LncRNA SNHG11對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖、遷移的影響

楊靜 楊堃2 孟旭霞 王一博

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266500 1 眼科； 2 中心實(shí)驗(yàn)室)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，在世界范圍內(nèi)因DR導(dǎo)致視力受損或喪失的患者正在逐年增加[1-2]。DR的病理機(jī)制與高血糖對(duì)視網(wǎng)膜微血管組織的影響有關(guān)[3]。高血糖可導(dǎo)致多元醇代謝途徑異常、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)積累、蛋白激酶C(PKC)激活、氧化應(yīng)激增強(qiáng)、細(xì)胞因子失衡[4]。多種因素相互作用，使得內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)分別建立的內(nèi)層及外層血視網(wǎng)膜屏障(BRB)功能受損，加速DR的進(jìn)展。

長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，由于缺乏完整的開放閱讀框(ORF)而無蛋白質(zhì)編碼功能，但可通過多種不同的機(jī)制參與蛋白質(zhì)編碼基因和表觀遺傳基因的表達(dá)調(diào)控[5]。近年來LncRNA在眼部疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。小核仁宿主基因11(SNHG11)是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，被認(rèn)為是前列腺癌和卵巢癌的預(yù)后標(biāo)志物[6]。也有研究證實(shí)SNHG11作為膠質(zhì)瘤的癌基因，可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來抑制細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移[7]。但目前尚未有研究SNHG11與DR關(guān)系的報(bào)道。

EMT是完全極化的細(xì)胞通過基底表面進(jìn)入基底膜的生理或病理過程，經(jīng)歷多種形態(tài)和功能的改變，從而獲得間質(zhì)表型[8]。當(dāng)機(jī)體在炎癥、傷口愈合和癌變等病理情況下EMT可被激活，此時(shí)細(xì)胞的遷移、侵襲及抗凋亡的能力增強(qiáng)[9]。既往研究表明，高血糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的RPE可發(fā)生EMT[10]。本研究旨在探討SNHG11在高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT及增殖、遷移中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ARPE-19 細(xì)胞購買于武漢生物細(xì)胞庫，普通DMEM培養(yǎng)基、高糖型DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清、胰蛋白酶、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購買于大連美侖生物技術(shù)有限公司。熒光定量PCR試劑盒、細(xì)胞裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。熒光定量PCR所用引物由華大基因合成，Si-SNHG11由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成,脂質(zhì)體LipofectamineTM3000購自美國 Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞處理及分組 RPE系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。每1～2 d換一次新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至90%左右時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行分組并給予不同條件進(jìn)行處理。低糖對(duì)照組：用5.5 mmol/L葡萄糖處理48 h；高滲對(duì)照組：使用60.0 mmol/L甘露醇處理48 h；高糖干預(yù)組：使用60.0 mmol/L的葡萄糖處理48 h；si-NC組：將si-conSNHG11轉(zhuǎn)染至ARPE-19細(xì)胞以后，使用60.0 mmol/L的葡萄糖處理48 h；siSNHG11組：將siSNHG11轉(zhuǎn)染至ARPE-19細(xì)胞以后，再使用60.0 mmol/L葡萄糖處理48 h。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞SNHG11的表達(dá) 各組細(xì)胞按分組條件培養(yǎng)48 h后提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)總體系為20 μL。循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH上游引物序列5′-CA-AAACAGCCTCAAGATCATCA-3′，下游引物序列5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。定量分析結(jié)果以熒光強(qiáng)度(CT)值表示，待測(cè)基因表達(dá)水平以GAPDH作為參比，待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞EMT標(biāo)記物蛋白的表達(dá) 各組細(xì)胞按分組條件培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入5×Loading buffer以后高溫加熱10 min使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書配置150 g/L的分離膠及50 g/L的濃縮膠，電泳、轉(zhuǎn)膜，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，再分別加入一抗 E-鈣黏蛋白(E-cad)、緊密連接蛋白(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，4 ℃孵育過夜，Tris鹽吐溫緩沖液(TBST)洗膜。加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光液顯像，使用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.2.4CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期的ARPE-19細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時(shí)，將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求分為低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組、si-NC組、si-SNHG11組，各組細(xì)胞按分組條件培養(yǎng)48 h后，分別加入5 g/L CCK8溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處吸光度(A)值，細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將生長狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期的ARPE-19細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時(shí)，使用無菌200 μL移液槍頭垂直于培養(yǎng)板底畫“一”字水平劃痕,形成一個(gè)無細(xì)胞區(qū),PBS洗滌3次去除離壁漂浮的細(xì)胞,將細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求分為低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組、si-NC組、si-SNHG11組，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)后第0、48 h使用倒置相差顯微鏡拍照，采用Image J圖像分析軟件分別測(cè)量初始無細(xì)胞區(qū)面積與當(dāng)前無細(xì)胞區(qū)面積，細(xì)胞相對(duì)遷移面積=(初始無細(xì)胞區(qū)面積-當(dāng)前無細(xì)胞區(qū)面積)/48 h無細(xì)胞區(qū)面積×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組ARPE-19細(xì)胞中SNHG11基因相對(duì)表達(dá)量變化

低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組以及高糖干預(yù)組SNHG11基因相對(duì)表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.27，P<0.01)；低糖對(duì)照組與高滲對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖干預(yù)組SNHG11相對(duì)表達(dá)量顯著高于低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組(t=7.86、6.19，P<0.05)。si-SNHG11組中SNHG11基因相對(duì)表達(dá)量與si-NC組比較顯著升高(t=18.62，P<0.01)。見表1。

2.2 各組ARPE-19細(xì)胞相對(duì)遷移面積比較

低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組相對(duì)遷移面積比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.14,P<0.05)；高糖干預(yù)組48 h的相對(duì)遷移面積顯著高于低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組(t=3.99、2.96，P<0.05)；低糖對(duì)照組與高滲對(duì)照組進(jìn)行比較差異無顯著性(P>0.05)。si-SNHG11組48 h的相對(duì)遷移面積顯著小于si-NC組(t=10.09，P<0.05)。見表1。

2.3 各組ARPE-19細(xì)胞存活率比較

低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組細(xì)胞存活率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.71，P<0.05)；高糖干預(yù)組細(xì)胞存活率顯著高于低糖對(duì)照組、高滲干預(yù)組(t=3.18、4.74，P<0.05)；低糖對(duì)照組與高滲對(duì)照組進(jìn)行比較差異并無顯著性(P>0.05)。si-SNHG11組細(xì)胞存活率顯著低于si-NC組，差異具有顯著性(t=5.37，P<0.05)。見表1。

表1 各組SNHG11相對(duì)表達(dá)量、相對(duì)遷移面積、細(xì)胞存活率比較

2.4 各組ARPE-19細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的蛋白表達(dá)量比較

低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組E-cad、ZO-1、Vimentin、α-SMA的表達(dá)量比較差異均具有顯著性(F=5.48～124.41，P<0.05)；高糖干預(yù)組中Vimentin、α-SMA的表達(dá)量顯著高于低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低糖對(duì)照組與高滲對(duì)照組相比，Vimentin、α-SMA的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。高糖干預(yù)組中E-cad、ZO-1的表達(dá)量顯著低于低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組(P<0.05)；低糖對(duì)照組與高滲對(duì)照組相比，E-cad以及ZO-1的表達(dá)量并沒有明顯的差異(P>0.05)。

si-SNHG11組中E-cad及ZO-1的表達(dá)量顯著高于si-NC組(t=3.15、3.34，P<0.05)；同時(shí)Vimentin以及α-SMA的表達(dá)量顯著低于si-NC組(t=3.30、13.44，P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)量比較

A、B、C、D、E分別為低糖對(duì)照組、高滲對(duì)照組、高糖干預(yù)組、 si-NC組、si-SNHG11組

3 討 論

RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層之間含有黑色素的單層多邊形上皮細(xì)胞，具有極為重要的生理功能，特別是作為外層BRB，在DR的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。目前，在DR發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究方面，RPE細(xì)胞的研究相對(duì)于視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞仍較少。ARPE-19細(xì)胞是目前最常用的人RPE細(xì)胞系，保持了RPE良好的特性。因此，本研究將ARPE-19細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行相關(guān)的研究。

當(dāng)機(jī)體在正常生理狀態(tài)下時(shí)，RRE細(xì)胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)發(fā)生炎癥、衰老或損傷等情況時(shí)，RPE細(xì)胞可經(jīng)歷上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程，細(xì)胞間的緊密連接被破壞，細(xì)胞發(fā)生遷移并聚集到鄰近的組織或器官[12-15]。以往的實(shí)驗(yàn)研究顯示，體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞可在生長因子TGF-β1、EGF或CTGF的作用下發(fā)生EMT[16-17]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高糖也可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞系的EMT，這可促進(jìn)纖維化因子的上調(diào)以及BRB的破壞[18]。RPE細(xì)胞間的緊密連接對(duì)BRB的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用，在糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸呀?jīng)證實(shí)ZO-1表達(dá)水平的降低可引起B(yǎng)RB的破壞[19]。BRB完整性的保持也是由于緊密連接和黏附連接之間相互作用的結(jié)果，這種相互作用由細(xì)胞和細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)，如E-cad[20]。本研究利用高糖刺激ARPE-19細(xì)胞建立高糖模型，并通過Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cad、ZO-1顯著下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、α-SMA顯著上調(diào)，證實(shí)高糖可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的EMT。劃痕實(shí)驗(yàn)以及CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的遷移以及增殖能力均顯著增強(qiáng)，這與CHE等[10]的研究結(jié)果一致。

近年來，LncRNA在視網(wǎng)膜疾病發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的關(guān)注，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)幾種LncRNA與常見視網(wǎng)膜疾病有密切關(guān)聯(lián)[21-22]。已證實(shí)LncRNAMALAT1在增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變中促進(jìn)RPE細(xì)胞增殖、遷移以及視網(wǎng)膜前膜形成[23-24]。LncRNAMIAT在糖尿病視網(wǎng)膜病變中促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[25]。SNHG11作為新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，已在多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中得到廣泛研究，包括肺癌[26]、結(jié)直腸癌[27]、腎癌[28]等。目前，尚無關(guān)于SNHG11在DR中相關(guān)作用的報(bào)道，本研究結(jié)果首次證明了SNHG11在高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT中發(fā)揮了重要作用。

本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中SNHG11的表達(dá)顯著上調(diào)，利用小干擾RNA敲低SNHG11以后，ARPE-19細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cad、ZO-1顯著上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin及α-SMA顯著下調(diào)，ARPE-19細(xì)胞的增殖及遷移能力均下降，EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)。由此猜測(cè)SNHG11是通過激活EMT的相關(guān)信號(hào)促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移。GENG等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，SNHG11作為膠質(zhì)瘤的癌基因，通過調(diào)控miR-154-5p促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。因此，推測(cè)SNHG11可能是通過靶向調(diào)控miR-154-5p促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的EMT，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

眾所周知，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，其遷移、增殖及抗凋亡的能力增強(qiáng)[29]。RPE細(xì)胞不受控制的增殖和遷移可導(dǎo)致神經(jīng)視網(wǎng)膜表面纖維增生性前膜的形成，BRB被破壞，繼而發(fā)生視網(wǎng)膜水腫、脫離或變性，最終導(dǎo)致視力損害[30-31]。此外，纖維增生性前膜的形成也是增生性DR的主要特征[32]。及時(shí)抑制RPE細(xì)胞增殖、遷移對(duì)保護(hù)BRB至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)敲低SNHG11可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的EMT，阻止細(xì)胞的增殖和遷移，但此研究結(jié)果僅限于細(xì)胞水平，后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，LncRNASNHG11參與了高糖誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞EMT的過程，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，敲低SNHG11可逆轉(zhuǎn)ARPE-19細(xì)胞的EMT，從而抑制細(xì)胞的增殖以及遷移，提示SNHG11在DR的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果為LncRNA在DR的預(yù)防和治療中發(fā)揮調(diào)控作用提供了更多的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。