驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達的非小細胞肺癌患者病理特征及靶向治療療效評估的真實世界研究

張卉 楊新杰 李琨 王敬慧 呂嘉林 李曦 張新勇 秦娜 張權(quán) 吳羽華 馬麗 蓋飛 胡瑛 張樹才

我國肺癌每年新發(fā)病例約733,300例，死亡病例約610,200例，發(fā)病率和死亡率均居所有腫瘤的第一位[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見的類型，占所有肺癌的80%-85%。分子分型的出現(xiàn)為晚期NSCLC的治療開創(chuàng)了全新局面[2]。目前針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變、ALK融合、ROS1融合、MET 14外顯子跳躍突變，BRAF突變患者的靶向治療已經(jīng)為國內(nèi)外指南推薦的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案[3]。近年來，免疫治療特別是免疫檢查點抑制劑治療在肺癌領(lǐng)域取得了長足的進展。通過阻斷程序性死亡蛋白受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）與其配體程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）相互的作用，解除腫瘤誘導(dǎo)的特異性T細胞活化抑制，達到抗腫瘤效果[4]。指南推薦PD-L1表達量高于50%且無驅(qū)動基因突變的晚期非鱗NSCLC患者一線可選擇帕博利珠單抗單藥治療[5]。有研究[6]顯示，盡管EGFR突變患者的PD-L1表達率相較總體人群偏低，但仍有一定比例患者存在驅(qū)動基因突變且PD-L1高表達。針對這類患者的臨床治療方案應(yīng)該如何選擇？小樣本臨床研究[7]顯示PD-L1高表達的患者一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRtyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）療效不佳。一項回顧性的meta分析[8]顯示，EGFR突變患者二線使用PD-1/PD-L1抑制劑效果不佳。有限的數(shù)據(jù)似乎揭示出了驅(qū)動基因突變且PD-L1高表達患者的臨床難治特性，但在真實世界中該類患者臨床病理特征及對靶向治療的反應(yīng)仍未被完全揭示。本文擬通過對驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達的NSCLC患者的病理特征及靶向治療療效評估的真實世界研究，對該臨床問題進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 患者情況 本研究收集了315例2017年-2019年就診于首都醫(yī)科大學(xué)北京胸科醫(yī)院的NSCLC患者。回顧性收集患者的人口學(xué)、臨床病理學(xué)、驅(qū)動基因突變狀態(tài)、

PD-L1表達水平、治療和預(yù)后資料。其中僅有1例患者為分子檢測數(shù)據(jù)來源于靶向治療進展后標(biāo)本檢測結(jié)果，其他患者數(shù)據(jù)均取自一線治療前標(biāo)本檢測結(jié)果。

1.2 檢測方法 所有患者的腫瘤組織樣本均經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定后，進行石蠟包埋。驅(qū)動基因變異檢測：使用FFPE DNA/RNA試劑盒（艾德生物）進行DNA和RNA提取。經(jīng)多基因檢測試劑盒（熒光PCR法）（艾德生物）進行EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、PIK3CA、HER2和MET 9種驅(qū)動基因突變檢測。所有的檢測均在醫(yī)院病理科，參照產(chǎn)品說明書完成。PD-L1表達水平檢測：使用PD-L1 IHC 22C3分析試劑盒，用Dako Autostainer Link 48（ASL48）免疫組織化學(xué)染色機。 操作方法和數(shù)據(jù)分析均遵循制造商的說明。按腫瘤腫瘤細胞陽性比例分數(shù)（tumor proportion score, TPS）＜1.0%、1.0%-49.0%、≥50.0%分成三組。定義TPS＞1.0%為PD-L1陽性，TPS≥50.0%為PD-L1高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0版軟件分析數(shù)據(jù)。各組間樣本率的比較及其與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理學(xué)特征 315例患者的基礎(chǔ)信息見表1，所有的患者都有PD-L1表達水平記錄，其中表達量＜1.0%占58.4%，1.0%-49.0%占29.6%，≥50.0%占11.2%。驅(qū)動基因突變情況見圖1，驅(qū)動基因總陽性率為62.2%。EGFR為主要驅(qū)動基因，突變頻率為44.8%（141/315），以常見的19外顯子缺失和21外顯子L858R突變?yōu)橹鳌Ｆ渌?qū)動基因由突變率高到低依次為KRAS突變（7.0%, 22/315）、ALK融合（4.1%, 13/315）、HER2 20外顯子插入（2.2%, 7/315）、BRAF突變（1.3%, 4/315）、RET融合（1.3%, 4/315）、PIK3CA突變（1.0%, 3/315）、MET 14外顯子跳躍突變（0.3%, 1/315）和ROS1融合（0.3%, 1/315）。所有驅(qū)動基因變異均為單獨出現(xiàn)，未測到共突變。PD-L1高表達在驅(qū)動基因陽性患者中占比10.7%（21/196），在驅(qū)動基因陰性患者中占比為12.6%（15/119），二者無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.720）。

2.2 驅(qū)動基因突變與PD-L1表達水平的關(guān)系 各驅(qū)動基因陽性患者中PD-L1表達情況，詳見圖2。將PD-L1表達水平按＜1.0%、1.0%-49.0%、≥50.0%分成3組：EGFR突變陽性患者中這3組的占比分別為66.7%、25.5%、7.8%；KRAS突變陽性的患者這3組的占比分別為36.4%、45.5%、23.1%；ALK融合陽性的患者這3組的占比分別為38.5%、38.5%、23.1%，且3組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.012）。其他驅(qū)動基因陽性患者中，BRAF突變陽性和MET 14外顯子跳躍陽性患者中均有PD-L1表達量超過50.0%的患者，RET融合陽性和ROS1融合陽性患者則均為PD-L1表達量＜1.0%，HER2 20外顯子插入陽性和PIK3CA突變陽性患者PD-L1表達則分布在＜1.0%組和1.0%-49.0%組。由于攜帶這些稀有突變患者數(shù)太少，PD-L1的表達在這些組中均未有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 驅(qū)動基因陽性患者中PD-L1表達水平與臨床病理特征關(guān)系 所有入組患者中，PD-L1表達水平在年齡、性別、吸煙史和組織學(xué)類型中無統(tǒng)計學(xué)差異，而在臨床分期中有顯著差異（表2）。PD-L1高表達的患者中，83.5%的患者臨床分期為III期/IV期。EGFR突變陽性患者中，PD-L1表達水平在年齡、性別和吸煙史中無統(tǒng)計學(xué)差異，而在臨床分期和組織學(xué)類型中有顯著差異（表3）。PD-L1 高表達的患者中，90.9%（10/11）的患者臨床分期為IV期；在肺腺癌的占比最高（81.8%, 9/11），而與PD-L1低表達患者相比在肺鱗癌患者中仍有9.1%（1/11）檢出率。KRAS突變陽性患者中，PD-L1表達水平在年齡、性別、臨床分期和組織學(xué)類型中均無統(tǒng)計學(xué)差異，而在吸煙史中差異顯著，PD-L1高表達的患者均有吸煙史（表4）。ALK突變陽性患者中，未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達水平與病理特征存在相關(guān)性（表5）。

2.4 驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達的患者病例分析 病例1：男性，32歲，漢族，吸煙10年，日吸煙量20支。肺穿刺活檢病理診斷左肺腺癌，臨床分期T1N3M1c，IV期。腫瘤組織基因檢測為EML4-ALK融合陽性，PD-L1表達量90%。治療一線給予克唑替尼單藥治療，1個月后CT評估療效病情穩(wěn)定（stable disease, SD），2個月后CT評估為病情進展（progressive disease, PD）。一線無疾病進展時間（progression-free survival, PFS）僅為2.5個月。隨后二線給予色瑞替尼治療，1個月后CT評估腫瘤進展，三線更換為阿來替尼治療，病情持續(xù)進展，1個月后患者死亡（圖3）?；颊呖偵嫫冢╫verall survival, OS）為5個月。病例2：女性，67歲，漢族，無吸煙史。肺穿刺活檢病理診斷左肺腺癌，臨床分期T4N3M1c，IV期。腫瘤組織基因檢測為EGFR L858R突變，PD-L1表達量為70%。一線給予?？颂婺嶂委?，1個月后電子計算機斷層掃描（computed tomography, CT）評估為PD。二線換用奧西替尼治療，僅1個月后患者死亡（圖4）?；颊逴S為2個月。

3 討論

在本研究納入的315例NSCLC患者中，盡管男性（61.6%）、有吸煙史（54.9%）的患者偏多，但病理分型仍以腺癌（78.7%）為主。9個驅(qū)動基因總陽性率為62.2%，其中EGFR突變（44.8%, 141/315）、KRAS突變（7.0%, 22/315），ALK融合突變（4.1%, 13/315）為主要的三種驅(qū)動基因，與已報道的數(shù)據(jù)[9,10]相符。所有患者中，PD-L1表達水平整體偏低，高表達患者占11.2%，表達量在1%-49%的病例占29.6%，該數(shù)據(jù)也與已報道的數(shù)據(jù)相符[11]。2020年發(fā)表于Ann Oncol上關(guān)于非鱗NSCLC的PD-L1表達水平與臨床病理特征的大樣本數(shù)據(jù)[12]顯示，PD-L1高表達與煙草暴露量增加，臨床晚期和較高的腫瘤突變負荷相關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達水平與吸煙史的關(guān)系，但驗證了其與臨床分期的關(guān)系。本研究數(shù)據(jù)顯示，PD-L1高表達與PD-L1低表達和無表達的患者相比，更多的富集在III期/IV期患者中，三組中III期患者的比例分別為27.8%、19.1%和18.8%，IV期患者比例分別為55.6%、50.0%和45.3%。目前多項體內(nèi)外研究報道了NSCLC驅(qū)動基因突變與PD-L1表達的相關(guān)性。體外研究[13]顯示EGFR信號通路激活后可通過磷酸化ERK1/2/c-JUN，或激活JAK-STAT3、PI3K/AKT信號通路來上調(diào)PD-L1的表達。全球多中心真實世界EXPRESS研究，納入局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，其中EGFR突變陽性且PD-L1表達水平≥50%患者占比為13%（60/448），≥1%患者比例為44%（197/448）[14]。本研究中，EGFR突變陽性患者中，PD-L1高表達的比例為7.8%，PD-L1陽性比例為33.3%，與EXPRESS研究數(shù)據(jù)相比比例偏低。這可能與本研究納入了31.8%的I期-II期患者相關(guān)。進一步分析患者的病理特征發(fā)現(xiàn)EGFR突變且PD-L1高表達患者中90.9%（10/11）臨床分期為IV期，且相比于低表達患者肺腺癌的占比更高（9.1%, 1/11）。研究[13]顯示ALK融合可與PD-L1高表達伴發(fā)，其分子機理為ALK信號通路激活后通過磷酸化ERK1/2/c-JUN來上調(diào)PD-L1的表達。EXPRESS研究[14]中，ALK融合陽性且PD-L1表達水平≥50%患者占比為20%（15/74），≥1%患者比例為65%（48/74）。本研究中ALK融合陽性患者中，PD-L1高表達的比例為23.1%，PD-L1陽性比例為61.5%。細化分析患者病理特征，未發(fā)現(xiàn)與PD-L1表達水平顯著相關(guān)的特征，這可能與研究病例數(shù)較少相關(guān)。研究[15]顯示，KRAS突變通過激活ERK信號通路上調(diào)PD-L1表達水平。與KRAS野生患者相比，KRAS突變患者更易為PD-L1表達陽性（51% vs 36%; OR=1.69, 95%CI: 1.01-2.84, P=0.045）[16]。本研究中KRAS突變陽性患者中，PD-L1高表達患者比例為23.1%，PD-L1陽性比例為68.6%，且所有PD-L1高表達的患者均有吸煙史。在腸癌和甲狀腺癌相關(guān)研究[17,18]中均顯示BRAF突變與PD-L1高表達相伴發(fā)生。一項關(guān)于951例NSCLC患者的數(shù)據(jù)[19]顯示，MET 14外顯子跳躍突變患者中PD-L1高表達的比例為69.2%。本研究中共4例BRAF突變和1例MET 14外顯子跳躍突變患者，其PD-L1高表達的比例分別為50%和100%。盡管病例數(shù)有限，但本研究數(shù)據(jù)仍可反映出驅(qū)動基因改變與PD-L1表達的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶如下驅(qū)動基因改變患者PD-L1表達量偏低，如HER2 20外顯子插入、PIK3CA突變、RET融合、ROS1融合。這些發(fā)現(xiàn)尚有待大樣本量數(shù)據(jù)的驗證。

表 1 315例NSCLC患者基礎(chǔ)病理學(xué)特征Tab 1 Demographic and clinicopathological data of 315 NSCLC patients

表 2 PD-L1表達水平與臨床病理特征關(guān)系Tab 2 Relationship between PD-L1 expression level and clinicopathological characteristics

表 3 EGFR突變陽性患者PD-L1表達水平與臨床病理特征關(guān)系Tab 3 Relationship between PD-L1 expression level and clinicopathological characteristics in EGFR mutation-positive patients

表 4 KRAS突變陽性患者PD-L1表達水平與臨床病理特征關(guān)系Tab 4 Relationship between PD-L1 expression level and clinicopathological characteristics in KRAS mutation-positive patients

表 5 ALK融合陽性患者PD-L1表達水平與臨床病理特征關(guān)系Tab 5 Relationship between PD-L1 expression level and clinicopathological characteristics in ALK fusion-positive patients

圖 1 315例NSCLC患者驅(qū)動基因突變頻譜 Fig 1 Profiling of oncogenic driver mutation in 315 NSCLC patients. The mutation profile of 9 oncogenic driver genes: EGFR, KRAS, ALK, HER2, BRAF, RET, PIK3CA, MET, and ROS1 in the enrolled patients. And the variants details of EGFR.

圖 2 驅(qū)動基因突變類型與PD-L1表達水平關(guān)系Fig 2 Relationship between the driver gene mutation type and the PD-L1 expression level.All the 315 enrolled patients were grouped according to their driver gene mutations, and the proportion of each expression level of PD-L1 was counted.

圖 3 患者1治療過程以及治療前后CT診斷圖Fig 3 Timeline of patient evolution and chest computed tomography s c ans at diagnosis and af ter treatment in case 1. CT: computed tomography; PD: progressive disease; SD: stable disease.

圖 4 患者2治療過程以及治療前后CT診斷圖Fig 4 Timeline of patient evolution and chest computed tomography scans at diagnosis and after treatment in case 2

本研究詳細追蹤了2例初診患者診斷和治療過程。2例患者均為腺癌，攜帶敏感突變且PD-L1高表達?；颊呓邮馨邢蛑委熀罂焖龠M展，即便更換成二代或三代EGFR-TKI仍無法有效控制腫瘤增大，患者OS均未超過半年。2例患者診療全程中，沒有合適的機會取材做更大panel的基因測序以探究基因組層面的變異。僅有的數(shù)據(jù)提示，攜帶敏感突變且PD-L1高表達的患者可能有更差的預(yù)后，且靶向治療獲益有限。在一項針對101例EGFR敏感突變陽性的NSCLC患者研究中[7]，顯示PD-L1的高表達顯著降低了EGFR-TKI藥物治療客觀緩解率（objective response rate, ORR）（35.7%），縮短了PFS（3.8個月）。此外，在原發(fā)耐藥的患者中觀察到PD-L1陽性表達高于EGFR-TKI的獲得性耐藥患者（66.7% vs 30.2%, P=0.009）。針對這類患者應(yīng)當(dāng)給予何種治療方案，已成為臨床亟待解決的問題。盡管驅(qū)動基因突變陽性及PD-L1高表達分別為靶向藥物和免疫藥物的適應(yīng)癥，但兩藥的聯(lián)合似乎并不能達到很好的效果。一項I期研究[20]評估了納武單抗聯(lián)合厄洛替尼治療EGFR突變晚期NSCLC的療效。所有患者接受每2周納武單抗，每天150 mg的厄洛替尼治療。20例EGFR-TKI經(jīng)治患者的ORR為15%，中位PFS和中位OS分別為5.1個月和18.7個月。5例患者出現(xiàn)3級治療相關(guān)不良反應(yīng)，其中2例因不良反應(yīng)停藥。一項I期/II期研究[21]探索了帕博利珠單抗聯(lián)合厄洛替尼或吉非替尼一線治療攜帶EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者。所有患者每3周接受帕博利珠單抗2 mg/kg治療，厄洛替尼聯(lián)合組每天口服150 mg厄洛替尼；在吉非替尼聯(lián)合組每天口服250 mg吉非替尼。兩組有效率分別為41.7%（12例患者厄洛替尼聯(lián)合組）和14.3%（7例患者吉非替尼聯(lián)合組）。厄洛替尼治療組的耐受性尚可，但吉非替尼治療組中有5例（71.4%）患者發(fā)生3級/4級轉(zhuǎn)氨酶升高，且4名患者因此停藥。I期TATTON研究[22]納入既往EGFR-TKI治療進展的EGFR突變的NSCLC患者。劑量擴增隊列中每天口服奧美替尼80 mg，或每2周靜脈注射3 mg/kg-10 mg/kg度伐利尤單抗。研究結(jié)果顯示有38%（13/34）的患者在奧希替尼聯(lián)合度伐利尤單抗治療時出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，其中5例患者為3級/4級。而奧希替尼或度伐利尤單抗單藥治療時間質(zhì)性肺炎發(fā)生率僅分別為2.9%和2.0%。由于間質(zhì)性肺炎發(fā)生率過高，該研究及III期CAURAL研究[23]也因此終止。因此，免疫聯(lián)合EGFR-TKI未明顯提高療效，反而顯著增加了毒副作用，且不同藥物組合之間的毒性反應(yīng)也存在差異。免疫聯(lián)合靶向治療是否在驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達患者中有效還有待更多研究探究，這之前可能還需摸索出合理的用藥順序和時間間隔。已有研究顯示，免疫抑制劑治療單藥治療似乎有獲益趨勢。II期ATLANTIC研究[24,25]顯示，度伐利尤單抗作為三線及三線以上方案治療EGFR/ALK突變的NSCLC患者，PD-L1表達≥25%組相較于低表達組應(yīng)答率更高（43% vs 22%），且在中位OS（13.3個月 vs 9個月）、 12個月OS率（53.3% vs 40.4%）、24個月OS率（40.7% vs 14.7%）具有更優(yōu)表現(xiàn)。亞組分析顯示EGFR突變陽性比ALK陽性患者的中位OS更優(yōu)，分別為16.1個月和6.3個月。BRICH研究[26]探究了阿特珠單抗作為一線及后線治療PD-L1表達超過5%的NSCLC患者療效。納入患者中，8%EGFR突變陽性，28%KRAS突變陽性，2%ALK融合陽性，46%PD-L1高表達。其中PD-L1高表達亞組（TC≥25%或IC≥10%）的ORR為26%-31%；大多數(shù)病例仍在進行中。盡管研究公布無論EGFR或KRAS突變狀態(tài)如何，均會發(fā)生反應(yīng)，但未給出驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達患者與無基因變異的PD-L1高表達患者對比療效。然而，另外有部分研究顯示，EGFR突變可能還是免疫治療發(fā)生超進展的相關(guān)風(fēng)險因子。程穎教授團隊[27]回顧性分析了74例組織學(xué)確診的IIIb期或IV期NSCLC患者，二線或后線接受免疫單藥治療療效情況，其中EGFR/ALK突變患者為經(jīng)靶向治療后進展。中位隨訪時間為14.1個月(95%CI：1.7個月-39.3個月)，64例（86.5%）患者有影像學(xué)確診的疾病進展，其中25例患者快速進展，39例患者為非快速進展。進一步分析快速進展相關(guān)的影響因素發(fā)現(xiàn)，快速進展與美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）2分、EGFR/ALK突變、轉(zhuǎn)移灶超過3個和中性粒細胞/淋巴細胞比率≥3顯著相關(guān)。免疫聯(lián)合化療似乎也給這類患者帶來希望。CT18研究[28]是免疫聯(lián)合化療二線挑戰(zhàn)EGFR-TKI治療失敗的NSCLC患者的單臂研究。該研究入組40例EGFR突變患者為先前接受EGFRTKI治療失敗同時未伴有T790M突變或接受奧希替尼治療失敗。接受特瑞普利單抗聯(lián)合卡鉑和培美曲塞4個-6個周期，后續(xù)接受特瑞普利單抗聯(lián)合培美曲塞維持治療，直至疾病進展或不能耐受。研究結(jié)果表明ORR為50%（95%CI: 33.8%-66.2%），中位PFS為7.0個月（95%CI：4.8個月-10.3個月）。其中PD-L1高表達（≥50%）且EGFR突變的患者的ORR（29.4%）及PFS（5.3月）有獲益趨勢。IMpower150研究[29]中在接受ABCP治療組（阿特珠單抗+貝伐珠單抗+卡鉑+紫杉醇）中9%患者EGFR突變陽性，3%患者ALK融合陽性，19%患者PD-L1高表達；BCP治療組（貝伐珠單抗+卡鉑+紫杉醇）11%患者EGFR突變陽性，5%患者ALK融合陽性，18%患者PD-L1高表達。按驅(qū)動基因變異分層分析，EGFR陽性患者中，ABCP治療組比BCP治療組，有效率更高（71% vs 42%），中位緩解持續(xù)時間更長（11.1個月 vs 4.7個月），中位PFS（10.2個月 vs 6.9個月）和OS均有優(yōu)勢（未達到 vs 18.7個月）。但是ALK融合陽性的患者ABCP組較BCP治療組在PFS沒有統(tǒng)計學(xué)差異（8.3個月 vs 5.9個月）。若按PD-L1表達水平進行亞組分析，PD-L1高表達的患者，ABCP組較BCP治療組在OS上差異顯著（25.2個月 vs 15.0個月）。研究未公布驅(qū)動基因陽性且PD-L1高表達患者的治療對比數(shù)據(jù)。因此，對于攜帶敏感突變且PD-L1高表達的患者，能從何種治療方案中獲益，還有待前瞻性臨床研究的探究。

綜上所述，本研究通過對真實世界數(shù)據(jù)的回顧性分析，發(fā)現(xiàn)各驅(qū)動基因突變的NSCLC患者PD-L1高表達的比例各不相同，且高表達患者臨床病理特征也較低表達或陰性患者有較大差異。攜帶EGFR突變、ALK融合的患者且PD-L1高表達時，靶向治療獲益有限，預(yù)后可能更差。這些發(fā)現(xiàn)提示在臨床實踐中該類患者應(yīng)給予重點識別和特殊治療，也亟需更多的大型前瞻性臨床研究。

Author contributions

Zhang H, Zhang SC and Hu Y conceived and designed the study. Zhang H, Yang XJ and Li K performed the experiments. Zhang H, Yang XJ, Li K, Gai F and Qin N analyzed the data. Zhang H, Yang XJ, Li K, Gai F and Qin N contributed analysis tools. Zhang H, Yang XJ, Li K, Wang JH, Lv JL, Li X, Zhang XY, Qin N, Zhang Q, Wu YH, Ma L, Gai F, Hu Y and Zhang SC provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. Zhang H, Yang XJ, Li K, Wang JH, Lv JL, Li X, Zhang XY, Qin N, Zhang Q, Wu YH, Ma L, Gai F, Hu Y and Zhang SC had access to the data. Zhang H, Yang XJ, Li K, Wang JH, Lv JL, Li X, Zhang XY, Qin N, Zhang Q, Wu YH, Ma L, Gai F, Hu Y and Zhang SC read and approved the final manuscript as submitted.