乳腺腫瘤患者血清miRNA-222、miRNA-21檢測的臨床意義

(1. 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽省蕪湖市第一人民醫(yī)院檢驗科，安徽 蕪湖 241002)

在女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率和病死率分別居第1、2位[1]。近年來我國女性乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，乳腺癌易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠處轉(zhuǎn)移會嚴重降低乳腺癌患者的生活質(zhì)量，是乳腺癌患者病死的主要原因[2-4]。乳腺癌如在原位階段就被發(fā)現(xiàn)并予以切除，則預(yù)后較佳，可完全治愈，而轉(zhuǎn)移性乳腺癌通常治療效果不佳，預(yù)后差[5]。因此，對乳腺癌應(yīng)該早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。目前，在臨床上乳腺鉬靶攝影成像對乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷仍具有重要價值[6]。乳腺鉬靶攝影成像等影像學檢查方法雖應(yīng)用廣泛，但其需要依靠特定的直接或間接征象方能對乳腺癌作出診斷。

微小RNA(miRNA)，一種長度大約為19-25nt非編碼RNA，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，可起著抑癌基因或癌基因的作用[7-8]。近來越來越多的研究[9-11]也發(fā)現(xiàn)異常的miRNA表達可以啟動腫瘤的細胞增殖、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移擴散等發(fā)生發(fā)展過程。因此，miRNA被認為是一種有前途的生物標志物，用于癌癥發(fā)生發(fā)展的各個階段的監(jiān)測。

miRNA可穩(wěn)定存在于血清、血漿中，能夠抵抗核糖核酸酶和pH值波動并且有較長的儲存期和多個冷凍、解凍周期[12]。本研究主要通過檢測乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者以及健康體檢者血清miRNA-222、miRNA-21水平，探討其在乳腺腫瘤尤其是乳腺癌診療中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年7月—2019年12月就診于皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院的35例首診乳腺癌患者(按照國際抗癌協(xié)會分類標準：Ⅰ級2例，Ⅱ級30例，Ⅲ級3例；Ⅰ期5例，Ⅱ期28例，Ⅲ期2例；N022例，N113例)和32例乳腺良性腫瘤患者(纖維腺瘤20例，乳頭狀瘤8例，良性葉狀瘤4例)。所有患者在采集標本前均未受到放療、化療等干預(yù)。同時，選取了本院體檢中心的35名健康體檢者作為對照組。所有受試者均為女性，年齡35～70歲，平均(54.00±2.20)歲。各位受試者均提供了書面同意，且研究方案已獲皖南醫(yī)學院機構(gòu)倫理審查委員會批準。乳腺腫瘤患者的診斷及分期均經(jīng)本院病理學確診，并進行了雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)等免疫組化檢測。排除標準：①合并有肝腎功能不全者；②合并有其他腫瘤患者；③合并有造血系統(tǒng)異常及重癥感染者；④依從性差或者有精神疾病患者。

1.2 實驗的主要儀器與試劑 臺式高速冷凍離心機和RNA濃度檢測儀均為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄儀采用的是美國Labnet PCR儀；熒光定量PCR儀為ABI 7500系統(tǒng) (Life Technology，美國) 。血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(版本號：DP171207，目錄號：DP503)、miRNA cDNA合成試劑盒(版本號：KR171206，目錄號：KR211)及miRNA熒光定量PCR試劑盒(版本號：FP180328，目錄號：FP411)均購自天根生化科技(北京)有限公司；miRNA-222和miRNA-21以及內(nèi)參U6的引物均由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清miRNA的提取和分離 miRNA的分子量小，是一種非編碼RNA；加入氯仿使血清中的蛋白質(zhì)變性，高速離心使水相和有機相快速分離，RNA進入水相進而與蛋白質(zhì)分離；無水乙醇可將RNA沉淀到吸附柱內(nèi)，再經(jīng)過多次特殊的漂洗、離心過程，雜質(zhì)可被充分去除，最后用雙蒸水將純凈的RNA從吸附柱中洗脫。

1.3.2 miRNA的逆轉(zhuǎn)錄或cDNA的合成 根據(jù)試劑盒說明書嚴格配制miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系并設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄儀的運行程序，然后進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 RT-PCR檢測目的基因的相對表達水平 miRNA-222上游引物是5′-GTTCGTGGGAGCTACATCTGGC-3′，下游引物是5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；miRNA-21上游引物是5′-TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT-3′，下游引物是5′-CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATT-3′；內(nèi)參U6上游引物是5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物是5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。將混勻的目的基因反應(yīng)液和內(nèi)參反應(yīng)液各加入到3個PCR板孔中，按試劑盒說明書上的PCR 反應(yīng)程序進行擴增。反應(yīng)完畢后拷貝PCR儀的檢測結(jié)果，即目的基因miRNA-222、miRNA-21及內(nèi)參基因U6的Ct值，在軟件Excel中運用 2^( -ΔΔCT)法計算兩種miRNA的相對表達量。

1.4 觀察指標 ER、HER-2、PR陽性陰性判定標準是采用免疫組織化學法(IHC)檢測乳腺癌病灶組織中三種受體陰陽性，ER、PR以細胞核可見棕黃色顆粒為陽性染色， 將>1%陽性細胞數(shù)判定為陽性表達；HER-2以細胞膜可見棕黃色顆粒為陽性染色，將>10%陽性細胞數(shù)判定為陽性表達。而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判定標準則依據(jù)手術(shù)后，對腋窩的淋巴結(jié)進行病理學檢查，若確診為乳腺癌或乳腺惡性腫瘤則為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計處理。三組血清miRNA-222、miRNA-21表達水平的比較是計量資料，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以M(P25～P75)表示，采用非參數(shù)K個獨立樣本Kruskal-WakkisH檢驗，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。將乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組的血清miRNA-222、miRNA-21水平做ROC曲線分析。乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同臨床參數(shù)及免疫組化指標中表達的比較，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，以M(P25～P75)表示，采用2個獨立樣本非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miRNA-222、miRNA-21相對表達量的比較 三組血清miRNA-222、miRNA-21相對表達量比較總體上差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組的miRNA-222相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是乳腺癌組的miRNA-222相對表達量和乳腺良性腫瘤組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，乳腺癌組的miRNA-21相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，乳腺癌組miRNA-21表達量高于乳腺良性腫瘤組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組的miRNA-21與乳腺良性腫瘤組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組血清中的miRNA-222、miRNA-21相對表達量的比較

2.2 血清miRNA-222、miRNA-21檢測對乳腺癌診斷的作用分析 將乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組的血清miRNA-222、miRNA-21水平作ROC曲線分析，miRNA-21的曲線下面積為0.665>0.5，而且P<0.05，說明miRNA-21對于診斷乳腺惡性病變具有顯著的意義，最大約登指數(shù)為0.295，當臨界值為0.693，敏感度為85.71%，特異度為43.75%。miRNA-222的曲線下面積為0.465<0.5，且P>0.05，說明miRNA-222對于診斷乳腺惡性病變不具有統(tǒng)計學意義。見圖1、表2。

圖1 血清miRNA-222、miRNA-21診斷乳腺癌的ROC曲線

表2 血清miRNA-222、miRNA-21診斷乳腺癌的ROC曲線下面積

2.3 乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同臨床參數(shù)及免疫組化指標中的表達對比 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的miRNA-222、miRNA-21表達水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。按照年齡、腫瘤直徑、ER、PR、HER-2分組比較乳腺癌患者的miRNA-222、miRNA-21表達水平，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同臨床參數(shù)及免疫組化指標中的表達對比

3 討論

Esplugas R等[13]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-222在乳腺癌患者放療前的外周血中是過表達的。Chan M等[14]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者腫瘤組織中有20種miRNAs的表達相對于正常組織是失調(diào)的，然而僅有miRNA-21等7種miRNAs的水平在患者腫瘤組織和血清中都是升高的，這表明miRNAs可能被選擇性地釋放到血清中。本文研究結(jié)果提示乳腺癌患者的血清miRNA-222、miRNA-21相對于正常人是過表達的。本研究結(jié)果還顯示乳腺良惡性腫瘤患者組血清miRNA-222相對于對照組均是過表達的，但乳腺良、惡性腫瘤患者組之間的差異不顯著；血清miRNA-21僅在乳腺癌患者組是過表達的，其水平在乳腺良性腫瘤患者組與對照組之間無明顯差異。

為了評估血清miRNA-222、miRNA-21檢測在乳腺癌診斷方面的效能，我們將乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組的血清miRNA-222、miRNA-21水平作ROC曲線分析，結(jié)果提示血清miRNA-21作為診斷乳腺癌的指標，其ROC曲線下面積為0.665，P值為0.020，且當血清miRNA-21的臨界值為0.693時，其敏感度和特異性分別為85.71%、43.75%，這說明血清miRNA-21可以作為乳腺癌監(jiān)測的一個輔助診斷指標，具有一定的參考價值；而血清miRNA-222的ROC曲線下面積僅為0.465，P值>0.05，說明對早期乳腺癌的監(jiān)測缺乏價值。

近來研究表明[15-19]：miRNA-222、miRNA-21可以促進乳腺腫瘤的生長并抑制細胞凋亡，還可以調(diào)控乳腺癌細胞的運動進而促進其遷移和侵襲。本研究按照有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將乳腺癌患者的血清miRNA水平分為轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，經(jīng)過統(tǒng)計分析得出：乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會影響其血清miRNA-222及miRNA-21的相對表達水平。這提示miRNA-222及miRNA-21可能參與介導乳腺癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。

本研究結(jié)果揭示：miRNA-222、miRNA-21在乳腺癌患者的血清中是過表達的，均明顯高于正常人；血清miRNA-21具有較好的特異性，有望成為乳腺癌診斷的生物學標記物，而且乳腺癌患者血清miRNA-222及miRNA-21水平可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。所有相關(guān)研究結(jié)果表明miRNA可作為一種新型的生物學標記物，在針對腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等現(xiàn)象發(fā)生的研究中具有一定的應(yīng)用價值和廣泛的應(yīng)用前景。