的制備。吸取對照品溶液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL于 7支 25×250 mL試管中，按表2加試劑，混勻，靜置40 min。在420 nm處測吸光度，3次平行，以吸收值D為縱坐標，質(zhì)量mg為橫坐標，繪制標準曲線，將所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，得回歸方程y=0.103 5 x+0.129 9，R2=0.999

樣品溶液的制備與測定。取醇浸提物0.25 mg分別置于25 mL容量瓶中，用75%的乙醇定容至刻度。吸取5 mL于試管中，加入75%乙醇1 mL，0.1 mol三氯化鋁溶液3.0 mL及1 mol·L－1醋酸鈉溶液5.0 mL，搖勻，靜置40 min，取樣品溶液于420 nm處測吸光度，3次平行，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)論與分析

2.1 刺五加葉浸提物成分及含量

刺五加葉浸提物成分及含量見表2。

2.2 方法學(xué)考查

2.2.1 多糖含量分析方法學(xué)考查

回收率試驗:稱取6份已知多糖含量的樣品粉末約0.6 g，精密稱定，置于磨口錐形瓶中分別加入27.53 mg·mL－1的葡萄糖對照品溶液0.5 mL，按前面樣品處理法提取，并按樣品測定項操作，計算總多糖含量和回收率。平均回收率為100.32%，RSD=0.223%(n=6)。

精密度試驗:稱取已知多糖含量樣品粉末約0.6 g，精密稱定，按樣品測定方法，連續(xù)測6次，測得吸光度并計算含量，RSD=0.223%(n=6)。

表2 刺五加葉浸提物成分及含量

穩(wěn)定性試驗:取樣品溶液，每隔10 min測1次吸光度，記錄在60 min內(nèi)的吸光度值，求得RSD值為1.23%(n=6)。

2.2.2 總黃酮含量分析方法學(xué)考查

回收率試驗:精密稱取5份已知總黃酮含量的刺五加醇浸出物約0.25 mg，置于磨口錐形瓶中分別加入0.034 3 mg·mL－1的蘆丁標準品溶液2 mL，提取后按樣品測定項操作，計算黃酮含量和回收率。平均回收率為100.46%，RSD=0.77%。

精密度試驗:精密稱取已知總黃酮含量的刺五加粉末約0.5 g，連測5次，測得RSD為0.278%。

穩(wěn)定性試驗:取樣品溶液，每隔10 min測1次60 min內(nèi)的吸光值，求得RSD=1.32%(n=6)。

3 小結(jié)和討論

刺五加葉的水提物浸出率和醇提物浸出率較高，其中刺五加葉的水提物中浸出率最高的是9月21日采收的野生刺五加含量為27%，最低的是9月11日采收的仿生刺五加含量為12%;醇提物浸出率最高的也是9月21日采收的野生刺五加含量為30%，最低的是7月25日采收的仿生刺五加含量為13%。綜合分析:野生刺五加葉中水，醇浸出物含量相對都高于仿生刺五加葉浸出物含量。

水浸出物中可溶性多糖的含量最高的是9月11日采收的仿生栽培刺五加葉浸出物含量為20.32%，最低的是5月25日采收的野生刺五加葉浸出物含量為15.09%。

醇浸出物中總黃酮的含量最高的是7月25日采收的野生刺五加葉浸出物含量為26.19%，最低的是5月25日采收的野生刺五加葉浸出物含量為13.01%。

由于浸出物的含量與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，可以作為刺五加質(zhì)量評價標準之一。

［1］藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)［M］．廣州:廣東科技出版社，2005．

［2］趙敏，王炎，康莉．刺五加果實及種子內(nèi)源萌發(fā)物質(zhì)活性的研究［J］．中國中藥雜志，2001，26(8):534．

［3］李時珍著:圖解本草綱目(明)［M］．文光圖書公司印行1973:405－412，1205－1206．

［4］高風(fēng)蘭．無梗五加化學(xué)成分提取分離鑒定［J］．中國中醫(yī)藥科技，1997:4(2):107．

［5］曹先蘭，李珠蓮．刺五加國外實驗研究(綜述)［J］．中草藥，1980，11(6):277．

［6］周以良主編．黑龍江樹木志［M］．哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1986．

［7］衛(wèi)平，于高麥．短柄五加化學(xué)成分的研究［J］．中草藥，1989，20(4):8．

［8］王志睿，林敬明，張忠義．刺五加化學(xué)成分與藥理研究進展［J］．2003，26(8):603－606．

［9］張芳紅．齊墩果酸在甘肅產(chǎn)八種五加科植物中的分布規(guī)律［J］．中藥材，1994，17(9):29．

［10］吳立軍，鄭健，姜寶虹，等．刺五加莖葉化學(xué)成分［J］．藥學(xué)學(xué)報，1999，34(4):294．

［11］吳立軍，阮麗軍，鄭健，等．刺五加莖葉化學(xué)成分［J］．藥學(xué)學(xué)報，1999，34(11):839．

［12］劉起華，朱禮，李文蘭．刺五加主要活性成分化學(xué)與藥理研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，1999，10(4):305．

［13］苗明三，李振國．現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術(shù)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2000．

［14］曹先蘭．刺五加微量元素的測定［J］．黑龍江醫(yī)藥，1980(3):20．

［15］衛(wèi)平．短柄五加莖中氨基酸和金屬元素分析［J］．中藥材，1998，11(6):37．

［16］趙余慶．刺五加活性成分Liricdendrin結(jié)構(gòu)研究［J］．中草藥，1990，21(3):44．

［17］趙余慶．刺五加中異秦皮啶和芪類化合物的分離鑒定［J］．中草藥，1991，22(11):516．

［18］陳貌連，宋風(fēng)瑞，郭明全，等．刺五加葉中黃酮類化合物的結(jié) 構(gòu) 鑒 定［J］．高 等 學(xué) 校 化 學(xué) 學(xué) 報，2002，23(5):805．

［19］陳貌連，宋風(fēng)瑞，郭明全，等．刺五加葉中黃酮類化合物的分析［J］．分析化學(xué)，2002，30(6):690．

［20］江西新醫(yī)學(xué)院編．中藥大辭典［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989:29－36，380－383．