HMGB1調(diào)控重癥急性胰腺炎脾淋巴細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上常見的急腹癥，該病起病急，并發(fā)癥多，病情重，病死率高達(dá)20%，部分病人可遺留不同程度的胰腺功能不全[1-2]。近年來，雖然SAP在診療措施方面取得了很大進(jìn)展，然而其病死率仍居高不下，與其發(fā)病機(jī)制不明有關(guān)。既往研究認(rèn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征是SAP死亡的主要原因，但近年研究發(fā)現(xiàn)SAP淋巴細(xì)胞過度凋亡，引起免疫抑制和感染并發(fā)癥的發(fā)生，是導(dǎo)致患者病情加重及死亡的重要原因[3-4]。然而SAP淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein 1，HMGB1)是一個經(jīng)典的損傷相關(guān)模式分子，可由細(xì)胞主動分泌或被動釋放，通過與一系列分子相互作用而引起機(jī)體生理或病理改變。HMGB1表達(dá)增加可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，與多囊卵巢綜合征內(nèi)分泌失調(diào)、認(rèn)知功能障礙、SAP相關(guān)性心肌損傷等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]，然而HMGB1在SAP淋巴細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。本研究通過腹腔注射雨蛙素和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)SAP小鼠模型，檢測HMGB1表達(dá)情況，分析HMGB1表達(dá)與脾淋巴細(xì)胞凋亡率及凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性，探討HMGB1與SAP脾淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雄性SPF級BALB/C小鼠30只，體重25～30 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司；雨蛙素(C9026，Sigma)；LPS(L2880，Sigma)；抗HMGB1多克隆抗體(ST326052233)；脂肪酶和淀粉酶的測定試劑盒購自南京建成公司；HMGB1 ELISA試劑盒(CSB-E08225m，華美)；Caspase-3 ELISA試劑盒(CSB-E08858m，華美)；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(AP-MN-MS-RNA-50G)；FastKing RT Kit(With gDNase)(KR116-02，Tiangen)；SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(FP205-02，Tiangen)；PCR引物合成(上海捷瑞)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(556547，BD公司)；紅細(xì)胞裂解液(R1010，Solarbio)。

1.2 動物分組與建模 采取隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、SAP組、SAP+Ab組。小鼠在試驗(yàn)前均給予禁食12 h和自由飲水處理。對照組10只，給予腹腔注射0.9%的氯化鈉水溶液。SAP組10只，采用腹腔注射雨蛙素+LPS[雨蛙素50 μg/(kg·h)，共13次，在注射雨蛙素后，立即向腹腔內(nèi)注射LPS，LPS給藥劑量30 mg/kg]。SAP+Ab組10只，于SAP造模后腹腔注射HMGB1特異性抑制劑抗-HMGB1抗體10 mg/kg。觀察各組小鼠的生理活動、生命征、死亡情況。造模后12 h處死取材。

1.3 標(biāo)本采集及檢測 水合氯醛麻醉小鼠后行眼眶采血，待血液靜置凝固后于4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清液，EP管分裝后置于-80℃冰箱保存用于脂肪酶、淀粉酶和ELISA檢測。采血后將以頸椎脫臼法處死小鼠，取出脾臟置于1640培養(yǎng)基中，用于分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測及PCR檢測。取胰腺組織放入裝有10%甲醛溶液的50 ml離心管中固定，隨后送病理科做HE染色。

1.3.1 HE染色 胰腺組織先用10%甲醛進(jìn)行固定過夜，然后進(jìn)行脫水，用石蠟包埋處理后即可進(jìn)行石蠟切片，蘇木精和伊紅染色。請2位資深病理科醫(yī)生雙盲閱片，根據(jù)改良的Schmidt法[8]和Pozsar法[9]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胰腺的損傷評分：①水腫： 0=無水腫，1=葉間隙輕度增寬，2=葉間隙重度增寬，3=腺泡間隙增寬，4=細(xì)胞間隙增寬；②壞死： 0=無，1=壞死面積為1%～10%，2=壞死面積為11%～20%，3=壞死面積為21%～30%，4=壞死面積>30% ；③出血： 0=無，1=有；④炎性細(xì)胞浸潤(計(jì)數(shù)高倍鏡視野下血管周圍或小葉內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量)：0=0～1個，1=2～10個，2=11～20個，3=21～30個，4= 30個以上或出現(xiàn)微膿腫。每張切片隨機(jī)選5個高倍視野計(jì)數(shù)。

1.3.2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的檢測 從-80℃冰箱取出備用的小鼠血清并適當(dāng)稀釋后，根據(jù)試劑盒使用說明書嚴(yán)格操作，用分光光度計(jì)測定各組的OD值并計(jì)算出各組血清中淀粉酶濃度(淀粉-碘比色法)和脂肪酶濃度(比色法)。

1.3.3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3的檢測 從-80℃冰箱取出各組備用的小鼠血清，采用ELISA試劑盒說明書的方法，用ELISA試劑盒檢測HMGB1和Caspase-3的表達(dá)水平。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 取小鼠脾臟，200目尼龍膜研磨，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后收集淋巴細(xì)胞；將上述淋巴細(xì)胞以PBS配成濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液，用移液槍吸取上述細(xì)胞懸液200 μl，加入AnnexinV-FITC、PI各10 μl，置于室溫、黑暗的環(huán)境中孵育15 min，加入1×buffer 400 μl，立即上流式細(xì)胞儀去檢測脾淋巴細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 脾淋巴細(xì)胞RT-PCR檢測 檢測按照說明書所述步驟提取各實(shí)驗(yàn)組脾淋巴細(xì)胞的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)(TU-1810PC，北京普析)測定OD260、OD280及濃度。取1 μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按說明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA單鏈，并保存在-80℃。應(yīng)用SYBR Green Master Mix擴(kuò)增上述cDNA，使用LightCycler○R96 qPCR儀進(jìn)行檢測。HMG-B1引物序列：上游5′-AGGCGAGCATCCTGGCTTATC-3′，下游5′-CCTTCAGCTTGGCAGCTTTCT-3′。Caspase-3引物的序列：上游5′-CTGACTGGAAAGCCGAAACTC-3′，下游5′-CCCACTGTCTGTCTCAATGCC-3′。GAPDH引物的序列：上游5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。記錄GAPDH、HMGB1、Caspase-3的Ct值。所有樣品均設(shè)3個復(fù)孔，取均值并采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胰腺病理評分比較 對照組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)基本完整，部分視野偶見水腫或少許炎性細(xì)胞；SAP組可見胰腺腺泡細(xì)胞大量壞死，腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，部分腺泡呈孤島狀，大部分胰腺腺葉正常結(jié)構(gòu)消失，腺泡的間隔以及小葉的間隔均變寬，間質(zhì)內(nèi)可見紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞大量滲出。與SAP組相比，SAP+Ab組胰腺的壞死、水腫、炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出顯著減少。根據(jù)改良的Schmidt法和Pozsar法評分標(biāo)準(zhǔn)，與對照組相比，SAP組和SAP+Ab組的胰腺病理組織學(xué)評分均增加；與SAP組相比，SAP+Ab組的胰腺病理組織學(xué)評分降低(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 小鼠胰腺組織病理改變 (HE400×)

表1 小鼠胰腺組織評分比較

2.2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平比較 與對照組相比，SAP組和SAP+Ab組血清中的淀粉酶水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SAP組相比，SAP+Ab組血清中的淀粉酶水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，SAP組和SAP+Ab組血清中的脂肪酶水平均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SAP組相比，SAP+Ab組血清中的脂肪酶水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平比較 單位：U/L

2.3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3水平比較 與對照組相比，SAP組和SAP+Ab組血清HMGB1水平均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SAP組相比，SAP+Ab組血清HMGB1水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，SAP組和SAP+Ab組血清Caspase-3水平均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SAP組相比，SAP+Ab組血清Caspase-3水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，以Annexin-V FITC、PI分別為散點(diǎn)圖的橫縱坐標(biāo)。圖中左下象限Q4(FITC-/PI-)顯示活細(xì)胞；右上象限Q2(FITC+/PI+)代表壞死細(xì)胞；而右下象限Q3(FITC+/PI-)代表早期凋亡細(xì)胞。與對照

表3 小鼠血清HMGB1和Caspase-3水平比較 單位：ng/ml

組對比，SAP組和SAP+Ab組脾淋巴細(xì)胞凋亡率均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與SAP組相比，SAP+Ab組脾淋巴細(xì)胞凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率比較

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率

2.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量 與對照組對比，SAP組和SAP+Ab組HMGB1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；與SAP組比較，SAP+Ab組HMGB1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。與對照組對比，SAP組和SAP+Ab組Caspase-3 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與SAP組對比，SAP+Ab組Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3。

HMGB1 mRNA表達(dá)水平

Caspase-3 mRNA表達(dá)水平

2.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平與脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平的相關(guān)性 SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平與脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈正相關(guān)(r=0.9793、r=0.9405、r=0.9191，r=0.9716、r=0.9653、r=0.9705，P<0.05)，隨著HMGB1 mRNA和血清HMGB1表達(dá)水平增高，脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA和血清Caspase-3升高，見圖4。

圖4 SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平與各指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

SAP早期表現(xiàn)為強(qiáng)烈的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，后期常并發(fā)感染以及多器官功能障礙(multiple organ dysfunction，MODS)[10]。外周血淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成成分。淋巴細(xì)胞過度凋亡引起免疫抑制是SAP后期患者感染及死亡的重要原因[4]。本課題組的前期研究也證實(shí)了淋巴細(xì)胞Fas和Fas配體表達(dá)增加，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞過度凋亡，與SAP嚴(yán)重程度、免疫抑制及繼發(fā)感染等密切相關(guān)[3，11]。

細(xì)胞凋亡也稱Ⅰ型程序性死亡，是細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)生的系統(tǒng)且協(xié)調(diào)的死亡過程[12]。細(xì)胞凋亡依據(jù)其發(fā)生過程是否依賴蛋白酶Caspases分為Caspases依賴性細(xì)胞凋亡和Caspases非依賴性細(xì)胞凋亡兩種。Caspase依賴性細(xì)胞凋亡最終都可導(dǎo)致Caspase-3酶原的激活，其與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段的開始密切相關(guān)[13]。HMGB1是一種在真核生物中普遍存在的、多功能的、與DNA結(jié)合的非組蛋白。HMGB1在細(xì)胞外主要是通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體、Toll樣受體4和CXC基序趨化因子受體4相互作用而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究表明HMGB1與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[5-7]。Zhu HL等[5]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過抑制lncRNA ZFAS1/miR129/ HMGB1信號軸可以減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而減輕多囊卵巢綜合征內(nèi)分泌功能混亂。Shi Y等[7]也證實(shí)了HMGB1也可通過其他途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，他們在共培養(yǎng)Transwell系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)HMGB1通過減少PI3K/Akt/Gsk3β信號通路中的Akt和Gsk3β的磷酸化引起海馬神經(jīng)元凋亡增加和認(rèn)知功能障礙。Wen Y等[6]在SAP大鼠中觀察到HMGB1可促進(jìn)心肌細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表達(dá)來增加活性氧的釋放，最終導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，SAP大鼠的心肌細(xì)胞凋亡增加，加重心肌損傷。上述研究表明HMGB1可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。周淼等[14]采用胰膽管逆行注射5%的?；悄懰徕c建立SAP大鼠模型，發(fā)現(xiàn)SAP組大鼠回腸組織中的HMGB1 mRNA較對照組顯著升高、同時T淋巴細(xì)胞凋亡率也比對照組大鼠顯著增加，提示HMGB1可能通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞凋亡參與SAP時腸免疫功能障礙的發(fā)生。然而HMGB1對SAP脾淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示SAP組小鼠胰腺腺泡細(xì)胞大量壞死，腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，并且有大量紅細(xì)胞和白細(xì)胞滲出；同時觀察到血清淀粉酶和脂肪酶顯著升高，表明腹腔注射雨蛙素和LPS成功復(fù)制小鼠SAP模型。本研究發(fā)現(xiàn)SAP組脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA和血清HMGB1表達(dá)水平較對照組顯著增加。同時，SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡率及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平和血清Caspase-3表達(dá)水平均較對照組顯著升高，這與我們課題組前期研究證實(shí)了SAP中脾淋巴細(xì)胞凋亡增加的結(jié)果一致[15]。提示SAP脾淋巴細(xì)胞凋亡增加可能與HMGB1高表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步探討HMGB1基因表達(dá)對脾淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，我們將SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1表達(dá)水平與脾淋巴細(xì)胞凋亡率、Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1水平與脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈正相關(guān)，隨著HMGB1 mRNA和血清HMGB1表達(dá)水平增高，脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA和血清Caspase-3表達(dá)水平升高。提示HMGB1對SAP小鼠脾淋巴細(xì)胞的凋亡起正向調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步證實(shí)HMGB1對脾淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，我們設(shè)置了SAP+Ab組，在SAP小鼠造模后予抗-HMGB1抗體干預(yù)，抑制HMGB1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脾淋巴細(xì)胞凋亡率、Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3表達(dá)水平表達(dá)降低，證明抑制HMGB1的表達(dá)可減輕脾淋巴細(xì)胞凋亡，從而改善機(jī)體的免疫功能。然而在SAP中HMGB1對脾淋巴細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制有待于未來進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)SAP組小鼠脾淋巴細(xì)胞HMGB1 mRNA、血清HMGB1表達(dá)顯著增加，脾淋巴細(xì)胞凋亡率、Caspase-3 mRNA及血清Caspase-3表達(dá)水平顯著升高，HMGB1mRNA、血清HMGB1水平與脾淋巴細(xì)胞凋亡率、脾淋巴細(xì)胞Caspase-3 mRNA、血清Caspase-3水平呈顯著正相關(guān)，提示HMGB1對SAP小鼠脾淋巴細(xì)胞凋亡起重要的調(diào)節(jié)作用，可能是由于HMGB1高表達(dá)，引起淋巴細(xì)胞過度凋亡，導(dǎo)致SAP免疫抑制的發(fā)生。這表明HMGB1可能是一個潛在的治療靶點(diǎn)，通過阻斷HMGB1表達(dá)將可能減少淋巴細(xì)胞凋亡，從而改善SAP患者的免疫功能。