生物催化法制備低聚半乳糖的研究進(jìn)展

何乃瑩,竺勝權(quán),黃 金

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

隨著社會(huì)發(fā)展和人類膳食結(jié)構(gòu)的變化,人們對(duì)肉類、乳制品攝入量不斷增加,而谷物類食品的攝入量卻漸次減少。膳食結(jié)構(gòu)的變化直接導(dǎo)致了高血壓、糖尿病以及各種口腔和消化系統(tǒng)疾病的激增。且伴隨著社會(huì)老齡化的日益加重,人們對(duì)功能性食品和保健食品的需求將不斷增加。低聚半乳糖作為典型的功能性食品添加劑,因其具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和出色的生理功效,而極具科學(xué)研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。

1 低聚半乳糖簡(jiǎn)介及其生理功效

1.1 低聚半乳糖簡(jiǎn)介

益生元(Prebiotics)是一類能被雙歧桿菌和乳酸菌選擇性利用,促進(jìn)宿主健康的非消化性食品組分,對(duì)維持腸道菌群平衡有著重要作用,而擁有“最佳”的腸道菌群可增強(qiáng)肌體對(duì)致病菌的抵抗力,降低血氨質(zhì)量分?jǐn)?shù),增強(qiáng)免疫,降低患癌風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)作為一種功能性低聚糖,是益生元家族中的一員,近年來(lái)倍受關(guān)注[3-5]。低聚半乳糖由2～10個(gè)半乳糖基和一個(gè)末端葡萄糖基組成,結(jié)構(gòu)式為(Galactose)n-Glucose。另外,兩個(gè)半乳糖基組成的半乳二糖也被認(rèn)為是低聚半乳糖的一種。低聚半乳糖在自然界中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少,僅在母乳和一些水果蔬菜中少量存在,其具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和出色的生理功效,非常適宜于作為添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)[6]。此外,低聚半乳糖的安全性也得到了廣泛認(rèn)證,如日本已將低聚半乳糖視為特定的健康食品(FOSHU),美國(guó)將其認(rèn)為是公認(rèn)安全使用物質(zhì)(GRAS)[7],中國(guó)則將其定義為營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑和新資源食品。因此,低聚半乳糖在諸如嬰幼兒配方奶粉、發(fā)酵乳、糖果產(chǎn)品、烘焙食品、家畜飼料和寵物食品等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,市場(chǎng)前景廣闊。

1.2 低聚半乳糖的理化性質(zhì)及其生理功效

1.2.1 理化性質(zhì)

商品化的低聚半乳糖外觀呈半透明的微黃色至無(wú)色,甜度適中,一般為蔗糖的0.3～0.6倍,黏度類似于高果糖漿,熱值較蔗糖低,一般低于蔗糖熱值的50%,由于低聚半乳糖中含有許多親水基團(tuán),具有良好的水溶性和持水力,保濕能力強(qiáng)。此外,由于其結(jié)構(gòu)中含有許多不易被水解的β-(1→3),β-(1→4)和β-(1→6)糖苷鍵,在高溫以及寬pH范圍內(nèi)均具有較高的穩(wěn)定性,如在溫度37 ℃和pH 2條件下可幾個(gè)月內(nèi)維持穩(wěn)定,在中性pH 7和溫度160 ℃或pH 3和溫度120 ℃條件下處理10 min,仍能保持理化性質(zhì)穩(wěn)定。

1.2.2 生理功效

1)非消化性。非消化性是某種組分能被定義為益生元所需具備的要素之一[1],低聚半乳糖由于其糖單元間含有許多不易水解的β-半乳糖苷鍵,除極少部分二糖外一般不能被肌體的消化酶所消化吸收。有研究表明[8-9]:低聚半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過90%就不會(huì)被胃和小腸消化吸收,而是直接進(jìn)入結(jié)腸;另有體外實(shí)驗(yàn)表明低聚半乳三糖和低聚半乳四糖不能被人體唾液中的α-淀粉酶、人工胃液和豬胰腺α-淀粉酶水解,僅有少部分二糖可以被大鼠腸道內(nèi)含有的酶消化。另外,低聚半乳糖的熱值很低,僅5～8 kJ/g。基于此,低聚半乳糖可以作為糖尿病人以及肥胖病人食品的甜味劑和填充劑。

2)促進(jìn)益生菌增殖。低聚半乳糖可以被雙歧桿菌和乳酸菌選擇性利用從而促進(jìn)益生菌增殖,抑制有害菌生長(zhǎng),維持腸道菌群平衡。Davis等[10]研究了低聚半乳糖劑量對(duì)于雙歧桿菌的影響,發(fā)現(xiàn)日攝入含有5 g及以上低聚半乳糖的咀嚼糖果,連續(xù)3周攝入,就會(huì)產(chǎn)生明顯的雙歧桿菌增殖效應(yīng);常金金等[11]研究了斷奶仔豬日糧中添加2%的低聚半乳糖可增加仔豬腸道乳酸桿菌相對(duì)豐度,改善腸道微生物組成。

3)促進(jìn)礦物質(zhì)吸收。雙歧桿菌等益生菌可利用低聚半乳糖產(chǎn)生弱酸性的短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸和異丁酸等)和乳酸,會(huì)降低腸道pH,促進(jìn)鈣、鐵離子吸收,預(yù)防骨質(zhì)疏松[7,11-12]。

4)預(yù)防齲齒。低聚半乳糖不能被口腔鏈球菌利用,可以減少口腔鏈球菌的產(chǎn)生,達(dá)到預(yù)防齲齒的作用。同時(shí),低聚半乳糖又具有甜度,可以將其應(yīng)用于兒童食品甜味劑或生產(chǎn)防齲齒糖果中,降低兒童齲齒的發(fā)生率。

5)預(yù)防、治療便秘。低聚半乳糖被雙歧桿菌發(fā)酵分解后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸及CO2,H2和CH4等氣體,能刺激腸道的蠕動(dòng),增加糞便的濕潤(rùn)度,防止便秘的發(fā)生。

6)其他。低聚半乳糖在免疫機(jī)制調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制腫瘤細(xì)胞生成等方面也發(fā)揮著重要作用[12-14]。低聚半乳糖亦被發(fā)現(xiàn)可以選擇性刺激人皮膚上的“有益”細(xì)菌,同時(shí)其作為化妝品添加劑,具有一定的保濕功效和祛痘功效[15]。另外,研究發(fā)現(xiàn)了腸道菌群環(huán)境的改變,可能導(dǎo)致抑郁癥、肥胖癥、阿爾茲海默病和帕金森氏病等疾病的發(fā)生。由于低聚半乳糖有益腸道菌群調(diào)節(jié),其生理功效也引起制藥領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注。

2 低聚半乳糖的制備

目前,國(guó)內(nèi)外研究表明:低聚半乳糖的制備方法主要有從天然原料(如天然多糖的酸水解)中提取、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法(生物催化法)。由于天然原料中低聚半乳糖的含量很低,如蜂蜜、一些水果蔬菜和動(dòng)物乳汁中含有微量的低聚半乳糖,且只有母乳中含量稍多,因此從天然原料中提取大量低聚半乳糖并不現(xiàn)實(shí),天然多糖酸水解時(shí),低聚半乳糖產(chǎn)率不高,且水解產(chǎn)物成分復(fù)雜,含有大量的其他非功能性單/寡糖,分離純化困難,不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法制備低聚半乳糖污染大,成本高,生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益均不高,也不適合工業(yè)化生產(chǎn)。低聚半乳糖合成方法中研究較多的是發(fā)酵法和酶法合成,而酶(β-半乳糖苷酶)法制備以其特異性的轉(zhuǎn)糖基活性優(yōu)點(diǎn),成為目前工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法[16-17]。

2.1 酶法合成低聚半乳糖的機(jī)理

β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的機(jī)理為

其中:E為β-半乳糖苷酶;ROH為糖基受體。

β-半乳糖苷酶利用其水解活性將底物乳糖分解為半乳糖基和葡萄糖基,再利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性將半乳糖基轉(zhuǎn)移至不同的受體,當(dāng)半乳糖基的受體為水時(shí),形成半乳糖,當(dāng)半乳糖基的受體為其他糖基受體時(shí),則形成低聚半乳糖。因此,β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反應(yīng)是一個(gè)伴隨著水解與合成的動(dòng)力學(xué)控制反應(yīng)[18]。

2.2 β-半乳糖苷酶、來(lái)源及其合成低聚半乳糖

2.2.1β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23),別稱乳糖酶,是一類能水解β-半乳糖苷鍵的糖苷水解酶類[4,19],已應(yīng)用于食品、生物傳感器和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域。在食品工業(yè)領(lǐng)域,通常利用β-半乳糖苷酶的水解活性來(lái)降解乳制品中的乳糖,生產(chǎn)低乳糖乳制品,改善乳制品的消化率、溶解度、甜度和風(fēng)味等,并降低乳糖帶來(lái)的乳糖不耐受癥狀的風(fēng)險(xiǎn)[4]。研究表明:世界上有將近70%的成人患有乳糖不耐受癥[8],此外也可以將其用于乳清廢水的處理以減少環(huán)境污染[20-21]。在生物傳感器領(lǐng)域,也有一些β-半乳糖苷酶被應(yīng)用于生物傳感器中用來(lái)檢測(cè)乳制品中的乳糖[22]。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,編碼β-半乳糖苷酶基因(lacZ)經(jīng)常被用作報(bào)告基因,用于監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染率[4]。更為有趣的是,β-半乳糖苷酶除了具有水解活性外,部分來(lái)源的β-半乳糖苷酶還具有轉(zhuǎn)糖基活性,可用來(lái)合成作為益生元的低聚半乳糖,是其在食品工業(yè)上的又一主要用途。

2.2.2β-半乳糖苷酶的來(lái)源

β-半乳糖苷酶的來(lái)源十分廣泛,其主要來(lái)源有:1)植物來(lái)源。如擬南芥、番茄、草莓、甜椒、蘋果、芒果和香蕉等[23];2)動(dòng)物來(lái)源。主要存在于幼小哺乳動(dòng)物的小腸中;3)微生物來(lái)源。細(xì)菌(如大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌等)、霉菌(如米曲霉、黑曲霉和青霉等)、酵母(如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母等)和放線菌(如天藍(lán)色鏈霉菌)[5,8]。動(dòng)植物來(lái)源的β-半乳糖苷酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少,且分離提取困難,不適合工業(yè)化生產(chǎn);而微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶以其產(chǎn)量高、成本低和周期短等優(yōu)點(diǎn),成為工業(yè)化生產(chǎn)的主要來(lái)源,黑曲霉、米曲霉、克魯維酵母、雙歧桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌為β-半乳糖苷酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要酶源[5,24]。不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶在其蛋白序列、分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)以及酶學(xué)性質(zhì)等方面差異顯著,依據(jù)β-半乳糖苷酶蛋白序列的相似性,搜索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)CAZy(http://www.cazy.org/),β-半乳糖苷酶可被細(xì)分為GH1,GH2,GH35,GH42,GH59和GH147等多個(gè)糖苷水解酶家族。已報(bào)道具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的有GH1,GH2,GH35以及GH42家族,不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶家族及活性特征如表1所示。

表1 不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶家族及活性特征

2.2.3β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖

近年來(lái),隨著低聚半乳糖的益生效果逐漸被人們所熟知,有關(guān)低聚半乳糖的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。目前,國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的報(bào)道。β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的方式主要有利用野生菌β-半乳糖苷酶粗酶或純酶[32-33]、重組β-半乳糖苷酶[34-35]、微生物全細(xì)胞或滲透化細(xì)胞[30-36]、固定化酶或細(xì)胞[37,29]來(lái)催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖基過程,實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖的生物催化法制備。采用游離酶合成低聚半乳糖的優(yōu)點(diǎn)是游離酶直接參加反應(yīng),產(chǎn)物純度高、易純化;缺點(diǎn)是酶用量大,穩(wěn)定性不高。此外,野生菌的β-半乳糖苷酶分離純化困難,成本高,但生物安全性高,而重組工程菌的β-半乳糖苷酶較野生酶更為簡(jiǎn)單易得。固定化酶合成低聚半乳糖較游離酶穩(wěn)定性高,且能重復(fù)利用,是低聚半乳糖工業(yè)化生產(chǎn)研究的焦點(diǎn)。

由于β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反應(yīng)是伴隨著水解與合成的動(dòng)力學(xué)控制反應(yīng),β-半乳糖苷酶的性質(zhì)(酶源)對(duì)低聚半乳糖生物催化法高效制備至關(guān)重要,如低聚半乳糖的產(chǎn)率、聚合度和成鍵類型等都取決于β-半乳糖苷酶的性質(zhì)[5]。目前,商業(yè)化合成低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶主要來(lái)源于環(huán)狀芽孢桿菌、米曲霉和乳酸克魯維酵母等[5,20]。來(lái)源于環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反應(yīng)溫度為40～60 ℃,pH接近6,產(chǎn)率為40%;米曲霉來(lái)源的β-半乳糖苷酶的最佳反應(yīng)溫度為40～60 ℃,最適pH為4.5,低聚半乳糖的產(chǎn)率接近30%,且相對(duì)于環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶而言在酶制備工藝上更為便捷;乳酸克魯維酵母來(lái)源的β-半乳糖苷酶反應(yīng)溫度則為35～40 ℃,pH為6.5,低聚半乳糖產(chǎn)率為30%左右。此外,來(lái)源于乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶其水解活性較強(qiáng),更適宜于乳糖水解而非低聚半乳糖的合成[5]。

另?yè)?jù)報(bào)道,不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶蛋白三維立體結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)制存在差異,對(duì)水和糖具有不同的選擇性,反應(yīng)條件不同,從而導(dǎo)致低聚半乳糖的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)也會(huì)有所不同(即β-半乳糖苷酶的來(lái)源,決定了GOS的產(chǎn)量、產(chǎn)物組成和類型)[38]。如Huang等[29]將來(lái)源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌[39-40]的兩段β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行異源表達(dá),并進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基活性和水解活性考察,獲得高活性β-半乳糖苷酶,該酶在反應(yīng)溫度為37 ℃,初始乳糖質(zhì)量濃度為400 g/L,反應(yīng)pH為7.5,加酶量為10 U/g乳糖,反應(yīng)時(shí)間為48 h的條件下,低聚半乳糖產(chǎn)率為45%左右,產(chǎn)物質(zhì)量濃度達(dá)到178 g/L(包括異乳糖、低聚半乳二糖、三糖和四糖)。朱五二等[41]以來(lái)源于鹽單胞菌S62β-半乳糖苷酶為研究對(duì)象,在反應(yīng)溫度為40 ℃,初始乳糖質(zhì)量濃度為300 g/L,反應(yīng)pH為7.0,加酶量為50 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為6 h的條件下,低聚半乳糖產(chǎn)率為42%左右,產(chǎn)物包括異乳糖、半乳二糖、2種低聚半乳三糖及2種低聚半乳四糖。Rodriguez-colins等[42]利用來(lái)自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶,在初始乳糖質(zhì)量濃度為400 g/L,反應(yīng)pH 7.0,反應(yīng)溫度40 ℃,加酶量為1.2～1.5 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為6 h的條件下,低聚半乳糖最大產(chǎn)量為177 g/L,乳糖轉(zhuǎn)化率為76%,產(chǎn)物包括雙糖6-半乳二糖、異乳糖和6-半乳糖基-乳糖等。Urrutia等[43]利用來(lái)自米曲霉的β-半乳糖苷酶,在反應(yīng)溫度為40 ℃,初始乳糖質(zhì)量濃度為400 g/L,反應(yīng)pH為4.5,加酶量為15 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為7 h的條件下,GOS最大質(zhì)量濃度為107 g/L(占糖總量的26.8%),相當(dāng)于大約70%的乳糖轉(zhuǎn)化率,產(chǎn)物包括半乳糖、3-O-β-半乳糖基葡萄糖和6′-O-β-半乳糖基-乳糖等。Yanahira等[44]利用來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶,在反應(yīng)溫度為60 ℃的條件下,將該酶(275 U)加入含有乳糖(55 g)的溶液(45 mL)中(pH為6.0),反應(yīng)23 h,產(chǎn)物有11種低聚糖(包括3種二糖和8種三糖)分別為β-D-Galp-(1→3)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-D-Glc,β-D-Galp-(1→2)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→2)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→3)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→2)-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-[β-D-Galp-(1→2)]-D-Glc,β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→6)-D-Glc,β-D-Galp-(1→6)[β-D-Galp-(1→3)]-D-Glc。不同來(lái)源β-半乳糖苷酶進(jìn)行GOS生物催化制備工藝的研究結(jié)果如表2所示。

表2 不同來(lái)源β-半乳糖苷酶生物催化制備GOS

除β-半乳糖苷酶自身的酶學(xué)性質(zhì)外,催化條件初始乳糖濃度和反應(yīng)溫度也是生物催化法制備低聚半乳糖的關(guān)鍵因素。高于質(zhì)量與體積比為30%的初始乳糖濃度有利于合成反應(yīng),即有益于提高低聚半乳糖產(chǎn)率[50]。然而,乳糖的溶解度較其他糖類弱,溫度為30 ℃時(shí)溶解度僅為25%的水,40 ℃時(shí)也僅為33%的水,雖然可以通過過飽和的方式來(lái)獲得高濃度的乳糖溶液,但過飽和溶液不穩(wěn)定,乳糖容易析出,因此提高轉(zhuǎn)化體系溫度不僅可以獲得更高的底物(乳糖)初始投料質(zhì)量濃度,也有利于提高低聚半乳糖的合成效率。與此同時(shí),過高的反應(yīng)溫度容易造成催化劑β-半乳糖苷酶的變性失活,通過篩選或分子定向進(jìn)化獲得耐高溫β-半乳糖苷酶提高低聚半乳糖的合成效率(轉(zhuǎn)化體系底物投料比、產(chǎn)物時(shí)空得率和產(chǎn)物純度等),是酶法合成低聚半乳糖研究的又一熱點(diǎn)問題。目前,國(guó)內(nèi)外研究[8]發(fā)現(xiàn)來(lái)自硫磺礦硫化葉菌、激烈火球菌、棲熱菌屬細(xì)菌、嗜鈣熱單胞菌、解糖葡萄球菌和海棲熱袍菌等超嗜熱微生物的糖苷水解酶,具備在80 ℃或更高溫度下催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的能力,有益于提高生物催化法制備低聚半乳糖的產(chǎn)率。

3 酶法合成的低聚半乳糖分離純化

迄今為止,產(chǎn)率低仍是生物催化法制備低聚半乳糖工業(yè)化生產(chǎn)的短板,針對(duì)β-半乳糖苷酶介導(dǎo)的酶法合成路線,低聚半乳糖收率通常在20%～45%(對(duì)應(yīng)于40%～60%的底物乳糖轉(zhuǎn)化率),而通過生物催化劑或過程工程技術(shù)優(yōu)化大幅提高低聚半乳糖產(chǎn)率的嘗試還未見成功的案例,因此去除酶法合成路線最終轉(zhuǎn)化液中未反應(yīng)的乳糖和水解后未被聚合的單糖(葡萄糖和半乳糖)成為低聚半乳糖分離純化研究的主要難點(diǎn)和瓶頸[32]。據(jù)報(bào)道,目前低聚半乳糖的純化方法有色譜分離法、膜分離法、酶法和選擇性發(fā)酵法等[51]。

色譜分離法是依據(jù)待分離物料各組分在固定相與流動(dòng)相間結(jié)合力不同,被先后分離出來(lái),其中最常用于分離糖類物質(zhì)的是離子交換樹脂[52]。李良玉等[53]研究人員用自制的模擬移動(dòng)色譜和順序式模擬移動(dòng)色譜設(shè)備分別純化了低聚半乳糖粗品,得到了較好的分離效果,通過對(duì)比分析,采用順序式模擬移動(dòng)色譜得到的效果更好,在進(jìn)料折光60%,柱溫60 ℃,進(jìn)料量467 mL/h,進(jìn)水量722.4 mL/h的實(shí)驗(yàn)條件下,低聚半乳糖收率為91.3%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.1%。Wisniewski等[54]報(bào)道利用模擬移動(dòng)床(SMB)技術(shù)能夠獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%的低聚半乳糖。膜分離法則是依據(jù)濾膜孔徑不同,使得小分子物質(zhì)通過孔徑,而大分子物質(zhì)被截流,從而將不同分子大小的組分分離,其中超濾及納濾常被應(yīng)用于功能性多聚糖的分離純化[55]。Feng等[56]用截留相對(duì)分子質(zhì)量Mw為800～1 000 Da的NF-3膜對(duì)低聚半乳糖粗產(chǎn)品進(jìn)行純化,其中單糖和乳糖的脫除率分別為90.5%,52.5%,低聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.5%(為粗產(chǎn)品的1.5倍),寡糖得率為70%。Goulas等[57]利用2種不對(duì)稱的醋酸纖維素膜(NF-CA-50和UF-CA-1)將低聚半乳糖粗產(chǎn)品進(jìn)行連續(xù)過濾透析后,低聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到98%。由于低聚半乳糖與污染物(主要是乳糖和單糖)之間的分子質(zhì)量大小相近,因此通過膜分級(jí)分離是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。有效去除單糖雖然是一個(gè)合理的方法,但是去除乳糖將需要酶促預(yù)水解步驟,從而導(dǎo)致生產(chǎn)率降低和成本增加。膜分離法雖然選擇性好、無(wú)污染和能耗低,但設(shè)備昂貴且需要經(jīng)常清洗和維護(hù),否則可能會(huì)造成膜污染,因此限制了該方法在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。酶法是通過加入酶制劑選擇性去除相應(yīng)的單糖和乳糖。這種方法的酶具有專一性,純化效果較好,產(chǎn)品純度高的優(yōu)點(diǎn)。Maischberger等[58]利用源自羅氏鏈球菌特異性較強(qiáng)的纖維二糖脫氫酶對(duì)低聚半乳糖粗產(chǎn)品進(jìn)行純化,而后結(jié)合色譜步驟去除離子和單糖,得到較為純凈的低聚半乳糖,單糖和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3%,低聚半乳糖的收率達(dá)到60.3%。酶法純化工藝因酶制劑穩(wěn)定性差、回收率差和價(jià)格高等因素導(dǎo)致成本較高,且隨著酶解反應(yīng)的發(fā)生,反應(yīng)體系的pH會(huì)逐漸降低,也會(huì)影響酶的活性,因此限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

除以上幾種分離純化方法,基于微生物選擇性發(fā)酵特性的發(fā)酵分離方法也能有效提高低聚半乳糖的純化效果,也是近期國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。例如,使用克魯維酵母和啤酒酵母菌株,通過酵母發(fā)酵(生物轉(zhuǎn)化)從原始低聚半乳糖的轉(zhuǎn)化液中選擇性去除可代謝的糖類(葡萄糖、半乳糖和乳糖),從而實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖純化的目的。Rengarajan等[59]對(duì)釀酒酵母(S.cerevisiae)選擇性發(fā)酵連續(xù)生產(chǎn)高純度異麥芽低聚糖(IMOS)進(jìn)行了研究,將低質(zhì)量分?jǐn)?shù)IMOS(67%)與分離菌株釀酒酵母(4%)在3 L生物反應(yīng)器中孵育1 h,結(jié)合微濾膜循環(huán)獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)IMOS,產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)>91%,收率79%,最高時(shí)空產(chǎn)率為198.79 g/(L·h)。Yoon等[60]利用釀酒酵母對(duì)低聚半乳糖轉(zhuǎn)化母液進(jìn)行了選擇性發(fā)酵特性的研究,研究發(fā)現(xiàn):厭氧糖酵解24 h可以特異性地去除低聚半乳糖轉(zhuǎn)化母液中單糖(葡萄糖和半乳糖)質(zhì)量濃度,提高產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)。此類選擇性發(fā)酵分離方法雖可獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的產(chǎn)物,但選擇性發(fā)酵(生物轉(zhuǎn)化)也有其缺點(diǎn),發(fā)酵過程需要較高的菌體量,且需要對(duì)未純化的低聚半乳糖進(jìn)行稀釋,而代謝副產(chǎn)物如乙醇、乙酸和甘油等的產(chǎn)生亦會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和產(chǎn)量[5]。

4 低聚半乳糖工業(yè)化生產(chǎn)現(xiàn)狀

低聚半乳糖的工業(yè)化起源于日本[4],隨后歐洲和美國(guó)也相繼開始了低聚半乳糖的商業(yè)化生產(chǎn),我國(guó)的低聚半乳糖工業(yè)則起步較晚?，F(xiàn)如今,已有國(guó)內(nèi)外多個(gè)公司將目光瞄準(zhǔn)了低聚半乳糖產(chǎn)業(yè),進(jìn)行低聚半乳糖商業(yè)化生產(chǎn)的廠家主要有日本養(yǎng)樂多株式會(huì)社、日本日新糖制造有限公司、荷蘭茲沃爾弗里斯蘭有限公司、美國(guó)伊利諾伊州玉米制品國(guó)際公司、中國(guó)保齡寶生物以及量子高科生物股份有限公司等[23],市場(chǎng)上主要的低聚半乳糖產(chǎn)品如表3所示。國(guó)內(nèi)外低聚半乳糖工業(yè)化生產(chǎn)雖然已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,但低聚半乳糖工業(yè)仍然存在一些亟待解決的問題,如低聚半乳糖分離純化困難(目前,國(guó)內(nèi)市場(chǎng)大多數(shù)國(guó)產(chǎn)低聚半乳糖產(chǎn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于57%),以及現(xiàn)有的商品化β-半乳糖苷酶活性不高(GOS產(chǎn)率約為30%～40%)。因此,開發(fā)高效的低聚半乳糖分離純化方法和尋找新的性能優(yōu)良的β-半乳糖苷酶將是未來(lái)低聚半乳糖工業(yè)化研究的主要方向,具有較高的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景[61]。

表3 部分商品化GOS產(chǎn)品信息匯總

5 結(jié) 論

通過上述分析,低聚半乳糖因其出色的理化性質(zhì)和優(yōu)良的生理功效已廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉、發(fā)酵乳、糖果產(chǎn)品、烘焙食品、家畜飼料和寵物食品等產(chǎn)業(yè),具有持久的發(fā)展?jié)摿?。伴隨生物催化法制備低聚半乳糖研究的不斷深入,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在生物催化制備低聚半乳糖的工具酶源開發(fā)、催化制備工藝開發(fā)和低聚半乳糖的分離純化方法研發(fā)等方面進(jìn)行了諸多嘗試,且取得了不小的進(jìn)步,但研究成果仍然不能較好地滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要及日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求。目前,從生產(chǎn)工藝上來(lái)看,低聚半乳糖產(chǎn)率不高、分離純化困難仍是制約低聚半乳糖工業(yè)發(fā)展的重要因素。除此之外,我國(guó)低聚半乳糖生產(chǎn)工業(yè)還存在諸如催化劑來(lái)源單一、產(chǎn)品純度低和檢測(cè)手段匱乏等問題需要加以改進(jìn)。相信隨著國(guó)內(nèi)研究人員在以上研究方向上不斷努力,突破生物催化法制備低聚半乳糖的難點(diǎn)和瓶頸問題,將逐漸補(bǔ)足技術(shù)發(fā)展中的短板,實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖的生物催化法高效制備,使低聚半乳糖作為益生元逐漸深入國(guó)人的日常生活,服務(wù)于我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè),產(chǎn)生相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。