聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針用于線粒體靶向和癌細胞識別研究進展

彭嘉琪， 陳 明*， 秦安軍， 唐本忠

(1． 暨南大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院， 廣東 廣州 510632；2． 華南理工大學(xué) 發(fā)光材料與器件國家重點實驗室， 廣東省分子聚集發(fā)光重點實驗室，華南理工大學(xué)-香港科技大學(xué)聯(lián)合研究院， 廣東 廣州 510640；3. 香港科技大學(xué) 化學(xué)系， 人體組織功能重建國家工程技術(shù)研究中心香港分中心， 中國 香港 999077)

1 引 言

癌癥是人類的主要致死病因之一。目前，大部分癌細胞只有在擴散到人體全身后才能被診斷，如果能在癌癥早期或癌細胞轉(zhuǎn)移之前確診，將會有效提高患者的治愈和生存幾率[1-2]。迄今為止，癌癥診斷技術(shù)包括身體檢查、活檢、影像學(xué)檢查和內(nèi)窺鏡檢查等，其中癌癥診斷影像技術(shù)主要有核磁共振成像、正電子發(fā)射型計算機斷層顯像、熒光成像和光聲成像等[3-6]。

相比而言，熒光成像具有靈敏度高、發(fā)射光譜多樣性、無創(chuàng)性、時空分辨率高、掃描速度快和實時監(jiān)控等優(yōu)點[7-9]，因此被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究。近年來，熒光成像在癌癥診斷中備受關(guān)注。而熒光染料則是熒光成像的核心。由于傳統(tǒng)的熒光染料具有聚集促使熒光猝滅(Aggregation-caused quenching,ACQ)效應(yīng)，它們只能在極低的濃度下使用，從而使其在成像時易受激發(fā)光刺激產(chǎn)生光漂白[10-11]。傳統(tǒng)熒光染料的這一缺陷嚴重限制了它們的超靈敏度分析和長期追蹤成像能力，阻礙了其在腫瘤成像中的應(yīng)用。2001年，Tang課題組提出了聚集誘導(dǎo)發(fā)光(Aggregation-induced emission,AIE)概念[12]。不同于ACQ分子，AIE熒光分子具有螺旋槳結(jié)構(gòu)和靈活的分子構(gòu)型，它們易在溶液中由于分子內(nèi)運動使得激子猝滅，從而不發(fā)光或只發(fā)射微弱的熒光；而在聚集狀態(tài)下由于分子內(nèi)運動受限，非輻射躍遷被抑制從而實現(xiàn)熒光增強[13-17]。AIE分子這種“越聚集越亮”的性質(zhì)使其能在高濃度下發(fā)揮作用，且具有出色的靈敏度和光穩(wěn)定性，從而有望用于生物長期示蹤分析識別和成像[18-21]。

目前，科學(xué)家們通常用熒光分子或納米粒子對腫瘤細胞的特異性標記物進行標靶來提高熒光染料對癌細胞的特異性識別[22-23]。雖然該方法可以提高探針對癌細胞和正常細胞成像的對比度，但探針染料設(shè)計、制備和純化過程均較為復(fù)雜，且無法診斷多種癌細胞系，因此不具有普適性。而線粒體作為細胞的能量工廠，在癌細胞和正常細胞中都是必不可少的。事實上，癌細胞與正常細胞的線粒體之間存在許多顯著差異(包括細胞器大小、數(shù)量和形狀、蛋白質(zhì)合成速率和細胞器周轉(zhuǎn)率、以及線粒體內(nèi)膜的多肽和脂質(zhì)分布等的不一致)[24-28]；此外，癌細胞中線粒體的膜電位相比于正常細胞中也會出現(xiàn)顯著提高[29-31]。因此，根據(jù)這些差異性設(shè)定一類識別癌細胞的通用靶標十分具有可靠性。本文對可用于特異性線粒體成像和癌細胞識別的AIE熒光探針從設(shè)計原理、成像應(yīng)用和機理研究三個方面進行系統(tǒng)概括和總結(jié)，并對其未來的發(fā)展方向作出了展望。

2 熒光探針的設(shè)計原理

可特異性標記線粒體的熒光探針的設(shè)計原理主要有在AIE分子上引入帶正電荷基團、主體-客體超分子相互作用以及制備表面修飾線粒體靶向基團的納米材料。

2.1 引入帶正電荷基團

線粒體的膜電位差容易吸引帶正電荷的分子富集在其內(nèi)部?；趲д姾苫鶊F的AIE分子一方面具有較好水溶性，增加其和細胞的相互作用；另一方面能夠優(yōu)先靶向細胞的線粒體，并實現(xiàn)熒光成像。目前，常見的用于修飾AIE分子的正電荷基團主要有三苯基膦鹽(TPP)、吡啶及吡啶衍生物鹽和花菁鹽等[32-37](圖1)。2013年，Tang等[32]使用TPP對四苯乙烯(TPE)進行功能化修飾得到了AIE分子TPE-TPP(圖2)。TPP通過其帶正電荷和親脂性促進分子探針進入線粒體，從而使TPE-TPP可以特異性靶向細胞線粒體。線粒體的微環(huán)境限制了TPE-TPP激發(fā)后的分子運動，從而使其發(fā)射熒光信號。這種成像信號相比于傳統(tǒng)的商業(yè)化染料如Mito Tracker具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性，展示了AIE熒光探針可用于長期細胞器示蹤成像的優(yōu)勢。盡管如此，TPE-TPP分子中的TPE和TPP單元之間通過亞甲基進行間隔，導(dǎo)致TPP并不能對TPE產(chǎn)生電子效應(yīng)，從而使TPE-TPP的發(fā)射僅源自于TPE的藍光。

圖1 線粒體靶向帶正電荷AIE探針設(shè)計示意圖

圖2 幾種常見AIE探針的分子結(jié)構(gòu)及其線粒體靶向成像(右圖內(nèi)標尺為20 μm)[34]

相比而言，具有長吸收和發(fā)射波長的熒光探針在減少激發(fā)光對組織的光損傷和避免生物自熒光等方面具有顯著的優(yōu)勢，因而備受科研工作者的關(guān)注[38-39]。Tang等[33]合成了TPE苯環(huán)直接含有吡啶鹽衍生物修飾的AIE化合物TPE-IQ(圖2)。TPE-IQ中的吡啶鹽是強吸電子基團，而TPE中的三苯乙烯部分具有弱的給電子性。這種弱的給受體(D-A)效應(yīng)誘使TPE-IQ發(fā)射綠光，且其可用于高選擇性的、點亮線粒體的熒光探針。Tang等[34]還通過在三苯乙烯單元上修飾給電子甲氧基，增強了D-A效應(yīng)，獲得了線粒體AIE探針TPE-IQ-2O(圖2)。TPE-IQ-2O在可見光區(qū)430 nm處有最大吸收峰。此外，相比于TPE-IQ，TPE-IQ-2O能夠發(fā)射較紅的黃色熒光。

通過在電子給受體間引入共軛π橋構(gòu)建D-π-A結(jié)構(gòu)，將有利于增強分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)并使化合物的發(fā)光波長紅移。Tang等[35]通過在TPE單元和吡啶鹽單元之間鍵接雙鍵得到了D-π-A結(jié)構(gòu)的AIE化合物TPE-Py(圖2)。TPE-Py中的雙鍵能夠有效增加分子共軛，促進ICT效應(yīng)，使化合物發(fā)射黃光。 此外，TPE-Py和TPE-IQ-2O具有類似的發(fā)光波長，說明調(diào)節(jié)電子給受體的電子效應(yīng)和增加π橋同樣能對分子的發(fā)光波長產(chǎn)生影響。作者進一步研究發(fā)現(xiàn)，得益于TPE-Py兼具親脂性和陽離子性，其能對活細胞中的線粒體進行特異性靶向熒光標記?；ㄝ见}是構(gòu)建近紅外花菁類染料常用的電子受體基團。Tang等[36]進而在TPE上修飾花菁鹽得到了AIE化合物TPE-Ph-In(圖2)。TPE-Ph-In相比于TPE-Py，分子內(nèi)除含有更強的電子受體之外，其給受體間的共軛π橋也更長，因此能夠發(fā)射670 nm的深紅光。此外，基于TPE-Ph-In強的ICT效應(yīng)，其具有較大的斯托克斯位移(約225 nm)，因此能夠有效避免傳統(tǒng)熒光染料存在的發(fā)射光自吸收問題。同時得益于紅光材料的成像優(yōu)勢，其能夠用于特異性靶向線粒體的高光穩(wěn)定性和高分辨率的熒光探針。

2.2 主體-客體超分子相互作用

主客體化學(xué)在超分子自組裝和熒光識別等方面具有顯著發(fā)展優(yōu)勢[40-42]。主體-客體分子間的主客體相互作用主要由氫鍵、親疏水作用和金屬-配體配位等驅(qū)動產(chǎn)生[43-44]。最近，Tang等[45]首次報道了通過主體-客體相互作用來構(gòu)建線粒體成像熒光探針。作者通過在TPE上修飾不同數(shù)目的吡啶鹽基團合成了一系列AIE化合物TPE-2EP、TPE-3EP和TPE-4EP。這3種AIE分子具有良好水溶性和較紅(約600 nm)的發(fā)光波長。此外，葫蘆[n]脲是一類理想的大環(huán)宿主分子，其疏水腔可以和各種大小、形狀的客體分子互補結(jié)合，形成具有良好生物相容性的組裝體[46-49]。在此基礎(chǔ)上，作者通過協(xié)調(diào)主客體之間相互作用，將TPE-2EP、TPE-3EP和TPE-4EP分別與葫蘆[8]脲組裝，形成了3種尺寸和形狀(球形或立方形)不一的納米級超分子組裝體TPE-2EP@CB[8]、TPE-3EP@CB[8]和TPE-4EP@CB[8](圖3)[45]。葫蘆[8]脲的疏水空腔不僅提供了容納AIE分子吡啶鹽支鏈的空間，而且使分子在激發(fā)之后的構(gòu)型松弛被抑制，從而使組裝體發(fā)射強熒光。此外，這些組裝體的發(fā)光行為還受化合物中吡啶鹽的數(shù)量影響。例如，三吡啶鹽化合物TPE-3EP和葫蘆[8]脲形成的組裝體發(fā)光效率最高，且相比于其溶液態(tài)熒光增強最為顯著。這些組裝體可實現(xiàn)對細胞溶酶體和線粒體的雙重成像。不同于先前報道的小分子熒光探針，這種組裝體將通過內(nèi)吞的方式進入細胞，進而富集在細胞器內(nèi)。而組裝體內(nèi)部或表面存在的吡啶鹽基團依然是誘導(dǎo)其進入線粒體的動因。因此，這項研究提供了一種新型構(gòu)建細胞器成像試劑的方式。

圖3 通過主客體相互作用構(gòu)建線粒體成像熒光探針示意圖[45]

2.3 表面修飾線粒體靶向基團的納米材料

AIE納米材料由于其高發(fā)光效率和極佳的抗光漂白性在熒光成像領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注。2016年，《自然》雜志評價AIE點(即AIE納米材料)和量子點、半導(dǎo)體聚合物點以及上轉(zhuǎn)化納米粒子是當今4種重要的生物納米成像材料[50]。AIE納米材料通常通過兩親性分子包裹AIE分子來制備。相比于小分子熒光探針，AIE納米材料中的AIE分子無需特性基團來修飾，這一方面降低了材料設(shè)計的繁瑣性，另一方面提供了結(jié)合其他功能(例如光動力治療、光聲成像和光熱治療等)的可能性[51-53]。Tian等[54]開發(fā)了一種基于DNA四面體結(jié)構(gòu)的納米熒光探針。其四面體的頂角分別修飾了TPP、對pH響應(yīng)的熒光素和對鈣離子響應(yīng)的碳點等功能組件。其中，TPP可以誘使納米探針靶向細胞線粒體，同時在超氧自由基和聚集β淀粉樣蛋白的刺激下使探針實現(xiàn)對pH和鈣離子的熒光檢測。這預(yù)示了通過在AIE納米材料表面直接修飾TPP等線粒體靶向基團，可便捷地得到靶向細胞線粒體的AIE納米熒光探針(圖4)。

圖4 線粒體靶向AIE納米探針設(shè)計示意圖[51]

3 線粒體靶向AIE探針的癌細胞識別

線粒體是真核生物細胞的能量工廠。據(jù)研究，腫瘤細胞中線粒體的代謝活性與正常細胞有明顯區(qū)別，因此可作為利用線粒體熒光探針來識別癌細胞的主要依據(jù)[55-56]。目前線粒體AIE探針在癌細胞識別方面的主要應(yīng)用有癌細胞與正常細胞區(qū)別成像、循環(huán)腫瘤細胞與白細胞區(qū)別成像以及癌細胞與相關(guān)細菌雙重靶向成像。

3.1 癌細胞與正常細胞區(qū)別成像

Tang等[34]以HeLa細胞作為模型研究發(fā)現(xiàn)TPE-IQ-2O能對其線粒體進行很好的染色，并且其成像信號可以和商業(yè)化染料Mito Tracker Red有很好的重疊，表明這種AIE染料具有極佳的成像選擇性。相反，這種AIE染料在相同條件下并不能富集在正常的COS-7細胞的線粒體內(nèi)，因此不呈現(xiàn)成像信號。這表明基于線粒體成像的AIE熒光探針具有區(qū)分正常細胞與癌細胞的巨大潛力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TPE-IQ-2O同樣可對MCF-7、PC-9、MDA-MB-231和A549等其他癌細胞的線粒體進行靶向成像，而對于HEK-293和MDCK-Ⅱ正常細胞卻沒有染色效果。此外，在正常細胞和癌細胞共培養(yǎng)的體系中，TPE-IQ-2O只能選擇性地點亮癌細胞(圖5)。因此。TPE-IQ-2O是一種基于線粒體成像并且可廣泛區(qū)分癌細胞和正常細胞的熒光探針，從而在成像介導(dǎo)的腫瘤手術(shù)中(可用于判斷腫瘤殘余是否完全清除)具有極大用途。

圖5 (a)～(h)TPE-IQ-2O對常見癌細胞和正常細胞的線粒體成像，HeLa細胞和COS-7細胞成像圖片中標尺相同，其余細胞成像標尺相同；(i)TPE-IQ-2O對不同種類細胞線粒體成像的相對熒光強度；(j)～(m)TPE-IQ-2O用于癌細胞和正常細胞的區(qū)分成像[34]。

Tang等[57]合成了十二碳烷基鏈修飾的吡啶鹽類線粒體探針I(yè)VPI-12。IVPI-12中的長烷基鏈可以和線粒體膜的脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生強的疏水相互作用，因此可以在不考慮線粒體膜電位變化的前提下，長期靶向線粒體。盡管如此，IVPI-12中的碘離子由于其重原子效應(yīng)會導(dǎo)致熒光猝滅，從而降低探針的成像效果。為此，Tang等[58]通過縮短烷基鏈長度和用六氟磷酸根離子置換碘離子制備了AIE分子IVP-02(圖6(a))。IVP-02對癌細胞和正常細胞有非常好的區(qū)分能力：通過將不同癌細胞和不同正常細胞共培養(yǎng)并用IVP-02染色發(fā)現(xiàn)只有癌細胞(A549和HeLa細胞)中的線粒體被點亮，而正常細胞(COS-7和HLF細胞)幾乎沒有熒光信號(圖6(b))。為了更為精準地探查IVP-02對癌細胞的選擇性，作者分別將帶有癌細胞(A549細胞)和正常細胞(HLF細胞)的蓋玻片放于同一培養(yǎng)皿中，并同時使用IVP-02染色，結(jié)果顯示只有帶有癌細胞的玻璃片上的細胞才能被點亮，而帶有正常細胞的玻璃片仍無熒光信號(圖6(c))。以上結(jié)果表明IVP-02可以選擇性標記癌細胞的線粒體，從而實現(xiàn)癌細胞與正常細胞的區(qū)分。

圖6 (a)IVP-02及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)；(b)～(c)IVP-02用于區(qū)分癌細胞與正常細胞的成像。圖中標尺為50 μm[58]。

Tang等還發(fā)現(xiàn)TPE-2EP@CB[8]、TPE-3EP@CB[8]和TPE-4EP@CB[8]組裝體的大小和形狀對線粒體成像的效果有明顯的影響(圖7(a))[45]。其中，TPE-2EP@CB[8]組裝體的尺寸最小(200～250 nm)，易于和T24癌細胞作用，具有最佳的成像效果。TPE-3EP@CB[8]和TPE-4EP@CB[8]組裝體的尺寸相接近(400～500 nm)，但二者的形狀分別為球形和立方形。由于球形納米體相比于立方形納米體更易于進入細胞，因此TPE-3EP@CB[8]具有較好的成像效果。此外，對于同一種組裝體，它們對于不同細胞系(包括SV-HUC-1正常細胞、T24和UMUC3癌細胞、DU145和HeLa轉(zhuǎn)移癌細胞)具有不同的成像效果。這種成像強度的差別不僅體現(xiàn)在單獨的不同的細胞系上，還體現(xiàn)在不同比例的混合細胞系上，因此可作為辨別它們的“指紋”信號。利用3種組裝體的成像信號，結(jié)合線性判別分析，作者繪制了分類模式圖(圖7(b)～(d))。這種模式圖不僅可以對不同的正常細胞、癌細胞和轉(zhuǎn)移癌細胞進行分類，還可以半定量鑒別不同癌細胞混合體系以及正常細胞和癌細胞混合體系中各組分的含量(在圖中顯示為各自信號區(qū)域獨立且不重疊)。因此，該項工作對臨床癌癥診斷、術(shù)后腫瘤清除程度的評價和細胞系種類及污染程度的鑒定等方面具有極大的幫助。

圖 7 (a)TPE-2EP@CB[8]、TPE-3EP@CB[8]和TPE-4EP@CB[8]主客體復(fù)合物的線粒體成像，圖中標尺為10 μm；基于成像強度和大數(shù)據(jù)分析鑒別不同的癌細胞(b)、混合癌細胞中各組分(c)以及混合的正常細胞和癌細胞各組分(d)[45]。

3.2 循環(huán)腫瘤細胞與白細胞區(qū)別成像

循環(huán)腫瘤細胞存在于癌癥患者的血液中，被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”，循環(huán)腫瘤細胞的定量分析將有利于癌癥治療的反應(yīng)評估和后續(xù)復(fù)發(fā)監(jiān)測[59]。而白細胞是血液中最豐富的真核細胞，因此區(qū)分白細胞和循環(huán)腫瘤細胞在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有實際意義。而正常細胞和癌細胞中線粒體由于膜電位存在差異，能對帶正電荷的線粒體探針產(chǎn)生不同的親和性，因此可設(shè)計靶向線粒體的熒光探針用于區(qū)分白細胞和循環(huán)腫瘤細胞。Zheng等[60-61]通過用一種由TPE和吡啶疊氮鹽組成的具有AIE活性的線粒體熒光探針TPE-PyN3(圖8(a))，實現(xiàn)了在生命系統(tǒng)中的循環(huán)腫瘤細胞識別和無創(chuàng)成像，在腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和藥物學(xué)等研究領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用前景。作者采用TPE-PyN3在相同條件下分別對從血液中分離出的白細胞和7種不同的癌細胞(包括H1975、A549、SMMC-7721、HepG2、HT-29、MCF-7和HeLa細胞)染色后發(fā)現(xiàn)，僅白細胞顯示出微弱的熒光信號，而7種癌細胞均發(fā)射明亮的黃色熒光(圖8(b))[61]。這種熒光差異表明TPE-PyN3具有在白細胞中區(qū)分癌細胞的潛力。作者隨后在白細胞中摻入少量癌細胞來模擬真實樣品環(huán)境。作者將已知數(shù)目的H1975癌細胞預(yù)先使用綠色熒光染料5-氯甲基二乙酸熒光素(CMFDA)標記，隨后加入到白細胞中使用TPE-PyN3和反CD45抗體(一種白細胞的檢測物)進行共染色標記。實驗發(fā)現(xiàn)，CMFDA和TPE-PyN3的綠色熒光和黃色熒光信號可在H1975細胞中同時被發(fā)現(xiàn)。而白細胞主要發(fā)射CD45的紅色熒光(有少量白細胞發(fā)射比較弱的TPE-PyN3的黃色熒光)。這說明TPE-PyN3能夠較好地識別和區(qū)分真實環(huán)境中的癌細胞(圖8(c))。相較于常規(guī)循環(huán)腫瘤細胞鑒定方法，使用TPE-PyN3進行活細胞標記操作簡單、成本低廉、對細胞生存力和完整性影響小，可以在單細胞水平上對癌細胞進行高質(zhì)量分析，因此為鑒定不同類型的低含量循環(huán)腫瘤細胞提供了新的方法。

圖8 (a)TPE-PyN3的分子結(jié)構(gòu)；(b)TPE-PyN3對于白細胞和不同癌細胞的區(qū)分成像；(c)模擬真實樣品環(huán)境中對于H1975癌細胞的識別。圖中標尺為50 μm[61]。

3.3 癌細胞和相關(guān)細菌與正常細胞的區(qū)分成像

據(jù)研究，腫瘤微環(huán)境存在的細菌會通過代謝化療藥物和調(diào)節(jié)癌細胞自噬降低癌癥的治療效率[62-63]。此外，某些革蘭氏陽性菌(如梭形桿菌)會促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，而一些革蘭氏陽性菌(如葡萄球菌和鏈球菌)則容易引起手術(shù)部位感染，從而影響術(shù)后的治愈[64-65]。因此，能夠同時檢測和區(qū)分癌細胞和革蘭氏陽性菌具有重要臨床意義。Tang等[66]設(shè)計合成了一種帶吡啶鹽的AIE分子TPPCN(圖9(a))。作者首先將HeLa癌細胞和MDCK-Ⅱ正常細胞在同一培養(yǎng)皿中進行共培養(yǎng)，然后使用TPPCN染色，結(jié)果顯示HeLa細胞的線粒體發(fā)射強的藍綠色熒光，而在MDCK-Ⅱ細胞中幾乎未檢測到熒光信號。這證明了TPPCN可實現(xiàn)癌細胞與正常細胞的區(qū)分。由于革蘭氏陽性菌相較于革蘭氏陰性菌具有更簡單的薄膜結(jié)構(gòu)且異物屏障效果較弱，TPPCN將更傾向于進入革蘭氏陽性菌，從而實現(xiàn)兩類細菌的區(qū)分。作者將TPPCN和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌與革蘭氏陰性大腸桿菌共同培育，結(jié)果顯示前者被染色并發(fā)射藍綠色熒光，而后者幾乎未觀察到熒光信號，因此TPPCN同時具有區(qū)分革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的能力。最后，作者進一步研究了TTPCN同時成像癌細胞和革蘭氏陽性細菌的能力。作者將HeLa細胞、MDCK-Ⅱ正常細胞和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌在同一培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)并用TPPCN染色，結(jié)果顯示在HeLa細胞和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌中均可以檢測到藍綠色熒光，而在MDCK-Ⅱ正常細胞中仍檢測不到熒光信號(圖9(b)～(d))，證明TPPCN確實可以同時實現(xiàn)對癌細胞和革蘭氏陽性細菌的雙重靶向成像。該項研究不僅驗證了AIE分子區(qū)分癌細胞和正常細胞的能力，同時將其擴展到了革蘭氏陽性細菌的標記，可促進對癌癥診斷和治療中癌細胞和相關(guān)細菌的檢測。

圖9 (a)TPPCN的分子結(jié)構(gòu)；(b)～(d)TPPCN用于同時區(qū)分HeLa細胞和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌[66]。

4 靶向癌細胞線粒體機理研究

AIE熒光探針特異性標記癌細胞線粒體的機理研究主要從線粒體膜電位差異和熒光探針本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行總結(jié)分析。

4.1 線粒體膜電位影響

與正常細胞相比，癌細胞具有更高的線粒體膜電位，當細胞代謝活躍時，線粒體膜電位至少相差60 mV[67]。Tang等[34]通過對照實驗證明了癌細胞線粒體膜電位更高是AIE熒光探針主要富集在其中的主要原因之一。作者先用羰基氰化間氯苯基腙(CCCP)對HeLa細胞進行預(yù)處理使其線粒體膜電位降低，然后通過TPE-IQ-2O染色只觀察到比較弱的熒光(圖2)。此外，對HeLa細胞先染色后再用CCCP處理也會出現(xiàn)熒光減弱的現(xiàn)象。相反，當使用寡霉素對HeLa細胞預(yù)處理使其膜電位升高時，細胞可以呈現(xiàn)較強的熒光發(fā)射。另外，死亡的HeLa細胞由于不存在膜電位幾乎不發(fā)射熒光。這一系列現(xiàn)象表明線粒體膜電位的高低將顯著影響AIE熒光探針與HeLa細胞之間的靜電相互作用，進而用于對癌細胞和正常細胞的區(qū)分(圖10)。同時，癌細胞和正常細胞這種膜電位的差別也證實了對于帶正電荷的AIE探針的需求。作者研究了5種帶正電荷的具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的AIE探針，發(fā)現(xiàn)探針對癌細胞和正常細胞的區(qū)分主要和其上的正電荷基團相關(guān)，而受探針其他部位化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較小。

圖10 癌癥細胞和正常細胞線粒體膜電位差異示意圖[34]

4.2 熒光探針本身化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

據(jù)報道，某些對線粒體膜電位很敏感的商業(yè)線粒體探針可同時染色癌細胞和正常細胞[68]，因此膜電位不是熒光探針區(qū)分癌細胞和正常細胞的唯一原因，探針的膜通透性也是其區(qū)別成像的重要因素之一。Tang等[58]基于IVP-02在吡啶鹽或吲哚一側(cè)延長烷基鏈得到了IVP-04、IVP-06、IVP-22、IVP-42和IVP-62五種AIE衍生物(圖6(a))。分子中烷基鏈的位置及長度將會影響其與線粒體脂質(zhì)雙分子層的相互作用，從而調(diào)節(jié)對膜的通透性。

作者通過使用這6種熒光探針對共培養(yǎng)的COS-7正常細胞和A549癌細胞染色，發(fā)現(xiàn)只有IVP-02、IVP-22、IVP-42和IVP-62能使A549癌細胞發(fā)射成像信號，說明它們可以明顯區(qū)分癌細胞和正常細胞，而IVP-04和IVP-06卻能同時染色A549癌細胞和COS-7正常細胞，因此無法實現(xiàn)癌細胞篩選標記?；谶@些成像結(jié)果，作者得出IVP分子對癌細胞的選擇性主要由吡啶鹽側(cè)烷基鏈的長度決定，且延長該位點烷基鏈的長度將會消除探針對癌細胞的特異性選擇。

圖11 親脂性陽離子通過膜示意圖[58]

由于這些IVP分子中均含有帶吡啶鹽的正電荷基團，該側(cè)更為親水，因此將會富集更多的水分子，從而決定離子半徑。IVP-04和IPV-06相比于其余分子，擁有更長的吡啶鹽側(cè)烷基鏈，使得它們的離子半徑增大，從而減弱與水分子之間的相互作用(即增強了與脂質(zhì)雙分子層疏水相互作用)，因此它們能無選擇性地同時染色正常細胞和癌細胞(圖11)。

5 結(jié)論與展望

熒光成像技術(shù)是癌癥診斷的重要手段之一。AIE探針由于其獨特的光物理性質(zhì)，可提高其成像的靈敏度和光穩(wěn)定性，因此有望用于長期示蹤生物分析識別和成像。根據(jù)線粒體膜電位在癌細胞和正常細胞中的差異，設(shè)計帶三苯基膦鹽、吡啶及吡啶衍生物鹽和花菁鹽等正電荷基團的AIE分子有利于增加探針和癌細胞線粒體膜的靜電相互作用，提高對癌細胞的識別效果。此外，通過主客體相互作用和納米粒子外修飾法也可得到用于對癌細胞區(qū)別成像的AIE納米熒光探針。這些熒光探針可實現(xiàn)對癌細胞與正常細胞、循環(huán)腫瘤細胞與白細胞以及癌細胞和相關(guān)細菌與正常細胞的區(qū)別成像，因此在癌癥診斷、手術(shù)導(dǎo)航、癌癥治療的反應(yīng)評估及后續(xù)復(fù)發(fā)監(jiān)測和細胞污染評估等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，除了膜電位的影響外，AIE探針本身的結(jié)構(gòu)對區(qū)分癌細胞與正常細胞也有明顯影響：當鹽類基團外延的烷基鏈延長時，將會增大探針的離子半徑，增加探針與脂質(zhì)雙分子層的疏水相互作用，從而不利于針對膜電位差異區(qū)分癌細胞與正常細胞。

雖然線粒體靶向AIE探針在識別癌細胞方面的研究取得了長足進步，但仍有許多發(fā)展空間，其未來的發(fā)展屬于挑戰(zhàn)與機遇并存。例如，進一步提高熒光探針的靈敏度有利于增強對微量癌細胞/微小腫瘤的識別；提高熒光探針的藥物活性可以達到診斷與治療的雙重效果；而開發(fā)具有近紅外吸收/發(fā)射的熒光探針，并結(jié)合雙光子/三光子激發(fā)技術(shù)，將會大大提高熒光探針的成像深度，促進成像應(yīng)用。我們堅信，通過國內(nèi)外眾多科學(xué)家的不懈堅持和努力，這類AIE熒光探針必將得到進一步優(yōu)化升級，最終滿足臨床診斷成像，造福人類。