扣囊復(fù)膜酵母在紅棗酒中的應(yīng)用

雷炎，劉夢琦，易秦振，單春會(huì)，侯強(qiáng)川，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）又稱扣囊復(fù)膜孢酵母，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）中的酵母科（Saccharomycopsidaceae），通過多極出芽和形成菌絲體進(jìn)行增殖，是一類產(chǎn)子囊孢子的二形態(tài)酵母[1]。由于具有高產(chǎn)淀粉酶[2]、酸性蛋白酶[3]和β-葡萄糖苷酶[4]的特性，S.fibuligera 可利用蔗糖、纖維二糖和可溶性淀粉等碳水化合物產(chǎn)酒精，加之具有一定的產(chǎn)酯能力[5]，因而被認(rèn)為在釀酒工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。研究表明，米酒曲[6-7]、紹興黃酒酒藥[8]及濃香型、醬香型和清香型白酒酒曲中[9]蘊(yùn)含了豐富的S.fibuligera 菌株資源，因而從酒曲中進(jìn)行S.fibuligera 菌株的分離具有較大的可行性[10]。不同地域來源的同種微生物菌株，其遺傳多樣性和發(fā)酵特性均存在較大差異[11]。作為中國地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)品，東柳醪糟以糯米為原料使用米酒曲發(fā)酵而成，釀造歷史悠久且頗具地方特色，因而從其酒曲中進(jìn)行S.fibuligera 的分離具有較強(qiáng)的可操作性。

作為發(fā)酵果酒，紅棗酒是以紅棗為原料，通過酵母菌的代謝將自身含有的糖轉(zhuǎn)化為酒精，因具有濃郁的紅棗果香和清爽的口感而深受消費(fèi)者喜愛[12]。和東芹研究發(fā)現(xiàn)使用S. fibuligera E9802 釀造的紅棗酒棗香突出、酒體豐滿且風(fēng)味良好[13]，因而將S.fibuligera 用于紅棗酒的釀造具有一定可行性。色度儀[14]、電子舌[15]和電子鼻[16]等測試技術(shù)的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了食品色澤、滋味和風(fēng)味品質(zhì)的數(shù)字化評(píng)價(jià)，具有對(duì)研究人員專業(yè)知識(shí)要求低和結(jié)果受主觀因素影響小的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品的品質(zhì)評(píng)價(jià)中。

采用純培養(yǎng)技術(shù)，本研究擬從四川省達(dá)州市大竹縣的東柳米酒曲中進(jìn)行S.fibuligera 菌株的分離，并從理化指標(biāo)、色澤、風(fēng)味和滋味等維度對(duì)分離株釀造紅棗酒的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，在進(jìn)一步論證S.fibuligera 用于紅棗酒釀造可行性的同時(shí)，亦為后續(xù)相關(guān)研究的開展提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

引物M13F（-47）/M13R（-48）、NS1/NL4：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；Axygen PCR 清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；DL15000 Marker、DL2000 Marker、PCR buffer、rTaq DNA 聚合酶、pMD18-T 克隆載體：寶生物工程（大連）有限公司；駿棗（Jun jujube）：新疆維吾爾自治區(qū)石河子市；白砂糖：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、酵母粉麥芽糖（YM）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；偏重亞硫酸鉀：意大利ESSECO公司；果膠酶（50 000U/g）：和氏璧生物科技有限公司；酒石酸（食品級(jí)）：湖北糖柜食品有限公司；電子舌配套溶液：日本INSENT 公司。

HR40-ⅡB2 型生物安全柜：青島海爾股份有限公司；CR21N 高速離心機(jī)：日本日立公司；PTC-100PCR儀：美國Bio-Rad 公司；LHR-150 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；9231 破壁榨汁機(jī)：奧克斯集團(tuán)有限公司；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FCH6-20 智能高低循環(huán)水器：山東海能科學(xué)儀器有限公司；Abbemat350 全自動(dòng)折光儀：奧地利安東帕公司；UltraScan PRO 色度儀：美國HunterLab 公司；PEN3 電子鼻：德國Airsense 公司；SA-402B 電子舌：日本INSENT 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒曲樣品的采集及酵母菌的分離鑒定

從四川省達(dá)州市大竹縣東柳鄉(xiāng)采集10 個(gè)米酒曲樣品，使用研缽將其碾碎后進(jìn)行倍比稀釋并涂布于PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h 挑選具有酵母菌菌落特征的菌株分離純化后備用[17]。參照趙慧君的方法，使用消解酶-氯化芐法進(jìn)行DNA 提取和26S rDNA 擴(kuò)增[18]，經(jīng)清潔、連接和轉(zhuǎn)化后的擴(kuò)增子委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序，反饋回的序列在Gen－Bank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 同源性比對(duì)，進(jìn)而明確其分類學(xué)地位。切除引物的序列，提交至NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）公開并獲得GenBank 登錄號(hào)。

1.2.2 紅棗酒的制備

去核駿棗以1∶5 的質(zhì)量比加入去離子水中，同時(shí)加入總重0.006%的偏重亞硫酸鉀，置于破壁榨汁機(jī)打漿30 s。漿液中加入總重0.3%的果膠酶45 ℃酶解1 h后依次使用蔗糖調(diào)節(jié)可溶性固形物至22%，并滴加酒石酸調(diào)pH 值至3.9[19]。紅棗漿分裝于1 L 玻璃發(fā)酵罐中，按照5×107CFU/mL 漿液的比例接入1.2.1 中分離的S.fibuligera，22 ℃恒溫發(fā)酵。為對(duì)各菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行對(duì)比，若有1 個(gè)樣品的糖濃度72 h 內(nèi)保持不變，則停止所有樣品的發(fā)酵，漿液4 層紗布過濾后，4 ℃8 000 r/min 離心10 min，濾液用于后續(xù)各指標(biāo)檢測。

1.2.3 紅棗酒理化性質(zhì)的測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計(jì)法對(duì)紅棗酒酒精含量進(jìn)行測定。使用全自動(dòng)折光儀對(duì)紅棗酒的可溶性固形物含量進(jìn)行測定。

1.2.4 紅棗酒色度的測定

參照葛東穎的方法[20]，將樣品置于50 mm×10 mm×50 mm 石英比色皿中，選擇透射模式進(jìn)行測定，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.5 紅棗酒風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參照周書楠的方法[21]，取15 mL 紅棗酒于頂空瓶中，55 ℃水浴10 min 后室溫（25 ℃左右）平衡10 min，使用PEN3 電子鼻進(jìn)行測試。PEN3 電子鼻配有10 套傳感器，但由于傳感器W5S、W6S、W1S 和W1W 主要用于環(huán)境樣品中氮氧化物、氫氣、甲烷和萜類物質(zhì)的檢測，上述化合物在紅棗酒中不存在，故而本研究僅使用其他6 組傳感器。

1.2.6 紅棗酒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

參照潘婷的方法[22]，取100 mL 紅棗酒均分于2 個(gè)樣品杯中，使用SA402B 電子舌對(duì)其酸味、苦味、澀味、咸味和鮮味等5 個(gè)基本味和后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）等3 個(gè)回味進(jìn)行測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

基于鄰接法（neighbor-joining，JN）使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；基于主成分分析（principal component analysis，PCA）使用SAS8.0 軟件對(duì)紅棗酒品質(zhì)進(jìn)行整體評(píng)價(jià)；使用Origin 2017 繪制其他圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲中酵母菌26S rDNA 同源性分析

本研究從10 個(gè)米酒曲樣品中分離出24 株疑似酵母菌的菌株，在對(duì)其26S rDNA 序列進(jìn)行拼接和同源性比對(duì)的基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1 所示，其中樹枝節(jié)點(diǎn)值是檢驗(yàn)置信值，樹枝長度代表菌株差異程度。

圖1 基于26S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 26S rDNA gene

如圖1 所示，HBUAS61134 等16 株菌被鑒定為S. fibuligera （扣囊復(fù)膜酵母），HBUAS61142 和HBUAS61144 被鑒定為Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母），HBUAS61131 和HBUAS61133 被鑒定為Wickerhamomyces anomalus （異常威克漢姆酵母），HBUAS61147 被鑒定為Candida glabrata（光滑念球菌），HBUAS61159 被鑒定為C. tropicalis（熱帶念球菌），HBUAS61143 被鑒定為Pichia kudriavzevii（畢赤酵母），HBUAS61139 被鑒定為Cyberlindnera fabianii（費(fèi)比恩塞伯林德納氏酵母）。酵母菌種屬的構(gòu)成比例如圖2 所示。

圖2 不同酵母菌類群相對(duì)含量的餅圖Fig.2 Pie chart of the relative contents of different yeast groups

由圖2 可知，鑒定為S.fibuligera 的菌株占總分離株的66.67%，S.cerevisiae 和W.anomalus 均占總分離菌株的8.33%，C. glabrata、C. tropicalis、P. kudriavzevii和C.fabianii 均占總分離菌株的4.17%。由此可見，S.fibuligera 為東柳米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌。

2.2 紅棗酒理化指標(biāo)和色澤的評(píng)價(jià)

本研究使用16 株S.fibuligera 分別進(jìn)行了紅棗酒的制備。釀造好的紅棗酒顏色呈棗紅色，具有較高的透明度和澄清度，酒香味濃郁，紅棗特有風(fēng)味突出，入口后部分樣品酒體協(xié)調(diào)且純正無雜，但部分樣品口感偏酸且苦味較重。因感官鑒評(píng)方法對(duì)評(píng)價(jià)人員專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求均較高，為保證結(jié)果的可靠性，本研究使用色度儀、電子鼻和電子舌等設(shè)備對(duì)紅棗酒各指標(biāo)進(jìn)行了數(shù)字化評(píng)價(jià)，其酒精度、可溶性固形物含量和色度指標(biāo)如表1 所示。

表1 紅棗酒理化和色度指標(biāo)分析（n=16）Table 1 Analysis of physic-chemical and chroma indexes of jujube wine（n=16）

由表1 可知，16 個(gè)紅棗酒樣品的酒精度在8.1%vol ～11.9%vol，可溶性固形物含量在7.59%～17.21%，明度值在65.31～78.73，紅綠值在7.53～14.77，黃藍(lán)值在66.64～76.33，顏色整體偏紅偏黃。由此可見，不同酵母菌分離株在紅棗酒中對(duì)糖的利用和產(chǎn)酒精的能力不同。

2.3 基于電子鼻技術(shù)紅棗酒風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

基于電子鼻技術(shù)紅棗酒揮發(fā)性物質(zhì)的分析結(jié)果如表2 所示。

表2 基于電子鼻技術(shù)紅棗酒揮發(fā)性物質(zhì)的分析（n=16）Table 2 Analysis of volatile substances in jujube wine by electronic nose（n=16）

由表2 可知，乙醇為紅棗酒揮發(fā)性化合物的主要成分，其次為有機(jī)硫化物和烷烴類化合物，傳感器W2S、W2W 和W3S 在各紅棗酒樣品中和空氣中響應(yīng)值的比值范圍分別在55.68～124.12、3.54～9.19 和2.78～5.77，而對(duì)芳香類物質(zhì)敏感的各傳感器響應(yīng)值比值均較低。

2.4 基于電子舌技術(shù)紅棗酒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

紅棗酒不同滋味指標(biāo)的相對(duì)強(qiáng)度如圖3 所示。

圖3 基于電子舌技術(shù)紅棗酒不同滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的箱型圖（n=16）Fig.3 Box chart of relative intensity of different taste indexes in jujube wine by electronic tongue（n=16）

由圖3 可知，16 個(gè)紅棗酒樣品在酸味指標(biāo)上差異最大，相對(duì)強(qiáng)度的極差值為4.48，在鮮味、咸味和豐度（鮮味的回味）指標(biāo)上的差異較大，極差值分別為2.33、2.11 和1.30。SA402B 電子舌具有較高的靈敏度，若兩個(gè)樣品在某一傳感器上的相對(duì)強(qiáng)度差值小于1.0，雖其存在差異，但通過感官鑒評(píng)的方法不能予以區(qū)分[24]。各樣品在苦味、后味B（苦味的回味）、澀味和后味A（澀味的回味）指標(biāo)上的極差值分別為0.93、0.72、0.60 和0.37，由于極差值均小于1.0，故而其差異不會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成影響。由于紅棗酒在制作過程中不使用熱殺菌，僅通過添加偏重亞硫酸鉀抑制微生物生長，因而紅棗和制作器具自身攜帶的微生物及環(huán)境中的微生物不能被完全殺死，外源接入酵母菌僅使其成為了紅棗酒發(fā)酵過程中的絕對(duì)優(yōu)勢菌株，因而紅棗酒的發(fā)酵是多菌株參與的過程[25]，這可能是導(dǎo)致本研究中紅棗酒在酸味和鮮味等指標(biāo)上存在差異的原因。

2.5 基于主成分分析紅棗酒整體品質(zhì)的評(píng)價(jià)

本研究采用PCA 對(duì)16 個(gè)紅棗酒樣品品質(zhì)進(jìn)行了整體評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19 個(gè)指標(biāo)可劃分為5 個(gè)主成分（principal component，PC），其貢獻(xiàn)率分別為48.36%、15.44%、8.13%、7.61%和5.73%，其中PC1 由澀味、咸味、W1C、W3C、W2S 和W3S 6 個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，PC2 由酸味、鮮味、L*、a*和b*5 個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，PC3 由苦味和豐度（鮮味的回味）構(gòu)成，PC4 由后味B（苦味的回味）、W5C、酒精度和可溶性固形物含量4 個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，PC5由后味A（澀味的回味）和W2W 構(gòu)成。因PC1 貢獻(xiàn)率最高，而PC4 中包含了酒精度和可溶性固形物含量等重要指標(biāo)，故而選擇PC1 和PC4 進(jìn)行因子載荷圖構(gòu)建，如圖4 所示。

圖4 PC1 與PC4 的因子載荷圖Fig.4 Factor loading map of PC1 and PC4

由圖4 可知，PC1 指標(biāo)中W1C、W3C 和澀味分布在X=0 軸的左側(cè)，而W2S、W3S 和咸味分布在X=0 軸的右側(cè)；PC4 指標(biāo)中后味B（苦味的回味）、酒精度和W5C 分布在Y=0 軸的上方，而可溶性固形物分布在Y=0 軸的下方。傳感器W1C、W3C 和W5C 對(duì)紅棗酒中的芳香類揮發(fā)性化合物靈敏，而酒精度的高低可直接反應(yīng)S. fibuligera 在紅棗酒中的發(fā)酵特性，因而上述4 個(gè)指標(biāo)為紅棗酒的特征性指標(biāo)，故在因子得分圖中分布于第二象限的樣品具有較好的品質(zhì)，基于PC1 和PC4 的因子得分圖如圖5 所示。

圖5 PC1 與PC4 因子得分圖Fig.5 Factor score map of PC1 and PC4

由圖5 可知，僅有1 個(gè)樣品分布于因子得分圖第二象限，因而由S.fibuligera HBUAS61136 發(fā)酵的紅棗酒具有良好的風(fēng)味和較高的酒精度，在后續(xù)紅棗酒相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)中該菌株具有一定的應(yīng)用潛力。為了進(jìn)一步篩選出適用于紅棗酒發(fā)酵的酵母菌，在后續(xù)研究中繼續(xù)從不同地區(qū)米酒曲或其他酒曲中分離S.fibuligera 菌株，并探討其單獨(dú)發(fā)酵或與S.cerevisiae 等菌株復(fù)配發(fā)酵，對(duì)推動(dòng)紅棗酒發(fā)酵用發(fā)酵劑的研究具有積極意義。

3 結(jié)論

本研究從中國地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)品東柳醪糟米酒曲中進(jìn)行了S.fibuligera 的分離，同時(shí)對(duì)分離株在紅棗酒中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S.fibuligera 是該地米酒曲中的優(yōu)勢酵母菌，其分離株可用于紅棗酒的釀造。乙醇為紅棗酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，且不同菌株釀造的紅棗酒在酸味、酒精度和可溶性固形物上存在一定的差異，其中S.fibuligera HBUAS61136 釀造的紅棗酒具有較好的風(fēng)味品質(zhì)和較高的酒精度，可用于后續(xù)相關(guān)研究中。